JP2002212103A - ヒト５−ｈｔ１ｄ受容体をコードするｄｎａおよびその使用 - Google Patents

ヒト５−ｈｔ１ｄ受容体をコードするｄｎａおよびその使用

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JP2002212103A JP2001356183A JP2001356183A JP2002212103A JP 2002212103 A JP2002212103 A JP 2002212103A JP 2001356183 A JP2001356183 A JP 2001356183A JP 2001356183 A JP2001356183 A JP 2001356183A JP 2002212103 A JP2002212103 A JP 2002212103A
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リチャード・エル・ウエインシャンク
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】新規な偏頭痛治療薬の提供。 【解決手段】ヒト５−ＨＴ1Dレセプターをコードする単
離された核酸分子、ヒト５−ＨＴ1Dレセプターである単
離された蛋白、ヒト５−ＨＴ1Dレセプターをコードする
単離された核酸分子を包含するベクター、そのようなベ
クターを包含する哺乳動物細胞、ヒト５−ＨＴ1Dレセプ
ターに対する抗体、ヒト５−ＨＴ1Dレセプターをコード
する核酸を検出するために有用な核酸プローブ、ヒト５
−ＨＴ1Dレセプターをコードする核酸のいずれかの配列
に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒト５−
ＨＴ1Dレセプターに関連する薬理化合物、およびＤＮ
Ａ、正常または突然変異ヒト５−ＨＴ1Dレセプターを発
現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。さら
に、ヒト５−ＨＴ1Dレセプターが関与する、リガンド結
合を決定する方法、発現を検出する方法、薬のスクリー
ニング方法、および治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】この出願は、1990年 5月 8日に出願された
米国特許出願第520,716号の一部継続出願であり、その
内容は参考として本出願に組み込まれる。
【０００２】〔発明の背景〕この出願の全体を通して、
括弧内に記載した種々の刊行物が参照される。これら刊
行物の開示は、本発明が属する技術の状況をより完全に
記載するために、その全体が参考として本出願に組み込
まれる。
【０００３】薬理学的研究、並びに最近では遺伝子クロ
ーニングによって、全部ではないにしても、殆どの神経
伝達物質について複数の受容体サブタイプの存在が立証
されてきている。複数の受容体サブタイプの存在は、一
つの神経伝達物質が異なった細胞性応答を引き出すため
の一つの機構を提供する。細胞性応答における多様性
は、個々の受容体サブタイプと、異なったＧタンパクお
よび異なったシグナル系との組み合わせによって達成さ
れる。同一の第二メッセンジャ−系を活性化し又は阻害
する同一のリガンドのための、異なった複数の受容体の
能力によって、更なる融通性が提供される。
【０００４】個々の受容体サブタイプは、多くのリガン
ドを結合するその能力において特徴的な差異を示すが、
異なったリガンド結合特性のための構造的ベースは知ら
れていない。生理学者および薬理学者は、幾つかの受容
体サブタイプについて、特定の生物学的機能または解剖
学的部位を明らかにしようと試みてきたが、これによっ
ては限られた成功しか得られなかった。同様に、これら
受容体が細胞表面を横切って信号を変換する生化学的な
メカニズムは、一つの受容体サブタイプのみを発現する
良好に限定された細胞ポピュレーションを得ることなし
に確認することは困難であった。
【０００５】セロトニン型の全ての受容体はセロトニン
を認識するが、セロトニン受容体の薬理学的に異なる幾
つかのサブタイプが同定され、５−ＨＴX（Ｘはサブタ
イプを示す）の分類名が与えられている。多くの場合、
これらサブタイプは単一の遺伝子生産物に関係してお
り、または関係しているであろうと思われる。しかし、
幾つかの場合においては、単一のサブタイプが幾つかの
異なった受容体タンパク（遺伝子生産物）を含み得る
し、或いは後で示されるように、二つの異なったサブタ
イプが、同一の受容体タンパクの異なった性質（異なっ
た組織環境で発現するときに示される）から生じる。多
くの場合において、異なったセロトニン受容体サブタイ
プは、グアニンヌクレオチド調節（Ｇ）タンパクを介し
てリンクされる異なった第二メッセンジャ経路と結合す
ることが示されている。
【０００６】セロトニン受容体ファミリー内の受容体サ
ブタイプをより完全に特徴付けるための努力において、
数十年に亘り、放射性リガンド濾過結合技術(radioliga
nd filtration binding technique)が用いられている
（Schmidt and Peroutka, FASEB J. 3: 2242 (198
9)）。これら方法を用いて、二つの広い分類のＧタンパ
ク結合セロトニン受容体、即ち、５−ＨＴ1および５−
ＨＴ2が記述されている。これらは、薬剤に対する選択
性において異なっている。５−ＨＴ1受容体はセロトニ
ンに対して（ナノモルの）高い親和性を示し、［3Ｈ］
５−ＨＴでラベルされ得る。５−ＨＴ2受容体はセロト
ニンに対して低い親和性を示すが、ケタンセリン(Ketan
serin)、メスレルギン(Mesulergine)、メテルゴリン(Me
tergoline）およびｄ−ＬＳＩのような拮抗剤に対して
（ナノモルの）高い親和性を有している。
【０００７】５−ＨＴ1受容体クラス内の幾つかのサブ
タイプが、その薬理学的結合特性、第二メッセンジャ結
合および生理学的役割に基づいて区別されている。この
ような一つのサブタイプである５−ＨＴ1Dは、最初は、
ウシ尾状核(bovine caudate)における［3Ｈ］５−ＨＴ
結合部位の特定のタイプとして定義されたものである。
この定義は、単一の精製受容体タンパクまたは単一の遺
伝子生産物の性質に基づいたものではなく、むしろモデ
ル組織における実験的観察に基づくものである。以下に
議論するように、その後の研究によって、このモデル組
織内には複数の受容体タンパク（サブタイプとして知ら
れるもの）が存在し得、その全てが５−ＨＴ1D受容体の
定義に用いられた結合特性に寄与することが示されてい
る。
【０００８】この５−ＨＴ1D受容体サブタイプは、アデ
ニレートサイクラーゼ活性を阻害することが示されてい
る（Schoeffter,P. and Hoyer,D., Naunyn-Schmiedeber
g'sArch. Pharmacol. 340: 285 (1989)）。また、５−
ＨＴ1D受容体サブタイプはモルモット（Waeber,et al.,
Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 340: 479-4
85 (1989)）、ハト（Waeber, 1989）、ブタ（Waeber,et
al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 377:
595-601 (1988)）、子ウシ（Waeber,et al. (1988)）お
よびヒトの脳（Waeber,et al. (1988); Herrick-Davis
and Titeler, J. Neurochem, 50: 1624-1631 (1988)）
においても特徴付けられている。他のセロトニン受容体
サブタイプのうちで、５−ＨＴ1Aおよび５−ＨＴ1B受容
体はアデニレートサイクラーゼを阻害し、５−ＨＴ1Cお
よび５−ＨＴ2受容体はホスホリパーゼＣ経路を活性化
してポリホスホイノシチドの分解を刺激する（Schmidt
and Peroutka, FASEB J. 3: 2242 (1989)）。
【０００９】スマトリプタン（GR43175）の薬理学的活
性、即ち、グラクソ製薬社の開発による新規な抗片頭痛
薬が、５−ＨＴ1D受容体部位にリンクされている（Pero
utkaand McCarthy, EUR.J.Pharmacology 163: 133 (198
9)）。最近、一つの報告によって、子ブタ尾状核(pigle
t caudate)の５−ＨＴ1D結合部位が、スマトリプタン及
び５−カルボキサミドトリプタミン（５−ＣＴ）の結合
親和性に基づいて二つの部位に副分割され得ることが示
された（Sumner and Humphrey, Br.J.Pharmacol. 98: 2
9 (1989)）。これら結合部位の一つはスマトリプタン及
び５−ＣＴに対する低い親和性を有し、ヒト皮質の５−
ＨＴ1E部位に類似しているが（Leonhardt, Herrick-Dav
is and Titeler, J.Neurochem. 53: 465 (1989)）、こ
れら化合物に対する高い親和性をもった結合部位は、古
典的な５−ＨＴ1D受容体およびスマトリプタンの作用部
位に類似している。
【００１０】XiongおよびNelsonによる他の研究（Life
Sci. 45: 1433-1442 (1989)）によって、ウサギ尾状核
における高親和性の［3Ｈ］５−ＨＴ結合部位（５−Ｈ
Ｔ1R結合部位と称される）は、ウシ尾状核において記述
された５−ＨＴ1D結合部位と類似しているが、薬理学的
にはこれと異なることが示された。これらの著者は、ス
ピペロン(spiperone)およびスピリレン(spirilene)の二
つの薬剤が、５−ＨＴ 1R結合部位に対して５−ＨＴ1D受
容体に対するよりも顕著に低い親和性を呈することを示
すデータを提示し、またこれら部位間の結合特性におけ
る幾つかの相違について述べている。これら発見の観点
からウシ尾状核を研究することによって、５−ＨＴ1R結
合部位を提示するウシ尾状核に、５−ＨＴ1D受容体の成
分が存在し得るとの結論が導かれた。或いはまた、著者
は、ウシ尾状核における５−ＨＴ 1D結合部位は、同様の
性質をもった部位の不均一な群であり得ると著者は考え
ている。著者が述べているように、これらの問題を明確
にするためには、更なる仕事が必要であることが明らか
である。
【００１１】最近、Libert,et al.によって、イヌｃＤ
ＮＡライブラリーからＧタンパク結合受容体のための遺
伝子が単離された（Science 244: 569-572, 1989）。こ
の遺伝子はＲＤＣ４と称されるこの遺伝子は著者等によ
って発現されておらず、従って該遺伝子によってコード
されるタンパクの性質は全く特徴付けされていない。こ
のイヌＲＤＣ４遺伝子は本件出願人によって単離および
発現され、５−ＨＴ1D受容体をコードすることが本件出
願人によって決定された（刊行物には未発表である）。
【００１２】これらセロトニン５−ＨＴ1D受容体は、そ
の７−トランスメンブラン形およびＧタンパクとの機能
的リンクによって区別される受容体のファミリーに属す
る。このファミリーにはロドプシンおよび関連オプシン
（Nathans,J. and Hogness,D.S., Cell 34: 807 (198
3)）、α及びβアドレナリン作動性受容体（Dohlman,H.
G.,etal., Biochemistry 26: 2657 (1987)）、ムスカリ
ン様コリン作動性受容体（Bonner,T.I.,et al., Scienc
e 237: 527 (1987)）、サブスタンスＫニューロペプチ
ド受容体（Masu,Y.,et al., Nature 329: 836 (198
7)）、酵母交配因子受容体（Burkholder,A.C. and Hart
well,L.H., Nucl.Acids Res. 13: 8463 (1985); Hagan,
D.C.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83: 1418 (198
6); Nakayama,N.et al., EMBO J. 4: 2643 (1985)）並
びにオンコジェンＣ−マス（Young,et al., Cell 45: 7
11 (1986)）が含まれる。これら受容体の夫々は、グア
ニンヌクレオチド結合性（Ｇ）タンパクとの相互作用に
よって、細胞外信号を変換すると考えられる（Dohlman,
H.G.,et al., Biochemistry 26: 2657 (1987); Dohlma
n,H.G.,et al., Biochemistry 27: 1813 (1988); O'Dow
d,B.F.,et al., Ann.Rev.Neurosci., in press）。
【００１３】〔発明の概要〕本発明は、ヒト５−ＨＴ1D
受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１４】本発明はまた、ヒト５−ＨＴ1D受容体であ
る単離されたタンパクを提供する。
【００１５】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
する単離された核酸分子を具備したベクターを提供す
る。
【００１６】本発明はまた、バクテリア細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞内での発現に適用されるプラスミド
のようなベクターであって、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコ
ードするＤＮＡ分子を具備し、更にバクテリア、酵母ま
たは哺乳動物細胞内での該ＤＮＡの発現に必要な調節要
素を、前記ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分
子に対してその発現を可能とするような位置に具備した
ベクターを提供する。
【００１７】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡ分子を具備した哺乳動物細胞を提供する。
【００１８】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体に結合し
得ることが知られていないリガンドが、ヒト５−ＨＴ1D
受容体に結合できるか否かを決定する方法であって、ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子を有する哺
乳類細胞と前記リガンドとを、５−ＨＴ1D受容体に結合
することが知られているリガンドの結合を可能とする条
件下で接触させることと、５−ＨＴ1D受容体に結合した
リガンドの存在を検出し、これによって該リガンドが５
−ＨＴ1D受容体に結合するか否かを決定することとを具
備した方法を提供する。
【００１９】本発明はまた、薬剤をスクリーニングし、
細胞表面のヒト５−ＨＴ1D受容体と特異的に相互作用し
て結合する薬剤を同定する方法であって、細胞表面のヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子を有する哺
乳動物細胞を複数の薬剤と接触させることと、該哺乳動
物細胞に結合するこれら薬剤を決定し、これにより前記
ヒト５−ＨＴ1D受容体と特異的に相互作用してこれに結
合する薬剤を同定することとを具備した方法を提供す
る。
【００２０】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
する核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブ
リダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチ
ドの核酸分子を具備した核酸プローブを提供する。
【００２１】本発明はまた、５−ＨＴ1D受容体をコード
するｍＲＮＡの存在を検出することにより、細胞表面に
おける５−ＨＴ1D受容体の発現を検出する方法であっ
て、細胞から全ｍＲＮＡを採取し、得られたｍＲＮＡ
を、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードする核酸分子の配列
内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズすることが
できる少なくとも１５の核酸分子を有する核酸プローブ
とハイブリダイズ条件下で接触させることと、該プロー
ブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在を検出するこ
とにより、該細胞による５−ＨＴ1D受容体の発現を検出
することとを具備した方法を提供する。
【００２２】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するｍＲＮＡ分子の何れかの配列と特異的に結合できる
配列を有し、該ｍＲＮＡ分子の翻訳を防止することがで
きるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２３】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体に向けら
れた抗体を提供する。
【００２４】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡを発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供
する。本発明はまた、正常な受容体活性を示すことがで
きないように変異されたヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡを発現し、天然５−ＨＴ1D受容体を発現しな
い遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。本発明は更
に、そのゲノムがヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤ
ＮＡに対して相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該
アンチセンスＤＮＡが、５−ＨＴ1D受容体をコードする
ｍＲＮＡに対して相補的で且つ５−ＨＴ1D受容体をコー
ドするｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳を減少さ
せるアンチセンスｍＲＮＡ中に転写されるように配置さ
れた、遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００２５】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体の種々の
レベルでの発現による生理学的影響を決定する方法であ
って、そのヒト５−ＨＴ1D受容体の発現レベルが、該ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体の発現を調節する誘導性プロモータ
の使用によって変化されるような遺伝子導入非ヒト動物
を製造することを具備した方法を提供する。本発明はま
た、ヒト５−ＨＴ1D受容体の種々のレベルでの発現によ
る生理学的影響を決定する方法であって、夫々が異なっ
た量のヒト５−ＨＴ1D受容体を発現する遺伝子導入非ヒ
ト動物のパネルを製造することを具備した方法を提供す
る。
【００２６】本発明は、特定のヒト５−ＨＴ1D受容体対
立遺伝子の発現に関連した疾病の素因を診断する方法で
あって、ａ）該疾病に履患した対象のＤＮＡを得ること
と；ｂ）制限酵素のパネルで、該ＤＮＡの制限消化を行
うことと；ｃ）得られたＤＮＡフラグメントを、サイジ
ングゲル上で電気泳動的に分離することと；ｄ）得られ
たゲルを、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡに
対してハイブリダイズすることができ且つ検出マーカー
でラベルされた核酸プローブと接触させることと；ｅ）
検出マーカーでラベルされたヒト５−ＨＴ1D受容体をコ
ードするＤＮＡに対してハイブリダイズされた標識バン
ドを検出し、前記疾病に履患した対象のＤＮＡに特異的
な独特のバンドパターンを形成することと；ｆ）ステッ
プa)-e)によって、診断のために得られたＤＮＡを調製
することと；ｇ）ステップe)で得た前記疾病に履患した
対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンとステッ
プf)で得た診断のためのＤＮＡとを比較し、これらパタ
ーンが同一であるか異なっているかを決定することによ
り、パターンが同一であるときには前記疾病の素因あり
と診断することとを具備した方法を提供する。この方法
はまた、特定のヒト５−ＨＴ1D受容体対立遺伝子の発現
に関連した疾病の診断に使用され得る。
【００２７】本発明は、単離された５−ＨＴ1D受容体の
製造方法であって、細胞に５−ＨＴ 1D受容体の発現を誘
導することと、得られた細胞から該受容体を回収するこ
とと、回収された該受容体を精製することとを具備した
方法を提供する。本発明は、単離された５−ＨＴ1D受容
体の製造方法であって、適切なベクター中に５−ＨＴ 1D
受容体をコードする核酸を挿入することと、得られたベ
クターを適切なホスト細胞中に挿入することと、得られ
た細胞によって産生された前記受容体を回収すること
と、回収された前記受容体を精製することとを具備した
方法を提供する。
【００２８】本発明は、受容体をコードするｍＲＮＡ分
子の何れかの配列と特異的に結合できる配列を有し、該
ｍＲＮＡ分子の翻訳を妨げるアンチセンス・オリゴヌク
レオチドを提供する。
【００２９】本発明はまた、受容体をコードするＤＮＡ
を発現する、遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００３０】本発明は更に、正常な受容体活性を示すこ
とができないように変異された受容体をコードするＤＮ
Ａを発現し、天然の受容体を発現しないような遺伝子導
入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００３１】本発明は、受容体の種々のレベルでの発現
の生理学的影響を決定する方法であって、受容体の発現
を調節する誘導性プロモータの使用により、その受容体
発現のレベルが変化される遺伝子導入非ヒト動物を製造
することを具備した方法を提供する。
【００３２】本発明はまた、種々のレベルでの受容体の
発現の生理学的影響を決定する方法であって、夫々が異
なった量の受容体を発現する遺伝子導入非ヒト動物のパ
ネルを製造することを具備した方法を提供する。
【００３３】本発明は更に、そのゲノムが受容体をコー
ドするＤＮＡに対して相補的なアンチセンスＤＮＡを具
備し、該アンチセンスＤＮＡが、前記受容体をコードす
るｍＲＮＡに対して相補的で且つ前記受容体をコードす
るｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳を減少させる
アンチセンスｍＲＮＡ中に転写されるように配置され
た、遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００３４】本発明は、受容体に結合し得ることが知ら
れていないリガンドが、受容体に結合できるか否かを決
定する方法であって、受容体をコードする単離されたＤ
ＮＡ分子を有する哺乳類細胞と前記リガンドとを、受容
体に結合することが知られているリガンドの結合を可能
とする条件下で接触させることと、前記受容体に結合し
たリガンドの存在を検出し、これによって該リガンドが
受容体に結合するか否かを決定することとを具備した方
法を提供する。
【００３５】〔発明の詳細な説明〕ここで用いられると
き、５−ＨＴ受容体ファミリーは、セロトニンの受容体
として機能する哺乳類タンパク群として定義される。５
−ＨＴ受容体サブファミリーは、推定トランスメンブラ
ン領域（荷電アミノ酸または極性アミノ酸で区切られた
疎水性アミノ酸の線形隣接区域であって、脂質二重層に
広がる二次タンパク構造を形成するために充分に長い区
域）内の推定アミノ酸配列において、相互に65％以上の
相同性を示す遺伝子によってコードされる、５−ＨＴ受
容体ファミリーに属するタンパクのサブセットとして定
義される。これらヒト５−ＨＴ受容体サブファミリー
は、現在入手され得る情報に基づいて区別され得る。５
−ＨＴ2受容体サブファミリーには、ヒト５−ＨＴ2受容
体が含まれる。このファミリーに属する他のヒト受容体
は報告されていないのに対して、ラット５−ＨＴ2受容
体（Pritchett,et al. 1988; Julius,et al. Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 87: 928-932, 1990）およびラット５−
ＨＴ1C受容体（Julius,et al. 1988）がラット５−ＨＴ
受容体サブファミリーを構成する。５−ＨＴ1Aサブファ
ミリーには、Ｇ-21 （Fargin,et al. 1988）としても知
られるヒト５−ＨＴ1A受容体が含まれる。５−ＨＴ1D受
容体サブファミリーには二つの構成員、即ち、この明細
書に記載される５−ＨＴ1D-1受容体（５−ＨＴ1Dαおよ
び／またはペプチド8-30-84とも称される）および５−
ＨＴ1D-2受容体（５−ＨＴ1Dβおよび／またはペプチド
11とも称される）が含まれる。従って、ここで用いられ
る「ヒト５−ＨＴ1D受容体」は、上記５−ＨＴ1D受容体
サブファミリーの構成員を意味するものとして定義され
る。この定義は先に用いた薬理学的定義とは異なってい
るが、今回の定義と薬理学的定義との間には顕著な重複
が存在する。このように記述される５−ＨＴ1D受容体サ
ブファミリーの構成員には、５−ＨＴ1D-1受容体、５−
ＨＴ1D-2受容体、並びに「サブファミリー」の定義に従
って、図３に示したＤＮＡ配列およびアミノ酸配列また
は図４に示したＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に対して
65％の相同性を有する他の何れかの受容体が含まれる。
本発明は５−ＨＴ1D受容体サブファミリーの第一構成員
の発見に関するものである。
【００３６】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
する単離された核酸分子を提供する。定義により、この
ような受容体は５−ＨＴ1D受容体サブファミリーの構成
員である。従って、上記の定義基準に合致する何れの受
容体も、５−ＨＴ1D受容体である。ヒト５−ＨＴ1D受容
体を単離する一つの手段は、当該技術分野で周知の方法
を用い、天然または人工的にデザインされたＤＮＡプロ
ーブでヒト・ゲノムライブラリーをプロービングするこ
とである。ヒト受容体遺伝子５−ＨＴ1D-1および５−Ｈ
Ｔ1D-2から誘導されたＤＮＡプローブは、この目的にと
って特に有用なプローブである。ヒト５−ＨＴ1D受容体
をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子は、ヒト、哺乳
類または他の動物源から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
ＡまたはＲＮＡを得るために用いられ得、或いは以下に
より詳細に説明する方法をもちいて、ｃＤＮＡまたはゲ
ノムライブラリーのスクリーニングにより関連するｃＤ
ＮＡまたはゲノムクローンライブラリーを単離するため
に用いられ得る。これによって、単離されたクローンの
５´未翻訳領域からの転写調節要素、並びに単離された
遺伝子の３´及び５´未翻訳領域からの安定領域、プロ
セッシング領域、転写領域、翻訳領域および組織特異性
決定領域が得られる。核酸分子の例は、ヒト５−ＨＴ1D
受容体をコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離され
たゲノムＤＮＡ分子である。このような分子は、図３に
示したコーディング配列もしくは図４に示したコーディ
ング配列と実質的に同じコーディング配列を有し得、或
いは図３に示したコーディング配列もしくは図４に示し
たコーディング配列に対して65％以上の相同性をもった
コーディング配列を有し得る。ヒト５−ＨＴ1D受容体遺
伝子をコードする図３および図４のＤＮＡ分子は、夫々
５−ＨＴ1D-1および５−ＨＴ1D-2である。
【００３７】本発明は更に、図３に示したコーディング
配列と実質的に同じコーディング配列を有し、ヒト５−
ＨＴ1D-1受容体をコードするｃＤＮＡ分子を提供する。
また、図４に示したコーディング配列と実質的に同じコ
ーディング配列を有し、ヒト５−ＨＴ1D-2受容体をコー
ドするｃＤＮＡ分子を提供する。これら分子は上記の手
段によって得られる。
【００３８】本発明はまた、ヒト５−ＨＴ1D受容体であ
る単離されたタンパクを提供する。このようなタンパク
の例は、図３に示したアミノ酸配列と実質的に同じアミ
ノ酸配列を有する単離されたタンパク、および図４に示
したアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する
単離されたタンパクであり、これらは夫々ヒト５−ＨＴ
1D-1受容体およびヒト５−ＨＴ1D-2受容体である。単離
された５−ＨＴ1D受容体を得るための一つの手段は、該
受容体をコードするＤＮＡを、当該技術分野で周知の方
法を用いることによりバクテリア、酵母もしくは哺乳動
物の細胞のような適切なホスト中で発現させ、その発現
の後に、当該技術分野で周知の方法を用いることにより
該受容体細胞を回収することである。該受容体はまた、
これを発現する細胞、特に、以下に詳細に説明する発現
ベクターを導入された細胞から単離され得る。
【００３９】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡのような単離された
核酸分子を具備したベクターを提供する。ベクターの例
は、バクテリオファージ（例えばラムダファージ）のよ
うなウイルス、コスミド、プラスミド（例えばNJ,Pisca
tawayのファルマシア社から入手可能なｐＵＣ18）およ
び他の組換ベクターである。核酸分子は、当該技術分野
で周知の方法によってベクター・ゲノム中に挿入され
る。例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡは両者と
も制限酵素で消化されて、両分子にその塩基対が互いに
相補的な末端が形成され、次に両者はリガーゼで連結さ
れる。或いは、ベクターＤＮＡ中の制限部位に対応する
リンカーが挿入ＤＮＡに連結され、次いでその部位で切
断する制限酵素で消化され得る。他の手段もまた使用し
得る。プラスミドの具体例は、図３に示すコーディング
配列と実質的に同じコーディング配列を有するｃＤＮＡ
を具備したプラスミド（クローンｐ５ＨＴ-8-30-84と命
名されたもの）、及び図４に示すコーディング配列と実
質的に同じコーディング配列を有するｃＤＮＡを具備し
たプラスミド（クローンｐ５ＨＴ-11と命名されたも
の）である。
【００４０】本発明はまた、バクテリア細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞内での発現に適用されるベクターで
あって、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子
を具備し、更にバクテリア、酵母または哺乳動物細胞内
での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を、前記ヒト５−
ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子に対してその発現
を可能とするような位置に具備したベクターを提供す
る。図３に示すコーディング配列または図４に示すコー
ディング配列と実質的に同じコーディング配列を有する
ＤＮＡは通常はベクター中に挿入されて、ヒト５−ＨＴ
1D受容体を発現する。発現のために要求される調節要素
には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモータ配列お
よびリボゾーム結合のための転写開始配列が含まれる。
例えばバクテリア発現ベクターは、lacプロモータのよ
うなプロモータ、転写開始のためのシャイン-ダルガノ
配列および開始コドンＡＵＧを含んでいる（Maniatis,e
t al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labor
atory, 1982）。同様に、真核細胞発現ベクターは、Ｒ
ＮＡポリメラーゼIIのための非相同性もしくは相同性プ
ロモータ、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡ
ＵＧおよびリボゾームの離脱のための終止コドンが含ま
れる。このようなベクターは商業的に得られ、または当
該技術分野で周知の方法、例えば一般的なベクター構築
のための上記方法によって、記載された配列から構築す
ることができる。発現ベクターは、該受容体を発現する
細胞の製造に有用である。このような細胞のための一定
の使用が、より詳細に以下で説明される。
【００４１】本発明は更に、バクテリア細胞、酵母細胞
または特に哺乳動物細胞内での発現に適用されるプラス
ミドであって、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮ
Ａ分子を具備し、更にバクテリア、酵母または哺乳動物
細胞内での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を、前記ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子に対してそ
の発現を可能とするような位置に具備したプラスミドを
提供する。哺乳動物細胞中での発現に適用される幾つか
のプラスミドは、ｐＳＶＬ（NJ,Piscatawayのファルマ
シア社から入手可能）およびｐｃＥＸＶ-3（Miller J.
and Germain R.N., J.Exp.Med. 164: 1478 (1986)）。
このようなプラスミドの具体例は、哺乳動物細胞中での
発現に適用されるプラスミドであって、図３に示すコー
ディング配列と実質的に同じコーディング配列を有する
ｃＤＮＡおよび該ＤＮＡの哺乳動物細胞中での発現に必
要な調節要素を具備し、ｐｃＥＸＶ-8-30-84と命名さ
れ、ＡＴＣＣ受付け番号40790で寄託されたプラスミド
である。加えて、哺乳動物細胞中での発現に適用される
プラスミドであって、図４に示すコーディング配列と実
質的に同じコーディング配列を有するｃＤＮＡおよび該
ＤＮＡの哺乳動物細胞中での発現に必要な調節要素を具
備し、ｐＳＶＬ-11と命名され、ＡＴＣＣ受付け番号407
91で寄託されたプラスミドである。現存するプラスミド
を利用し、また哺乳動物細胞中での該ＤＮＡの発現に必
要な調節要素をこれに適切に含有させることによって、
ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡおよび該ＤＮ
Ａの哺乳動物細胞内での発現に必要な調節要素を具備
し、哺乳動物細胞中での発現に適用される多くのプラス
ミドが構築され得ることを当業者は容易に想到すること
ができるであろう。該プラスミドは、発現ベクターおよ
び一般ベクターについての上記方法および当該技術分野
で周知の他の方法によって構築され得る。
【００４２】先に議論したこれらの寄託、並びにここで
議論する他の寄託は、特許手続きのための微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、こ
れを満たすために、アメリカ合衆国20852メリーランド
州ロックウイル12301パークローンドライブに所在する
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）に対してなされた。
【００４３】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡ分子を具備した哺乳動物細胞を提供する。例
えば、哺乳動物細胞内での発現に適用されるプラスミド
を具備した哺乳動物細胞であって、該プラスミドが、ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子と、該ヒト
５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子に対してその
発現を可能とするように位置づけられた、哺乳動物細胞
内での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素とを具備した哺
乳動物細胞を提供する。例えばマウス繊維芽細胞ＮＩＨ
３ＴＨ、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌｔｋ-細胞等を
含む多くの哺乳動物細胞がホストとして用いられ得る。
Ｌｔｋ-細胞の特別の例は、Ｌｔｋ-8-30-84と命名され
且つＡＴＣＣ受付番号CRL 10421で寄託された細胞であ
り、これはｐｃＥＸＶ-8-30-84と命名されたプラスミド
を具備している。もう一つの例は、Ｌｔｋ-11と命名さ
れ且つＡＴＣＣ受付番号 CRL 10422で寄託された細胞で
あり、これはｐＳＶＬ-11と命名されたプラスミドを具
備している。先に説明したような発現プラスミドは、リ
ン酸カルシウム沈殿法のような当該技術分野において周
知の方法によって、哺乳動物細胞に形質移入するために
用いられる。或いは、これら５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡは、例えば、マイクロインジェクションによ
って哺乳動物細胞中に導入され、ヒト５−ＨＴ1D受容体
をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはプラスミド
を具備した哺乳動物細胞が得られる。
【００４４】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体に結合し
得ることが知られていないリガンドが、ヒト５−ＨＴ1D
受容体に結合できるか否かを決定する方法であって、ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子を有する哺
乳類細胞と前記リガンドとを、５−ＨＴ1D受容体に結合
することが知られているリガンドのの結合を可能とする
条件下で接触させることと、５−ＨＴ1D受容体に結合し
たリガンドの存在を検出し、これによって該リガンドが
５−ＨＴ1D受容体に結合するか否かを決定することとを
具備した方法を提供する。細胞内のＤＮＡは、図３に示
したコーディング配列または図４に示したコーディング
配列と実質的に同じコーディング配列を有し得る。好ま
しくは、哺乳動物細胞の起源は神経ではない。非神経の
哺乳動物細胞の例はＬｔｋ-細胞、特にＬ−５ＨＴ-8-30
-84と命名されたＬｔｋ-細胞、またはＬ−５ＨＴ-11と
命名されたＬｔｋ-細胞である。リガンドがヒト５−Ｈ
Ｔ1D受容体に結合できるか否かを決定するための好まし
い方法は、その表面に５−ＨＴ1D受容体を発現する遺伝
子導入された非神経の哺乳動物細胞（即ち、本来は何れ
のタイプの５−ＨＴまたはＧタンパク結合受容体をも発
現せず、従って該細胞内に遺伝子導入されたときにのみ
このような受容体を発現する細胞）、又はこのような遺
伝子導入細胞から誘導された膜プレパレーションを一般
に知られた条件下でリガンドと接触させて、５−ＨＴ1D
受容体に対するリガンドのin vivoでの結合を伴わせる
ことと、細胞表面の５−ＨＴ1D受容体に結合した被検リ
ガンドの存在を検出することにより、該リガンドが５−
ＨＴ1D受容体に結合するか否かを決定することとを具備
する。この応答系は、ホスホイノシチド加水分解、アデ
ニレートサイクラーゼ、グアニレートサイクラーゼ又は
イオンチャンネルのような望ましい第二メッセンジャ系
を含む適切なホスト細胞中に、単離されたＤＮＡを導入
することによって得られる。このようなホスト系は、既
存の細胞ラインから単離され、或いは適切な第二メッセ
ンジャ系の成分を既存の細胞ライン中に挿入することに
よって創製され得る。このような遺伝子導入系は、上記
リガンドに関するヒト５−ＨＴ1D受容体の活性の研究ま
たは試験のための完全な応答系を提供する。遺伝子導入
系は、公知もしくは候補の薬剤と、受容体に結合し且つ
放射能試薬、分光学的試薬または他の試薬によってラベ
ルされるリガンドとの間の拮抗結合試験のための、生き
た細胞培養体として有用である。遺伝子導入細胞から単
離された該受容体を含む膜プレパレーションもまた、こ
れら拮抗結合試験のために有用である。遺伝子導入系に
おける第二メッセンジャー系の機能試験またはその結果
は、受容体機能の活性化における結合親和性および効率
のための試験となる。遺伝子導入系は、薬剤開発の可能
性をもった天然化合物または合成化合物、即ち、ヒト５
−ＨＴ1D受容体の本来の機能を活性化しまたは阻害する
ために、更に修飾されて或いはそのまま直接に治療用化
合物として使用される得る化合物を同定するための、有
用な「薬剤発見系」を構成する。この遺伝子導入系はま
た、ヒト５−ＨＴ1D受容体部位における、公知の薬剤の
親和性および効率を決定するためにも有用である。
【００４５】本発明はまた、薬剤をスクリーニングし、
細胞表面のヒト５−ＨＴ1D受容体と特異的に相互作用し
て結合する薬剤を同定する方法であって、細胞表面のヒ
ト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ分子を有する哺
乳動物細胞を複数の薬剤と接触させることと、該哺乳動
物細胞に結合するこれら薬剤を決定し、これにより前記
ヒト５−ＨＴ1D受容体と特異的に相互作用してこれに結
合する薬剤を同定することとを具備した方法を提供す
る。細胞内のＤＮＡは、図３に示したコーディング配列
または図４に示したコーディング配列と実質的に同一の
コーディング配列を有し得る。好ましくは、哺乳類細胞
は非神経起源である。非神経の哺乳動物細胞の例はＬｔ
ｋ-細胞、特にＬ−５ＨＴ-8-30-84と命名されたＬｔｋ-
細胞、またはＬ−５ＨＴ-11と命名されたＬｔｋ-細胞で
ある。薬剤の候補は、当該技術分野において周知の放射
性リガンド結合法（その例は、ここに説明される結合試
験中に示される）を用いて、遺伝子導入細胞内で発現さ
れた５−ＨＴ1D受容体タンパクに高い親和性で結合する
化学的化合物を選択することによって同定される。薬剤
の候補はまた、一つの特定の５−ＨＴ1D受容体サブタイ
プには高い親和性で結合するが、他の何れのセロトニン
受容体サブタイプ若しくは他の公知の受容体部位の何れ
にも高親和性で結合しない化合物を同定することによっ
て、選択性についてスクリーニングされる。選択的な高
親和性の化合物は、患者に投与された後に優先的に標的
５−ＨＴ1D受容体部位と相互作用するから、このアプロ
ーチによって、要求されない副作用をもった薬剤を製造
する機会は最小限に抑制される。本発明は、上記の方法
によって同定された薬剤および薬剤的に許容可能な担体
を含有する薬剤組成物を提供する。候補薬剤が、例えば
経口または注射のような特定の投与経路（望ましい治療
的利点を得るために充分な時間に亘って、作用部位に充
分な治療的濃度が維持されなければならない）に従って
充分に生物学的利用性があることが示され、また非毒性
および適切な疾患モデルにおける治療的有効性が示され
たなら、該薬剤は適切な固体または溶液の処方で、薬剤
の生物学的利用性があると決定された投与経路によっ
て、望ましい治療的利点を得るために患者に投与され得
る。
【００４６】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
する核酸分子の配列内に含まれる配列、例えば図３また
は図４に示す配列内に含まれるコーディング配列と特異
的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５
ヌクレオチドの核酸分子を具備した核酸プローブを提供
する。核酸プローブ技術は当業者に周知である。当業者
は、このようなプローブはそのの長さが大きく変化し得
ること、および該プローブの検出を容易にするために、
放射性アイソトープまたは蛍光色素のような検出マーカ
でラベルされ得ることを容易に想到するであろう。ヒト
５−ＨＴ1D受容体をコードする核酸の検出は、対応する
５−ＨＴ1D受容体の発現レベルが変化する疾病の診断試
験として有用である。ＤＮＡプローブ分子は、全て当該
技術分野で周知の方法を用いて、ヒト５−ＨＴ1D受容体
またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子をプラ
スミドまたはバクテリオファージのような適切なベクタ
ー中に挿入し、続いてこれを適切なバクテリアホスト細
胞中に挿入して複製し、該ＤＮＡプローブを回収するこ
とによって製造される。例えば、該ＤＮＡはフェノール
及びエタノールを用いて細胞溶解物から抽出され、ベク
ター（上記で議論したもの）中への該ＤＮＡの挿入部位
に対応する制限酵素で消化され、電気泳動され、得られ
たゲルが裁断される。このようなＤＮＡ分子の例は、図
３および図４に示されている。このプローブは、その場
でのハイブリダイゼーションのために、またはこの遺伝
子ファミリーを発現する組織を突き止めるために、或い
は種々の生物学的組織におけるこれら遺伝子もしくはそ
のｍＲＮＡの存在を調べる他のハイブリダイゼーション
試験のために有用である。加えて、ヒト５−ＨＴ1D受容
体をコードするＤＮＡ分子の配列に対して相補的な合成
オリゴヌクレオチド（ＤＮＡシンセサイザ−により製造
されたもの）は、これら遺伝子もしくはその関連するｍ
ＲＮＡのためのプローブとして有用であり、或いは、ゲ
ノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー
の相同性スクリーニングによって、又はポリメラーゼチ
ェインリアクションのような増幅技術の使用によって、
関連する遺伝子を単離するためのプローブとして有用で
ある。
【００４７】本発明はまた、５−ＨＴ1D受容体をコード
するｍＲＮＡの存在を検出することにより、細胞表面に
おける５−ＨＴ1D受容体の発現を検出する方法であっ
て、当該技術分野で周知の方法を用いることにより細胞
から全ｍＲＮＡを採取し、得られたｍＲＮＡを、ヒト５
−ＨＴ1D受容体をコードする核酸分子の配列内に含まれ
る配列と特異的にハイブリダイズすることができる少な
くとも１５の核酸分子を有する核酸プローブとハイブリ
ダイズ条件下で接触させることと、該プローブにハイブ
リダイズされたｍＲＮＡの存在を検出することにより、
該細胞による５−ＨＴ1D受容体の発現を検出することと
を具備した方法を提供する。ｍＲＮＡのような標的核酸
分子に対するプローブのハイブリダイゼーションには、
当該技術分野において周知の技術が用いられる。この方
法を実施する一つの可能な方法においては、溶解細胞か
らの沈殿によって核酸が抽出され、該ｍＲＮＡ分子のポ
リ-Ａ尾部を結合させるカラムを用いて該抽出物からｍ
ＲＮＡが単離される。次いで、該ｍＲＮＡはニトロセル
ロース膜上の放射能ラベルされたプローブに曝され、該
プローブは相補的なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズして
これをラベルする。結合はオートラジオグラフィー又は
シンチレーション計数によって検出され得る。しかし、
これらのステップを実施するための他の方法が当業者に
周知であり、上記の議論は単なる一例に過ぎない。
【００４８】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するｍＲＮＡ分子の何れかの配列と特異的に結合できる
配列を有し、該ｍＲＮＡ分子の翻訳を防止することがで
きるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。こ
のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、その配列が図
３に示されるｃＤＮＡ分子またはその配列が図４に示さ
れるｃＤＮＡ分子の何れかの配列と特異的に結合できる
配列を有し得る。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの
特別の例は、ヌクレオチド類の化学的類似体を具備する
アンチセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００４９】本発明はまた、細胞膜を通過して細胞内で
ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするｍＲＮＡと特異的に
結合し、その翻訳を妨げることにより、ヒト５−ＨＴ1D
受容体の発現を低下させるのに有効な量の上記オリゴヌ
クレオチドと、細胞膜を通過できる薬剤的に許容可能な
疎水性担体とを含有する薬剤組成物を提供する。前記オ
リゴヌクレオチドはリボザイムのような、ｍＲＮＡを不
活性化する物質に結合され得る。細胞膜を通過すること
ができる前記薬剤的に許容可能な疎水性担体もまた、選
択された細胞タイプに対して特異的な受容体に結合する
構造を具備し得、これによって選択された細胞タイプの
細胞によって摂取され得る。該構造は、例えば膵臓細胞
にターゲットされるインスリン分子のような、細胞タイ
プ特異性受容体に結合することが知られたタンパクの一
部であり得る。図３に示すコーディング配列または図４
に示すコーディング配列と実質的に同じコーディング配
列を有するＤＮＡ分子は、この薬剤組成物の前記オリゴ
ヌクレオチドとして用いられ得る。
【００５０】本発明はまた、５−ＨＴ1D受容体の発現の
減少によって緩和される異常を治療する方法であって、
対象に対して、対象による５−ＨＴ1D受容体の発現を減
少させるのに有効な量の上記薬剤組成物を投与すること
を具備した方法を提供する。本発明は更に、５−ＨＴ1D
受容体活性に関連した異常症状を治療する方法であっ
て、対象に対し、対象による５−ＨＴ1D受容体の発現を
減少させるのに有効な量の上記薬剤組成物を投与するこ
とを具備した方法を提供する。このような異常症状の幾
つかの例は、痴呆、パーキンソン病、飲食障害(eating
disorder)、病的不安(pathological anxiety)または片
頭痛である。
【００５１】アンチセンス・オリゴヌクレオチド薬剤
は、これら受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害す
る。合成オリゴヌクレオチド又は他のアンチセンスか学
構造は、５−ＨＴ1D受容体をコードするｍＲＮＡに結合
してｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計され、患者の
５−ＨＴ1D受容体遺伝子の発現を阻害する薬剤として有
用である。本発明は、５−ＨＴ1D受容体をコードするｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害する合成アンチセンス・オリゴヌク
レオチド薬剤（ＳＡＯＤ）の使用によって、ヒト５−Ｈ
Ｔ1D受容体の発現レベルを治療的に変化させる手段を提
供する。ｍＲＮＡを認識して選択的に結合するようにデ
ザインされた合成オリゴヌクレオチド又は他のアンチセ
ンス化学構造は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学修飾された
人工核酸の図３または図４に示すヌクレオチド配列の部
分に対して相補的になるように構築される。該ＳＡＯＤ
は注射による患者への投与のために、血流中で安定であ
るようにデザインされ、或いは患者から取り出された細
胞への投与のために、実験室での細胞培養条件で安定で
あるようにデザインされる。このＳＡＯＤは、細胞の細
胞質に入り込めるように、細胞膜の通過を可能とする該
ＳＡＯＤの物理的および化学的性質によって（例えば、
小さい疎水性ＳＡＯＤ化学構造をデザインすること）、
または該ＳＡＯＤを認識してこれを細胞内へ輸送する細
胞の特異的輸送システムによって、細胞膜を通過できる
ようにデザインされる。加えて、所定の選択された細胞
ポピュレーションのみがＳＡＯＤに結合してこれを取り
込む特異的な細胞の摂取メカニズムによって認識される
ように、ＳＡＯＤをターゲッティングすることにより、
ＳＡＯＤは一定の選択された細胞ポピュレーションのみ
への投与のためにデザインされ得る。例えば、ＳＡＯＤ
は上記で議論したような所定の細胞タイプだけに存在す
る受容体と結合するようにデザインされ得る。ＳＡＯＤ
はまた、標的ｍＲＮＡ配列（図４および図５に示す配列
内に含まれる配列に対応し得る）を認識して、該ｍＲＮ
Ａに対する相補的塩基対形成によって選択的にこれと結
合するようにデザインされ得る。最後に、このＳＡＯＤ
は次ぎの三つのメカニズムの何れかによって、標的ｍＲ
ＮＡ配列を不活性化するようにデザインされる：(1) 標
的ｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡseＩ消化のような固有の細
胞メカニズムによって該ｍＲＮＡの分解を誘導する。
(2) 翻訳調節因子またはリボゾームとの結合を妨害する
ことにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。(3) リボ
ザイム配列または反応性化学基のような、標的ｍＲＮＡ
を分解もしくは化学的に修飾する他の化学構造の取り込
み。合成アンチセンス・オリゴヌクレオチド薬剤は、標
的ｍＲＮＡに向けられたときに上記の性質を発揮できる
ことが示されている（J.S.Cohen, Trends in Pham.Sci.
10, 435 (1989); H.M.Weintraub, Sci.Am.January (19
90) p.40）。加えて、アンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドへのリボザイムの結合は、標的ｍＲＮＡを不活性化す
るための有望な戦略である（N.Sarver et al., Science
247, 1222 (1990)）。ＳＡＯＤは、注射によって患者
に投与されるようにデザインされるとき、或いは患者の
標的細胞を取り出し、実験室においてＳＡＯＤで処理し
て患者に戻されるときに、有効な治療剤として作用す
る。この方法においてＳＡＯＤは、５−ＨＴ1D受容体の
発現の低下が有益であるような何れの臨床症状において
も、患者の特定の標的細胞中における受容体の発現を減
少させるための治療として役立つ。
【００５２】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体に向けら
れた抗体、例えば、細胞表面に存在するヒト５−ＨＴ1D
受容体のエピトープに向けられたモノクローナル抗体で
あって、図３に示すアミノ酸配列または図４に示すアミ
ノ酸配列に含まれるヒト５−ＨＴ1D受容体の細胞表面エ
ピトープに対するアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸
配列を有するモノクローナル抗体を提供する。アミノ酸
配列は、これらが構成するタンパクにおいて、これらが
疎水性または親水性領域を生成するか否かを決定するた
めの、当該技術分野で周知の方法によって分析され得
る。細胞膜タンパクの場合、水性環境においては、親水
性領域は細胞表面に位置する一方、疎水性領域は細胞膜
を形成する脂質二重層の中に挿入されるタンパクの一部
を形成することが周知である。従って、図３または図４
に示す親水性アミノ酸配列に対する抗体は、説明したよ
うにヒト５−ＨＴ1D受容体の表面エピトープに結合す
る。ヒト５−ＨＴ1D受容体に向けられる抗体は血清由来
またはモノクローナルであり、当該技術分野で周知の方
法によって製造される。例えば、モノクローナル抗体は
ハイブリドーマ技術を用い、免疫された動物から採取し
た抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合し、得られた
望ましい抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインを選
別することによって製造される。ＳＲ３Ｔ３細胞または
Ｌｔｋ-細胞のような細胞が、このような抗体を生じさ
せる免疫原として用いられ得る。或いは、商業的に入手
可能な機械および図３および図４に示すアミノ酸配列を
用いて、合成ペプチドが製造され得る。更なる別法とし
て、ｃＤＮＡもしくはそのフラグメントのようなＤＮＡ
がクローン化され、発現され、得られたポリペプチドが
回収されて、免疫原として使用され得る。これらの抗体
は、単離されたＤＮＡによってコードされるヒト５−Ｈ
Ｔ1D受容体の存在を検出するために有用であり、或い
は、生きた動物、ヒト、または動物もしくはヒトから単
離された生物学的組織もしくは体液中において、前記受
容体の機能を阻害するために有用である。
【００５３】本発明は、本来的に存在するリガンドの５
−ＨＴ1D受容体への結合をブロックするのに有効な量
の、ヒト５−ＨＴ1D受容体に向けられた抗体と、薬剤的
に許容され得る担体とを含有した薬剤組成物を提供す
る。細胞表面に存在するヒト５−ＨＴ1D受容体のエピト
ープ向けられたモノクローナル抗体であって、図３に示
すアミノ酸配列または図４に示すアミノ酸配列に含まれ
るヒト５−ＨＴ1D受容体の細胞表面エピトープに対する
アミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するモノ
クローナル抗体は、この目的のために有用である。
【００５４】本発明はまた、５−ＨＴ1D受容体の発現の
減少によって緩和される異常を治療する方法であって、
対象に対して、５−ＨＴ1D受容体への本来存在するリガ
ンドの結合をブロックすることにより、ヒト５−ＨＴ1D
受容体の過剰発現によりもたらされる異常を緩和するの
に有効な量の上記薬剤組成物を投与することを具備した
方法を提供する。抗体の受容体に対する結合は、該受容
体が機能するのを妨げることにより、過剰発現の影響を
中和する。上記モノクローナル抗体は、両者ともこの目
的のために有用である。加えて、本発明は、５−ＨＴ1D
受容体活性の過剰に関連した異常症状を治療する方法で
あって、対象に対し、５−ＨＴ1D受容体への本来的に存
在するリガンドの結合をブロックすることにより、異常
症状を緩和するのに有効な量の上記薬剤組成物を投与す
ることを具備した方法を提供する。このような異常症状
の幾つかの例は、痴呆、パーキンソン病、飲食障害(eat
ing disorder)、病的不安(pathological anxiety)また
は片頭痛である。
【００５５】本発明は、細胞表面における５−ＨＴ1D受
容体の存在を検出する方法であって、該細胞とヒト５−
ＨＴ1D受容体に向けられた抗体とを、該抗体の該受容体
への結合を可能とする条件下で接触させることと、該細
胞に結合された該抗体の存在を検出することにより、該
細胞表面におけるヒト５−ＨＴ1D受容体の存在を検出す
ることとを具備した方法を提供する。このような方法
は、与えられた細胞が細胞表面における５−ＨＴ1D受容
体の発現が欠けているか否かを決定するために有用であ
る。結合された抗体は、当該技術分野において周知の方
法により検出される。例えば、抗体に蛍光マーカーを結
合し、細胞サンプルを蛍光顕微鏡下で検査して、抗体の
結合を示す細胞上の蛍光を検出する。上記のモノクロー
ナル抗体は、この目的のために有用である。
【００５６】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡを発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供
する。本発明はまた、正常な受容体活性を示せないよう
に変異されたヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡ
を発現し、天然５−ＨＴ1D受容体を発現しない遺伝子導
入非ヒト哺乳動物を提供する。本発明はまた、そのゲノ
ムがヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡに対して
相補的なアンチセンスＤＮＡを具備し、該アンチセンス
ＤＮＡはアンチセンスｍＲＮＡ中に転写されるように配
置され、該アンチセンスｍＲＮＡは５−ＨＴ1D受容体を
コードするｍＲＮＡに対して相補的であり、且つ５−Ｈ
Ｔ1D受容体をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズして
その翻訳を減少させる、遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提
供する。前記ＤＮＡは、発現が誘導され得または特異的
な細胞タイプに限定され得るように、追加的に誘導プロ
モータを具備し、または追加的に組織特異的調節要素を
具備する。ＤＮＡの例は、図３に示すコーディング配列
または図４に示すコーディング配列と実質的に同じコー
ディング配列を有するＤＮＡもしくはｃＤＮＡ分子であ
る。遺伝子導入動物の一例は、遺伝子導入マウスであ
る。組織特異性決定領域の例は、メタロチオネインプロ
モータ（Low,M.L., Lechan,R.M., Hammer,R.E.et al. S
cience 231: 1002-1004 (1986)）およびＬ７プロモータ
（Oberdick,J.,Smeyne,R.J., Mann,J.R., Jackson,S. a
nd Morgan,J.I. Science 248: 223-226(1990)）であ
る。
【００５７】ヒト５−ＨＴ1D受容体の薬理学的および行
動的役割を解明する動物モデル系は、種々の技術によ
り、５−ＨＴ1D受容体の発現が増大もしくは減少され、
または発現した５−ＨＴ1D受容体タンパクのアミノ酸配
列が変化される遺伝子導入動物を創製することによって
製造される。これら技術の例には、次のものが含まれ
る：(1) 遺伝子導入動物を製造するために、マイクロイ
ンジェクション、レトロウイルス感染または当業者に周
知の他の手段によって、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
するＤＮＡの正常もしくは変異バージョンまたはこれら
遺伝子の相同性動物バージョンを、適切な受胎された胎
児に挿入すること（Hogan B. et al. Manipulating the
Mouse Embryo,A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laaboratory (1986)）。(2) 遺伝子導入動物におけ
る本来の遺伝子位置での、これら遺伝子の変異もしくは
正常なヒトもしくは動物バージョンの相同性組換え（Ca
pecchiM.R. Science 244: 1288-1292 (1989); Zimmer,
A. and Gruss,P. Nature 338;150-153 (1989)）によ
り、これら５−ＨＴ1D受容体の発現または構造の調節を
変更する。相同性組換えの技術は、当該技術分野におい
て周知である。これは天然遺伝子を挿入遺伝子で置き換
えるものであるから、天然受容体は発現できないが、例
えば挿入された変異受容体（組換えによって動物ゲノム
中の天然受容体と置き換わったもの）を発現し、その結
果として当該受容体の過少発現をもたらすような動物を
製造するのに有用である。マイクロインジェクションは
ゲノムに遺伝子を加えるが、遺伝子を除去しないから、
それ自身の受容体および加えられた受容体を発現し、そ
の結果として当該受容体の過剰発現をもたらすような動
物の製造に有用である。遺伝子導入動物の製造に利用で
きる一つの手段について、マウスを例にとって説明すれ
ば次の通りである：雌のマウスを交配し、その輸卵管か
ら受精した卵子を取り出す。この卵子は、Ｍ２培地（Ho
gan B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Laaboratory (19
86)）のような適切な培地内で貯蔵される。ヒト５−Ｈ
Ｔ1D受容体をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡが、当該
技術分野で周知の方法によって、ベクター（例えば、上
記プラスミドｐ５ＨＴ-8-30-84またはｐ５ＨＴ-11）か
ら精製される。導入遺伝子の発現を調節する実験的手段
を提供するために、誘導性プロモータはＤＮＡのコーデ
ィング領域と融合され得る。別法として或いはこれに加
えて、導入遺伝子の組織特異性発現を可能とするため
に、組織特異性調節要素がコーディング領域と融合され
得る。適切な緩衝溶液中のＤＮＡが、マイクロインジェ
クション針（ピペット引き具を用いたキャピラリ管から
作られたものでよい）に入れられ、注入されるべき卵子
は凹形スライドに入れられる。針が卵子の前核中に挿入
され、ＤＮＡ溶液が注入される。注入された卵子は、次
いで擬妊娠マウス（妊娠を維持するために適切なホルモ
ンによって刺激されたが、実際には妊娠していないマウ
ス）の卵管内に移され、子宮に進み、着床し、所定期間
の発生が行われる。上記で述べたように、マイクロイン
ジェクションはＤＮＡを卵細胞に挿入するための唯一の
方法ではなく、ここでは例示の目的だけのために用いら
れるものである。
【００５８】受容体特異性薬剤の正常な作用は受容体を
活性化もしくは阻害することであるから、上記の遺伝子
導入動物モデル系はこれら５−ＨＴ1D受容体に向けられ
た薬剤の生物学的活性を試験するために有用であり、こ
れら薬剤が利用可能になる前であっても有用である。こ
れら動物モデル系は、天然または導入された遺伝子の発
現を誘導もしくは阻害して、生きた動物における正常も
しくは変異した５−ＨＴ1D受容体の発現を増大もしくは
減少することにより、５−ＨＴ1D受容体を活性化もしく
は阻害する薬剤について、その可能な治療的適用を予測
もしくは評価するために有用である。こうしてモデル系
が製造され、５−ＨＴ1D受容体に向けられた薬剤の生物
学的活性が、このような薬剤が利用可能になる前に評価
される。５−ＨＴ1D受容体を過剰もしくは過少に産生す
る遺伝子導入動物は、その生理学的状態によって、５−
ＨＴ1D受容体の過剰産生または過少産生が治療的に有用
であるか否かを示す。従って、これは遺伝子導入モデル
系に基づいた薬剤作用を評価するために有用である。一
つの使用は、抗欝剤のような薬剤は神経伝達物質の吸収
をブロックすることによって作用し、シナプス間隙にお
ける神経伝達物質の量を増大させるといった、当該技術
分野において周知の事実に基づいている。この作用の生
理学的結果は、障害細胞(affected cell)がより少ない
受容体を産生することを刺激し、過少発現を導くという
ことである。従って、受容体を過少発現する動物は、こ
のような過少発現をもたらす薬剤の作用が、過少発現の
下でも実際に治療的であるか否かを調べるための試験系
として有用である。もう一つの使用は、過剰発現が異常
を導くことが見出だされて、５−ＨＴ1D受容体を下方調
節しまたは５−ＨＴ1D受容体に対して拮抗剤として作用
する薬剤がこれを悪化させることが示されるとき、並び
に有望な治療的適用がこれら動物モデル系によってカバ
ーされないときに、これら５−ＨＴ1D受容体に向けられ
た拮抗剤または拮抗的薬剤を製造することによって、或
いはヒトにおけるこれら５−ＨＴ1D受容体の発現を増大
もしくは減少させる何れかの方法によって、５−ＨＴ1D
受容体の活性化または阻害が治療的に達成されることで
ある。
【００５９】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体の種々の
レベルでの発現による生理学的影響を決定する方法であ
って、そのヒト５−ＨＴ1D受容体の発現レベルが、該ヒ
ト５−ＨＴ1D受容体の発現を調節する誘導性プロモータ
の使用によって変化されるような遺伝子導入非ヒト動物
を製造することを具備した方法を提供する。本発明はま
た、ヒト５−ＨＴ1D受容体の種々のレベルでの発現によ
る生理学的影響を決定する方法であって、夫々が異なっ
た量のヒト５−ＨＴ1D受容体を発現する遺伝子導入非ヒ
ト動物のパネルを製造することを具備した方法を提供す
る。このような動物は、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコード
する異なった量のＤＮＡを、そこから遺伝子導入動物が
発生する卵母細胞中に導入することによって製造され得
る。
【００６０】本発明はまた、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過
剰発現によりもたらされる異常を緩和することができる
物質を同定するための方法であって、該物質を、ヒト５
−ＨＴ1D受容体をコードする少なくとも一つの人工的に
導入されたＤＮＡ分子を発現している遺伝子導入非ヒト
哺乳動物に投与することと、該物質が、該遺伝子導入非
ヒト哺乳動物によって示されるヒト５−ＨＴ1D受容体の
過剰発現の結果としての身体的もしくは行動的異常を緩
和するか否かを決定することを具備した方法を提供す
る。ＤＮＡ分子の例は、図３に示すコーデイング配列ま
たは図４に示すコーディング配列と実質的に同じコーデ
ィング配列を有するＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子であ
る。
【００６１】本発明は、５−ＨＴ1D受容体の過剰発現か
らもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記物質
と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物
を提供する。
【００６２】本発明は更に、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過
剰発現からもたらされる異常を治療する方法であって、
対象に対し、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過剰発現からもた
らされる異常を緩和するのに有効な量の上記薬剤組成物
を投与することを具備した方法を提供する。
【００６３】本発明は、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過少発
現によりもたらされる異常を緩和することができる物質
を同定するための方法であって、該物質を、機能しない
ヒト５−ＨＴ1D受容体のみを発現している上記遺伝子導
入非ヒト哺乳動物に投与することと、該物質が、該遺伝
子導入非ヒト哺乳動物によって示されるヒト５−ＨＴ 1D
受容体の過少発現の結果としての身体的もしくは行動的
異常を緩和するか否かを決定することを具備した方法を
提供する。
【００６４】本発明はまた、５−ＨＴ1D受容体の過少発
現からもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記
物質と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組
成物を提供する。
【００６５】本発明は更に、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過
少発現からもたらされる異常を治療する方法であって、
対象に対し、ヒト５−ＨＴ1D受容体の過少発現からもた
らされる異常を緩和するのに有効な量の上記薬剤組成物
を投与することを具備した方法を提供する。
【００６６】本発明は、特定のヒト５−ＨＴ1D受容体対
立遺伝子の発現に関連した疾病の素因を診断する方法で
あって、ａ）該疾病に履患した対象のＤＮＡを得ること
と；ｂ）制限酵素のパネルで、該ＤＮＡの制限消化を行
うことと；ｃ）得られたＤＮＡフラグメントを、サイジ
ングゲル上で電気泳動的に分離することと；ｄ）得られ
たゲルを、ヒト５−ＨＴ1D受容体をコードするＤＮＡに
対してハイブリダイズすることができ且つ検出マーカー
でラベルされた核酸プローブと接触させることと；ｅ）
検出マーカーでラベルされたヒト５−ＨＴ1D受容体をコ
ードするＤＮＡに対してハイブリダイズされた標識バン
ドを検出し、前記疾病に履患した対象のＤＮＡに特異的
な独特のバンドパターンを形成することと；ｆ）ステッ
プa)-e)によって、診断のために得られたＤＮＡを調製
することと；ｇ）ステップe)で得た前記疾病に履患した
対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンとステッ
プf)で得た診断のためのＤＮＡとを比較し、これらパタ
ーンが同一であるか異なっているかを決定することによ
り、パターンが同一であるときには前記疾病の素因あり
と診断することとを具備した方法を提供する。この方法
はまた、特定のヒト５−ＨＴ1D受容体対立遺伝子の発現
に関連した疾病の診断に使用され得る。
【００６７】本発明は、単離された５−ＨＴ1D受容体の
製造方法であって、細胞に５−ＨＴ 1D受容体の発現を誘
導することと、得られた細胞から該受容体を回収するこ
とと、回収された該受容体を精製することとを具備した
方法を提供する。単離された５−ＨＴ1D受容体の例は、
図３に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を
有する単離されたタンパクである。単離された５−ＨＴ
1D受容体のもう一つの例は、図４に示すアミノ酸配列と
実質的に同じアミノ酸配列を有する単離されたタンパク
である。例えば、ホルモンのような物質に曝されること
によって、細胞は受容体の発現を誘導され得る。次い
で、細胞はホモジェナイズされ、例えばセロトニン若し
くは該受容体に結合することが知られている他の物質を
具備するアフィニティーカラムを用いて、該ホモジネー
トから該受容体が単離され得る。得られた画分は、次に
これをイオン交換カラムと接触させることによって精製
され得、何れの画分が受容体活性を含むか、または抗受
容体抗体に結合するかが決定される。
【００６８】本発明は、単離された５−ＨＴ1D受容体の
製造方法であって、適切なベクター中に５−ＨＴ1D受容
体をコードする核酸を挿入することと、得られたベクタ
ーを適切なホスト細胞中に挿入することと、得られた細
胞によって産生された前記受容体を回収することと、回
収された前記受容体を精製することとを具備した方法を
提供する。単離された５−ＨＴ1D受容体の例は、図３に
示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する
単離されたタンパクである。単離された５−ＨＴ1D受容
体のもう一つの例は、図４に示すアミノ酸配列と実質的
に同じアミノ酸配列を有する単離されたタンパクであ
る。この５−ＨＴ1D受容体の製造方法は、当該技術分野
において周知の組換ＤＮＡ技術を用いる。例えば、５−
ＨＴ1D受容体をコードする単離された核酸が、発現ベク
ターのような適切なベクター中に挿入される。このベク
ターは適切な細胞、例えばバクテリア細胞、或いは酵母
細胞のような真核細胞内に導入される。アフィニティー
精製、クロマトグラフィーまたは当該技術分野において
周知の他の方法により、５−ＨＴ1D受容体が培地から単
離される。
【００６９】本発明は、受容体をコードするｍＲＮＡ分
子の何れかの配列と特異的に結合できる配列を有し、該
ｍＲＮＡ分子の翻訳を妨げるアンチセンス・オリゴヌク
レオチドを提供する。
【００７０】本発明はまた、受容体をコードするＤＮＡ
を発現する、遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００７１】本発明は更に、正常な受容体活性を示すこ
とができないように変異された受容体をコードするＤＮ
Ａを発現し、天然の受容体を発現しないような、遺伝子
導入非ヒト哺乳動物を提供する。
【００７２】本発明は、種々のレベルでの受容体発現の
生理学的影響を決定する方法であって、受容体の発現を
調節する誘導性プロモータの使用により、その受容体発
現のレベルが変化される遺伝子導入非ヒト動物を製造す
ることを具備した方法を提供する。
【００７３】本発明はまた、種々のレベルでの受容体発
現の生理学的影響を決定する方法であって、夫々が異な
った量の受容体を発現する遺伝子導入非ヒト動物のパネ
ルを製造することを具備した方法を提供する。
【００７４】本発明は更に、そのゲノムが受容体をコー
ドするＤＮＡに対して相補的なアンチセンスＤＮＡを具
備し、該アンチセンスＤＮＡは前記受容体をコードする
ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスｍＲＮＡ中に転
写されるように配置されおり、且つ該アンチセンスｍＲ
ＮＡは前記受容体をコードするｍＲＮＡとハイブリダイ
ズしてその翻訳を減少させる、遺伝子導入非ヒト哺乳動
物を提供する。
【００７５】本発明は、受容体に結合し得ることが知ら
れていないリガンドが、受容体に結合できるか否かを決
定する方法であって、受容体をコードする単離されたＤ
ＮＡ分子を有する哺乳動物細胞と前記リガンドとを、受
容体に結合することが知られているリガンドの結合を可
能とする条件下で接触させることと、前記受容体に結合
したリガンドの存在を検出し、これによって該リガンド
が受容体に結合するか否かを決定することとを具備した
方法を提供する。
【００７６】出願人は、個々の受容体サブタイプタンパ
クを同定しており、また治療的処理のための薬理学的化
合物を同定するための方法を開示している。特定の受容
体サブタイプに向けられた薬理的化合物は、最小限の副
作用を伴う効果的な新しい治療を提供する。
【００７７】５−ＨＴ1D受容体サブタイプは、ウシの脳
の尾状核において最初に検出された。５−ＨＴ1Dは５−
ＨＴ1B受容体の非ゲッ歯目類縁体であり、脳幹神経節に
強く局在していることが広く容認されている（Schmidt
and Peroutka, FASEB J. 3:2242 (1989)）。脳幹神経節
は運動制御に関与するから、５−ＨＴ1D受容体は運動制
御において重要である。加えて、パーキンソン病患者の
５−ＨＴ1D受容体に関する先の報告を、より最近の５−
ＨＴ1D受容体薬理学の観点から再試験することによっ
て、興味深い知見が得られる。痴呆を伴なうパーキンソ
ン病患者は、前頭皮質における５−ＨＴ1受容体の顕著
な減少を示す（Cross,A.J., Crow,T.J.,Johnston,J.A.,
Perry,E.K., Perry,R.H., Blessed,G. and Tomlinson,
B.E., J.Neurol.Sci. 60: 383-392 (1989)）。この領域
は、最近になって、５−ＨＴ1受容体のうちで５−ＨＴ
1D受容体が主に含まれることが示されている（Herrick-
Davis,K., Titeler,M., Leonhardt,S., Struble,R. and
Price,D., J.Neurochem.51: 19060-1912 (1988)）。こ
れらのデータは、パーキンソン病痴呆の改善において、
また５−ＨＴ1受容体を含む他の痴呆の治療において、
５−ＨＴ1D詰抗剤が顕著な治療価値を有するであろうこ
とを示している。
【００７８】５−ＨＴ1D受容体は摂食行動の調節に関係
しており、従って肥満症の治療、および拒食症および多
食症の有力な病識を提供する。ラットのモデルにおい
て、５−ＨＴ1D受容体の類縁体である５−ＨＴ1Bは摂食
に関係している。RU 24924（DPATではない）およびｍＣ
ＰＰのような５−ＨＴ1Bの詰抗剤は、何れも摂食を低下
させる（Hutson,P.H., Kennett,G.A., Donohoe,T.P., D
ourish,C.T., and Curzon,G. in Behavioral Pharmacol
ogy of 5-HT, Bevan,P., Cools,A.R., and Archer,T.,
eds. Lawrence Erlbaum Associates, Publishers; N.J.
(1989) pp.283-286; Samanin,R. in Behavioral Pharma
cology of 5-HT, Bevan,P., Cools,A.R.,and Archer,
T., eds. Lawrence Erlbaum Associates, Publishers;
N.J.(1989)pp.259-283）。他の研究においては、５−Ｈ
Ｔ1B受容体の詰抗剤は拒食症を引き起こす（Leander,J.
D., in Behavioral Pharmacology of 5-HT, Bevan,P.,
Cools,A.R., and Archer,T., eds. Lawrence Erlbaum A
ssociates, Publishers; N.J.(1989) pp.287-290）。摂
食行動の神経性基質部分である中隔側座核(nucleus acc
ubens)における５−ＨＴ1D受容体の局在（Samanin,198
9; ibid）は、５−ＨＴ 1D詰抗剤が肥満症の制御に治療
的価値を有することを示す。更に、５−ＨＴ1D詰抗剤は
内因性拒食症の解消および多食行動の制御において有用
である。
【００７９】５−ＨＴ1D受容体はまた、不安にも関係し
ている。ラット類似モデルにおいて、５−ＨＴ1B受容体
の詰抗剤はラットの驚愕反応を減少させ、防御的な蹲る
行動(burying behavior)をさせることが報告されている
（Bevan,P., Lorens,S., andAecher,T. in Behavioral
Pharmacology of 5-HT, Bevan,P.,Cools,A.R., andArch
er,T., edsS. Lawrence Erlbaum Associates, Publishe
rs; N.J.(1989) pp.459-474）。両パラダイムは、ヒト
５−ＨＴ1D受容体の抗不安薬としての可能な治療的役割
を示している。更に、ヨヒンビン（５−ＨＴ1D詰抗剤）
は人間のパニック発作を悪化させることが示されている
（Charney,D.S., Henenger,G.R., andBreier,A., Arch.
Gen.Psychiat. 41: 751-763,(1984)）。
【００８０】５−ＨＴ1D受容体薬理学の立証された最良
の治療的応用は、片頭痛の治療である。一定の５−ＨＴ
1D受容体部位に対する詰抗剤であるスマトリプタンは、
臨床試験において急性の片頭痛発作を制御するのに有効
であり（Doenicke,A., Melchart,D., Bayliss,E.M., Ce
phalalgia 9 suppl 9: 89-92 (1988)）、副作用が僅か
で効率も良好であることが示されている（Baer H.A., B
rand,J., Doenicke,A., Melchart,D., Tryba,M., and S
ahlender,H.M., Cephalalgia 9 (suppl 9): 83-87(198
9), Perrin,V.L., Farkkila,J., Goasguen,J., Donick
e,A., Brand,J.,and Tfelt-Hansen,P., Cepahalalgia 9
(Suppl 9) 63-72,(1989)）。スマトリプタンは頭痛だ
けでなく、片頭痛患者によるノイローゼ、嘔吐および感
覚失調にも有効であると思われる。出願人は、スマトリ
プタンがヒト５−ＨＴ1D-1および５−ＨＴ1D-2受容体に
極めて高い親和性を有することを示した（表１）。
【００８１】本発明は、最初に、二つの新規な受容体タ
ンパク、そのアミノ酸配列、およびそのヒト遺伝子を同
定する。更に本発明は、５−ＨＴ1D受容体の定義の内に
含まれる従来認識されていなかった受容体群を記述す
る。この発見によって提供される情報および実験手段
は、新規な治療剤、これら新規な受容体タンパクのため
の新規な治療的もしくは診断的試験、その関連ｍＲＮＡ
分子、またはその関連ゲノムＤＮＡを創製するために有
用である。この発見によって提供される情報および実験
手段は、新規な治療剤、これら新規な受容体タンパクの
ための新規な治療的もしくは診断的試験、その関連ｍＲ
ＮＡ分子、またはその関連ゲノムＤＮＡを創製するため
に有用であろう。
【００８２】具体的には、本発明は第一に、５−ＨＴ1D
受容体をコードするヒトｃＤＮＡおよびゲノムクローン
の単離に関する。該受容体のための二つの新規なヒト遺
伝子（５−ＨＴ1D-1および５−ＨＴ1D-2）が同定され、
特徴付けられた。また、一連の関連ｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンが単離された。加えて、プラスミドｐｃＥＸ
Ｖ-8-30-84及びｐＳＶＬ-11をＬｔｋ-細胞内に導入する
ことにより、該細胞内でヒト５−ＨＴ1D受容体が発現さ
れた。コードされた該タンパクの薬理学的結合特性が決
定され、これら結合特性によって、該タンパクはセロト
ニン５−ＨＴ1D受容体として分類された。これら５−Ｈ
Ｔ1D受容体を細胞表面に発現するヒト哺乳動物細胞ライ
ンが構築され、これら５−ＨＴ1D受容体を研究するため
の良好に定義された培養細胞ラインが初めて確立され
た。
【００８３】以下に記載する実験の詳細を参照すること
によって、本発明はより良く理解されるであろう。しか
し、当業者は、個々の詳細に記述された実験が、後述の
特許請求の範囲に完全に記載される本発明の単なる例示
であることを容易に認識するであろう。
【００８４】実験の詳細 イヌＲＤＣ４遺伝子の分離 イヌＲＤＣ４遺伝子（Libert et al. Science 244: 569
-572, 1989）をヒト５−ＨＴ1D遺伝子のためのクローン
を単離するための前提として分離した。このＲＤＣ４遺
伝子はＲＤＣ４遺伝子の大きい細胞質ループに対し相補
的なオリゴヌクレオチドプローブを有するイヌゲノムラ
イブラリー（Stratagene）からクローンを分離すること
により得られた。イヌＲＤＣ４配列に対し相補的なオー
バーラッピングオリゴマー（ＧｅｎＢａｎｋ、索引番
号：Ｘ１４０４９）をＤＮＡポリメラーゼの大きい分画
で合成することにより32Ｐ−ｄＡＴＰおよび32Ｐ−ｄＣ
ＴＰでラベリングした（Maniatis等, Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor, 1982）。プローブに対し陽性
的ハイブリダイゼーションを示すクローンを取り上げ、
プラスミドｐＵＣ−１８にインサートサブクローニング
した（Pharmacia, Piscataway, N.J.）。サンガー・ジ
デオキシ法を介して配列することにより、この遺伝子の
全コード区域を含むクローンの単離が確認された。
【００８５】２つのヒト５−ＨＴ 1D ゲノムクローンの単
離 ヒト胎盤ゲノムライブラリー（Stratagene）を、イヌＲ
ＤＣ−４クローンから得た１．３−キロ塩基（ｋｂ）の
Ｈｉｎｄ III−Ｓｐｈ Ｉ分画でスクリーニングし
た。このプローブをランダムプライミングの方法（A.P.
FeinbergおよびB. Vogelstein, Anal. Biochem. 137:
266 (1984)）により32Ｐでラベリングした。ハイブリダ
イゼーションは、ホルムアミド５０％、硫酸デキストラ
ン１０％、５Ｘ ＳＳＣ（１Ｘ ＳＳＣは０．１５Ｍ塩
化ナトリウム、０．０１５Ｍくえん酸ナトリウム）、１
Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ´ｓ（０．０２％ポリビニル−ピ
ロリドン、０．０２％フィコール、０．０２％ウシ血清
アルブミン）、および音波処理サケ精子ＤＮＡ２００μ
ｇ／ｍｌを含む溶液中で、４０℃で行った。フィルタ
を、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む
０．１Ｘ ＳＳＣ中で５０℃で洗浄し、強化スクリーン
の存在下で−７０℃でコダックＸＡＲフィルムに露出さ
せた。プローブにハイブリダイズするラムダファージを
プラーク精製し、ＤＮＡをサザンブロッキング分析（Ma
niatis等、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1
982; E. Southern, J. Mol.Biol. 98:503, 1975）のた
めにつくった。サブクロニーングおよび更なるサザンブ
ロッキング分析のため、ＤＮＡをｐＵＣ１８に挿入し
た。
【００８６】ｃＤＮＡクローンの単離 ヒト海馬のｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）をイヌ
ＲＤＣ４配列（図６のＲＤＣ４配列のアミノ酸位置番号
１６５−１８８に相当し、膜内外区域ＩＶ内にある）か
ら得られたオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニン
グした。オーバーラッピングオリゴマーを上述のように
32Ｐ−ｄＡＴＰおよび32Ｐ−ｄＣＴＰでラベリングし、
そのハイブリダイゼーションおよび洗浄をゲノムクロー
ンのために上述のように行った。
【００８７】ＤＮＡ配列 ヌクレオチド配列分析を、サンガー（Sanger）ジデオキ
シヌクレオチド・チェーン−ターミネーション法（S.Sa
nger等、Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463-5467, 197
7）により、変性二本鎖プラスミドテンプレート（Chen
およびSeeburg,DNA 4: 165, 1985）上にてスクェナーゼ
（U.S. Biochemical Corlp., Cleveland, Ohio）を用い
て行った。
【００８８】 3 Ｈ−５ＨＴ結合分析 3 Ｈ−５ＨＴ（２０．８−２８４Ｃｉ／ｍＭｏｌ；デュ
ポン，ＮＥＮ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を放射リ
ガンドとして使用し、一過的または安定的にトランスフ
ェクトした細胞ラインから分離した膜分画における５−
ＨＴ遺伝子生成物の発現を検出した（発現参照）。培養
緩衝液は５０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．４，１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％アスコルビ
ン酸および０．１ｍＭ パルギリンを含んでいた。培養
は、２５０μｌの最終量に3Ｈ−５ＨＴ（最終濃度：１
０-4ないし１０-5Ｍ）を含むものを収容した９６穴マイ
クロ滴定プレートに細胞膜（１穴当たり１０−５０μ
ｇ）を加えることにより開始した。３７℃（暗室）で１
５時間保持したのち、培養をブランデル・セル・ハーベ
スタ（型４８Ｒ；Brandel, Gaithersville, MD）を用い
て急速濾過により停止させた。非特異的結合を規定する
ため１０-5Ｍ５−ＨＴを用いることにより、全体の結合
に対し７０−８０％の特異的結合が現れた。競合研究の
ため、薬剤を最初に５−ＨＴ1D受容体結合についての報
告されたＫi値に対し１−１０Ｘの濃度でスクリーニン
グした。ＧＦ／Ｂフィルターストリップに捕捉された放
射能はレディセイフ液体シンチレーションカクテル（Be
ckman Instruments, Fullerton,CA）を用い、ベックマ
ンＬＳ５０００ＴＡシンチレーションカウンター中で液
体シンチレーションスペクトロスコピーにより、効率５
０−５５％で定量した。
【００８９】実験の結果 ５−ＨＴ 1D 受容体をコードするゲノムおよびｃＤＮＡの
単離 イヌＲＤＣ−４クローンから取出された１．３ｋｂ Ｈ
ｉｎｄ III−ＳｐｈＩ制限分画を用いヒトゲノム胎盤
ライブラリーをスクリニーングした。全部で５つのヒト
クローンを単離し、制限エンドヌクレアーゼマッピング
およびＤＮＡ配列分析により特徴づけた。この制限分析
により５つのクローンの全部が異なるものと判定され
た。配列分析により２つのクローン、ゲノムクローンｈ
Ｐ−８（ヒト胎盤−８）およびゲノムクローンｈＰ−８
４はヌクレオチドレベル（約９０％）でイヌＲＤＣ４に
対し高い相同を示した。配列分析に従い、ゲノムクロー
ンｈＰ−８が、５´非翻訳化（５´ＵＴ）区域、アミノ
（ＮＨ2）末端、およびイヌＲＤＣ４のヒト相同を表し
ているものと思われる受容体の膜内外区域I-III（ＴＭ
I-III）をコード化した配列を含むことが分かった。
ゲノムクローンｈＰ−８４はＴＭ Ｖ−VIIに相当する
配列およびカルボキシ末端、この遺伝子の３´ＵＴを含
んでいた。膜内外区域IVＨＡ第３のクローン、ゲノムク
ローンｈＰ−３０に存在することが見出だされた。これ
らの３つのゲノムクローンは集団的に遺伝子のコード化
区域全体に跨がっており、ＲＤＣ４のヒトバージョンを
表している。この新規なヒト受容体のための遺伝子は遺
伝子８−３０−８４と命名された。この遺伝子８−３０
−８４に相当するｃＤＮＡクローンがヒト海馬ライブラ
リー（Stratagene）から分離されｃＤＮＡクローンｈＨ
−１３（ヒト海馬−１３）およびｃＤＮＡクローンｈＨ
−４６（図１）と命名された。ｃＤＮＡクローンｈＨ−
１３およびｈＨ−４６は集団的にこの遺伝子のコード化
区域全体に跨がっている。
【００９０】さらに２つのゲノムクローン、クローンｈ
Ｈ−１０およびクローンｈＨ−１１も分離され、特徴づ
けられた。これら双方のクローンは、ヌクレオチドレベ
ルではクローンＲＤＣ４に対し相同であったが、これら
の相同はそれほど強くはない（クローン８および８４の
約９０％に対し約７５％）。ゲノムクローンｈＰ−１０
はヒトＲＤＣ４受容体遺伝子（遺伝子８−３０−８４）
の疑似遺伝子を表していることが見出だされたが、ゲノ
ムクローンｈＰ−１１は、コード化区域で無介在配列で
あり、遺伝子８−３０−８４（図２）とは異なる遺伝子
（遺伝子１１）をコード化するゲノム構造を示した。
【００９１】ヌクレオチド配列および遺伝子８−３０−
８４（５−ＨＴ 1D-1 遺伝子）の推定されたアミノ酸配列 遺伝子８−３０−８４から得られたＤＮＡ配列情報が図
３に示されいる。位置１におけるＡＴＧ開始コードンか
ら位置１１３１における停止コードンへ延びるオープン
リーディングフレームは長さ３７６アミノ酸のたんぱく
質（ペプチド８−３０−８４）で相対分子質量（Ｍr）
４１，７８３を有するものをコード化することができ
る。このたんぱく質配列を前に特徴づけた神経伝達物質
受容体と比較すると、遺伝子８−３０−８４は、脂質複
層を７回跨がりグアニンヌクレオチド調節タンパク質
（Ｇたんぱく質−結合受容体ファミリー）に結合する分
子群の新規なメンバーである受容体をコード化すること
を示している。このファミリーに不変である種々の構造
的特徴がペプチド８−３０−８４に見られる。見出ださ
れた最も高い相同はペプチド８−３０−８４、イヌＲＤ
Ｃ−４受容体、５−ＨＴ 1A受容体の間に見られた。ペプ
チド８−３０−８４をイヌＲＤＣ４配列と比較したもの
を図５に示す。この図５は７つの膜内外スパニングドメ
イン中に組織化された受容体構造のモデルを表してい
る。全体として、イヌＲＤＣ４配列とヒトペプチド８−
３０−８４との間の８７％の配列維持が３７８アミノ酸
について観察された。イヌＲＤＣ４配列とヒトペプチド
８−３０−８４たんぱく質配列との間の最も大きい分岐
は細胞外アミノ末端で見られ、大きい細胞質ループがＴ
Ｍ−ＶとＴＭ−ＶＩとの間に見られた。膜内外区域内の
みのこれら２つの受容体の間の相同は９２％であり、Ｔ
Ｍ−Ｉが最大の分岐であった。
【００９２】ヌクレオチド配列および遺伝子１１（５−
ＨＴ 1D-2 遺伝子）の推定されたアミノ酸配列 遺伝子１１から得られたＤＮＡ配列情報を図４に示す。
位置１におけるＡＴＧ開始コードンから位置１１９８に
おける停止コードンへ延びるオープンリーディングフレ
ームは長さ３９８アミノ酸のたんぱく質（ペプチド１
１）で相対分子質量（Ｍr）４４，３３３を有するもの
をコード化することができる。このたんぱく質配列を前
に特徴づけた神経伝達物質受容体と比較すると、遺伝子
１１生成物も又Ｇたんぱく質−結合受容体ファミリーの
新規なメンバーであることを示した。相同プロフィール
は遺伝子１１（ペプチド１１）によりコード化された受
容体が遺伝子８−３０−８４（ペプチド８−３０−８
４）およびイヌＲＤＣ４遺伝子によりコード化された受
容体と深く関連するが、別のものであり、５ＨＴ1A受容
体がペプチド１１に相同する第２番目に近い受容体であ
ることを示している。ペプチド８−３０−８４とペプチ
ド１１との間の全体的アミノ酸相同は５６％であり、膜
内外区域のみでは７６％のアミノ酸相同が認められる。
アミノ末端には相同は実質的に存在しない。僅かな相同
がＴＭ−ＶとＴＭ−ＶＩとの間の大きい細胞質ループお
よびカルボキシル末端に見られた。膜内外スパニングド
メインの最も大きい分岐はＴＭ−１であり、これはペプ
チド８−３０−８４とペプチド１１との間に僅か５４％
対応するに過ぎない。ＴＭ−１には４つのアミノ酸の広
がりが存在するが、これはペプチド８−３０−８４とペ
プチド１１との間、およびイヌＲＤＣ４たんぱく質生成
物に等しい。これらのアミノ酸の配列はセリン（Ｓ）、
アスアラギン、アラニン（Ａ）およびフェニルアラニン
（Ｆ）であり、”ＳＮＡＦ”として略称することができ
る。この配列はこの受容体のサブファミリーにとって特
異である。なぜならば、これは種々のＧーたんぱく質結
合受容体中のこのＴＭ−１位置に存在する保護された配
列から分岐しているからである。
【００９３】トランスフェクトされた哺乳動物細胞にお
ける受容体の発現 新たに単離された遺伝子の機能的同一性を確認するた
め、培養細胞ライン中にクローンＲＤＣ４およびｈＰ−
１１を表した。各クローンのコード区域全体を含むＤＮ
Ａ分画を発現ベクトルｐＳＶＬにサブクローン化した。
得られたプラスミド、ｐｃＥＸＶ−８−３０−８４およ
びｐＳＶＬ−１１をＤＥＡＥ−デキストラン実験記録
（Cullen、 Methods in Enz. 152: 684-704, 1987）を用
いて一過的にＣｏｓ−７細胞に導入した。
【００９４】バクテリア遺伝子アミノグリコシドホスフ
トランスファーゼを含むプラスミドをＬｔｋ−細胞（Am
erican Type Culture Collection, Rockvill, MD, Cell
Line CCL 1,3）に、カルシュームホスフェート法（Spe
cialty Media, Inc. Lavallette, NJから得られたプロ
トコールおよびキット）を用いコトランスフェクトする
ことにより安定な細胞ラインを作った。アミノグリコシ
ドホスフトランスファーゼを表すクローンを培養媒体に
１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Gibco Laboratories, Grand
Island, NY）を加えることにより選択した。これらクロ
ーンにおいて５−ＨＴ1D受容体遺伝子発現をモニターす
るため3Ｈ−５ＨＴを用いた。3Ｈ−５ＨＴが５−Ｈ
Ｔ1A、５−ＨＴ1Bおよび５−ＨＴ1C受容体に結合し得る
ため、マスキングリガンドピンドロール（１μＭ）およ
びＳＣＨ２３３９０（１μＭ）を培養に含めた。
【００９５】Ｃｏｓ−７細胞またはＬｔｋ−細胞を、リ
ガンド結合の内生レベルを評価するためインサートを含
まないベクトルで疑似トランスフェクトした。２ｎＭ放
射リガンドにおいて、特異的結合は検出されなかった。
したがって、Ｃｏｓ−７細胞およびＬｔｋ−細胞は推定
５−ＨＴ1D受容体のトランスフェクションのための有用
なモデルを提供する。一過的にトランスフェクされたＣ
ｏｓ−７細胞は3Ｈ−５ＨＴを高い親和性（３ｎＭ）お
よび推定部位密度（ＲＤＣ４については０．６３−１．
２８ｐｍｏｌｅ／ｍｇたんぱく質、ペプチド１１につい
ては０．６０２−０．９５ｐｍｏｌｅ／ｍｇたんぱく
質）で結合した。マスキングリガンドピンドロールおよ
びＳＣＨ２３３９０の存在は、最初の研究において特異
的結合に対しまたは検出された結合部位の薬理学的特性
に対し有意な効果を与えなかった。従って、後の実験で
は省かれた。
【００９６】ＲＤＣ４、遺伝子８−３０−８４または遺
伝子１１でトランスフェクトされたＬｔｋ−細胞は3Ｈ
−５ＨＴを高い親和性（Ｋd＝３．６ｎＭ、４．０ｎ
Ｍ、または２．３ｎＭ、）で結合した。推定ＢmaxはＲ
ＤＣ４については０．２７５ｐｍｏｌｅ／ｍｇたんぱく
質、遺伝子８−３０−８４については５．１ｐｍｏｌｅ
／ｍｇたんぱく質、ペプチド１１については２．３ｐｍ
ｏｌｅ／ｍｇたんぱく質に等しい。さらなる特徴は一連
の薬剤についての競合実験を行うことにより達成され
た。この競合データの分析はコンピュータ補助ノンリニ
ヤ・リグレッション・プログラム・アキュコンプ（Lund
on Software; Chagrin Falls, OH）を用いることにより
達成された。データを表１に示すようにＲＤＣ４、遺伝
子８−３０−８４または遺伝子１１トランスフェクショ
ン細胞に検出された結合は５−ＨＴ1受容体について予
測された特性を有する。さらに、これらの２つの受容体
についての一連の競合体の親和性についての違いは、Ｒ
ＤＣ４、ヒト遺伝子、遺伝子８−３０−８４または遺伝
子１１が５−ＨＴ1D受容体の結合特性を有するたんぱく
質をコード化することを示し、したがって、５−ＨＴ1D
受容体の少なくとも２つのサブタイプの存在を明らかに
している。
【００９７】
【表１−１】
【００９８】
【表１−２】
【００９９】
【表１−３】
【０１００】予測平衡解離定数（ｎＭでのＫ1値）は、
指示された置換化合物についてのＣｈｅｎｇ−Ｐｕｓｏ
ｆｆ関係式から計算された。結合実験は指示されたクロ
ーンで安定的にトランスフェクションされたＬＭ（ｔｋ
−）細胞からつくられた細胞膜上で行われた。 ａ −−Waeber, C., Schoeffter, P., Hoyer, D., Pal
acios, J.M. Neurochem. Res., 15: 567-582, 1990. b −−Herrick-Davis, K., Titeler, M., Leonhardt,
S., Struble, R., Price, D.J. Neurochem. 51: 1906-1
912, 1988. c −−Peroutka, S.J., Switzer, J.A., Hamik, A. Sy
napse,3: 61-66, 1989. N.D.−−判定出来ない。
【０１０１】考察 本発明者は２つのＤＮＡ分子コード化ヒト５−ＨＴ1D受
容体をクローン化し、特徴づけた。Ｃｏｓ−７細胞およ
びＬｔｋ−細胞におけるこれらのｃＤＮＡクローンの表
現は細胞表面においてこの種の受容体の様相をもたらし
た。
【０１０２】この研究の出発点はイヌクローンＲＤＣ４
であり、これは最初にＬｉｂｅｒｔ等（Science 244: 5
69, 1989）により、ＰＣＲ手法によりクローン化された
Ｇ−たんぱく結合受容体のコレクションの一部として報
告された。Strader, SigalおよびDixon（FASEB J. 3: 1
825 (1989)）のモデルに従ってヌクレオチド配列を分析
したところ、ＲＤＣ４は５−ＨＴ受容体でありうること
が示された。さらにＲＤＣ４はヒトセロトニン５−ＨＴ
1A配列（Libert等、1989）に対し最も高い配列相同であ
ることを示した。このＲＤＣ４配列を我々の実験室でイ
ヌゲノムライブラリーから分離し、哺乳動物細胞ライン
にトランスフェクトした。このクローンにおける表現デ
ータは従来報告されていない。
【０１０３】ＲＤＣ４トランスフェクションＣｏｓ−７
細胞およびＬｔｋ−細胞は［3Ｈ］５−ＨＴを明らかに
高い親和力を以て結合することが見出だされた（ＫD＝
３ｎＭ；Ｂｍａｘ＝０．２５−０．４ｐｍ／ｍｇたんぱ
く）。この特性はＲＤＣ４が５−ＨＴ1受容体をコード
化しうることを示している。高い親和力の3Ｈ５−ＨＴ
は（−）ピンドロール（１μｍ）で共培養しても影響を
受けない。これは結合が５−ＨＴ1Aまたは５−ＨＴ1B受
容体に対してである可能性を否定するものである。さら
に５−ＨＴ1C拮抗ＳＣＨ 23390（１μｍ）も3Ｈ５−Ｈ
Ｔの結合性を減少させるのには効果的でない。3Ｈ５−
ＨＴ結合部位について競合しえない他の化合物はケタン
セリン（５−ＨＴ2受容体）、ＩＣＳ２０５−９３０
（５−ＨＴ3および５−ＨＴ4）および６−ＯＨ−インダ
ルピン（５−ＨＴ1P）である。さらに、この結合部位に
ついての高い親和力は結合が５−ＨＴ1E受容体に対して
である可能性を否定するものである。ＲＤＣ４とクロー
ン化ヒト遺伝子８−３０−８４との間の強い配列相同は
ヒト遺伝子が哺乳動物細胞ラインにトランスフェクトさ
れたとき極めて類似した薬理学的特性を示すことを示唆
している。また、これは実証された（表１参照）。
【０１０４】ＲＤＣ４はさらに第２のヒト遺伝子、遺伝
子１１をクローン化するのに用いられた。この遺伝子は
Ｃｏｓ−７細胞において一過性的に、またＬｔｋ−細胞
において安定細胞ラインとして配列され、表現された。
ＲＤＣ４クローンの場合と同様に遺伝子１１−トランス
フェクション細胞は高い親和力を以て3Ｈ５−ＨＴを結
合すること、および５−ＨＴ1A、５−ＨＴ1B、５−ＨＴ
1C、５−ＨＴ2、５−ＨＴ3または５−ＨＴ4受容体につ
いて親和性を有する化合物に対し感応しないことが見出
だされた。さらに、遺伝子１１−トランスフェクション
細胞に対する結合のため、［3Ｈ］５−ＨＴと競合する
低濃度の５−ＣＴの能力は、この遺伝子が５−ＨＴ1Pま
たは５−ＨＴ1E受容体をコード化する可能性を除外する
ものである。薬理学的特性が表１に示されている。これ
らのデータは５−ＨＴ1D受容体をコード化する遺伝子１
１の特徴と一致する。
【０１０５】表１は、ＲＤＣ４（及びペプチド８−３０
−８４）およびペプチド１１が双方ともが５−ＨＴ1D受
容体として分類できるが、これらは薬理学的および構造
的にまったく別のものであることを立証している。これ
らのデータはヒト５−ＨＴ1D結合部位が単一の受容体で
なく、受容体の群を構成していることを最初に立証する
ものである。限局化および薬理学の点で潜在的に異なる
ことは、将来においてこれらの５−ＨＴ1D受容体部位の
各々を選択的に活性化または抑制するための強力な新規
な薬剤の開発のために利用しうる。
【０１０６】本発明者は異なる薬理学的特性を有する２
つのヒト５−ＨＴ1Dをクローン化した。これは５−ＨＴ
1D受容体が単一のたんぱく質でなく、受容体の群を構成
していること示している。ヒトの脳において、５−ＨＴ
1D受容体は、前頭皮質、果核、尾状核、双方の淡そう球
および黒質において最も強い発現を有する。より少量の
ものは縫線核、海馬および側座の見出だされる。５−Ｈ
Ｔ1D受容体は、疾病的重要な多くの状態に関連してい
る。例えば偏頭痛、食欲、運動制御、苦悶、痴呆症に関
連する。５−ＨＴ1D拮抗剤、例えばスマトリプタンは現
在、試験中である。我々のデータによれば５−ＨＴ1D受
容体に多くのサブタイプがあり、新たな薬剤の発見に道
を開いている。これらの５−ＨＴ1D受容体のサブタイプ
における薬理学的特性の違いがそれらの限局化の違いと
相俟って、これらサブタイプについて異なる感応性を有
するより選択性を有する治療薬の開発につながるものと
考えられる。
【０１０７】クローン化ラット５−ＨＴ 1B 受容体の薬理
学的特性に関連する実験データ：クローン化５−ＨＴ 1D
受容体との関連 ５−ＨＴ1Bおよび５−ＨＴ1D受容体は薬理学、第２メッ
センジャー結合、細胞学的分布において類似性を示す。
この密接な関係により、これらの受容体が種相同である
とする提案をもたらしている。ラット、マウス（フクロ
ネズミ）は５−ＨＴ1B受容体を表し、ヒト、イヌ、ウ
シ、モルモットのような他の種は５−ＨＴ 1D受容体を表
している（HoyerおよびMiddlemiss, 1989）。５−ＨＴ
1D受容体についての最近のクローニングにおいて、分子
クローニング手法を用いこれら２つの受容体の関係を直
接評価することができる（Branchek等、1990）。５−Ｈ
Ｔ1D遺伝子の推定ラット相同を分離するため、ラットラ
イブラリーをヒト５−ＨＴ1D配列をプローブとして用い
高い厳格性をもってスクリーニングした。強いハイブリ
ダイゼーション信号を研究のため選択し、サブクローニ
ングし一過性的に哺乳動物細胞ライン（Ｃｏｓ−７）に
トランスフェクトした。この受容体の薬理学的特性を識
別するためラジオリガンド結合評価をこのトランスフェ
クトされた細胞から得られた膜分画について行った。な
お、［3Ｈ］５−ＨＴおよび［125Ｉ］ヨードシアノピン
ンドロール（内生β−アドレネルギン受容体を阻止する
ため、３μＭイソプロテレノールの存在下での
［125Ｉ］Ｉ−ＣＹＰ）をラジオリガンドとして用い
た。［125Ｉ］ヨードシアノピンンドロールはトランス
フェクトされた細胞から得られた膜にサブナノモル親和
性［Ｋd＝０．１６ｎＭ］をもって結合することが見出
だされた。対照的に［3Ｈ］５−ＨＴ結合についての平
衡解離定数は１８．４ｎＭであった。これらの値はヒト
５−ＨＴ1Dクローンを用いて測定したものと著しく対照
的であった（［3Ｈ］５−ＨＴ：Ｋd＝４ｎＭ；
［125Ｉ］Ｉ−ＣＹＰ：１ｎＭでは特異的結合は検出さ
れなかった）。ラウヴォルフィアアルカロイドラウヴォ
ルシンは、ジプロピル−５−カルボキシアミドトリプタ
ミンと同様に、ラット受容体において基本的に不活性で
あった（Ｋi＞１０，０００ｎＭ）。研究された化合物
についての効能の順序は、５−ＨＴ＞（−）プロプラノ
ロール＞５メトキシトリプタミン＞トリプタミン＞ジプ
ロピル−５−カルボキシアミドトリプタミン＝ラウヴォ
ルシンであった。これらのデータは相同によりヒト５−
ＨＴ1D受容体で単離された遺伝子は、５−ＨＴ1B受容体
として識別される薬理学的特性を有するたんぱく質をコ
ード化することを明らかに示している。したがって、こ
れらの受容体は薬理学的に可なり異なる種相同であるよ
うに思える。同様の状況が予めクローン化されたラット
およびヒト５−ＨＴ2受容体についても記述され、高い
て相同を有することが示されている（Hartig等、199
0）。しかし、５−ＨＴ1B受容体／５−ＨＴ1D受容体の
薬理学的特性の相違は、ラット５−ＨＴ2受容体／ヒト
５−ＨＴ2受容体の場合より激しいことが示されてい
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 遺伝子５−ＨＴ1D（遺伝子 8-30-84）を表わ
すｃＤＮＡクローン類。ラムダＺapIIベクター中の組換
体を略１０6個スクリーニングすることにより、ヒト海
馬（human hippocampus;ｈＨ）ライブラリーから二つの
ｃＤＮＡクローンが単離された。クローンｈＨ-13及び
ｈＨ-46は、遺伝子５−ＨＴ1D-1の全コード領域に広が
っていた。７つの推定されるα螺旋状のメンブランスパ
ンニングドメイン(membrane-spanning domain)（ＴＭ−
１〜ＴＭ−７）が示され、細胞外ループ（o1〜o4）およ
び細胞内ループ（i1〜i4）によって分離されている。
【図２】 遺伝子５−ＨＴ1D-2（遺伝子１１）の制限地
図。略15キロ塩基のヒトゲノムＤＮＡを含んだクローン
ｈＰ-11が、ラムダFix IIヒト胎盤（ｈＰ）ゲノムライ
ブラリー（Stratagene）からの略２×１０6個の組換体
を、1.3 kbのHindIII-Sph-I イヌＲＤＣ４プローブでス
クリーニングすることにより得られた。推定アミノ酸配
列をもった７つの推定されるα螺旋状のメンブランスパ
ンニングドメイン（ＴＭ−１〜ＴＭ−７）が下に示さ
れ、細胞外ループ（o1〜o4）および細胞内ループ（i1〜
i4）によって分離されている。制限部位が示されてい
る。
【図３−１】 遺伝子５−ＨＴ1D-1（遺伝子 8-30-84）
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオ
チド配列上の数字はヌクレオチド位置を示す。ＤＮＡ配
列は、酵素シーケナーゼを用いて、変性二重鎖プラスミ
ド鋳型上でのサンガー等のチェインターミネーション法
によって決定された。長い開放された読みフレームの推
定アミノ酸配列（１文字コード）が示されている。図３
に示したｃＤＮＡ配列を有するプラスミドが構築され、
ｐｃＥＸＶ-8-30-84と命名された。このプラスミドｐｃ
ＥＸＶ-8-30-84は、1990年４月17日に第40790号のＡＴ
ＣＣ受付け番号で、特許手続きのための微生物の寄託の
国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、ア
メリカ合衆国 20852メリーランド州ロックウイル 12301
パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の特許培養寄託
部に寄託された。
【図３−２】 遺伝子５−ＨＴ1D-1（遺伝子 8-30-84）
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオ
チド配列上の数字はヌクレオチド位置を示す。ＤＮＡ配
列は、酵素シーケナーゼを用いて、変性二重鎖プラスミ
ド鋳型上でのサンガー等のチェインターミネーション法
によって決定された。長い開放された読みフレームの推
定アミノ酸配列（１文字コード）が示されている。図３
に示したｃＤＮＡ配列を有するプラスミドが構築され、
ｐｃＥＸＶ-8-30-84と命名された。このプラスミドｐｃ
ＥＸＶ-8-30-84は、1990年４月17日に第40790号のＡＴ
ＣＣ受付け番号で、特許手続きのための微生物の寄託の
国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、ア
メリカ合衆国 20852メリーランド州ロックウイル 12301
パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の特許培養寄託
部に寄託された。
【図４−１】 遺伝子５−ＨＴ1D-2（遺伝子１１）のヌ
クレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオチド
配列上の数字はヌクレオチド位置を示す。ＤＮＡ配列
は、酵素シーケナーゼを用いて、変性二重鎖プラスミド
鋳型上でのサンガー等のチェインターミネーション法に
よって決定された。長い開放された読みフレームの推定
アミノ酸配列（１文字コード）が示されている。図４に
示すｃＤＮＡ配列をもったプラスミドが構築され、ｐＳ
ＶＬ-11と命名された。このプラスミドｐＳＶＬ-11は、
1990年４月17日に第40791号のＡＴＣＣ受付け番号で、
特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約の規定に従って、アメリカ合衆国 20852
メイランド州ロックウイル 12301パークローンドライブ
に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）の特許培養寄託部に寄託された。
【図４−２】 遺伝子５−ＨＴ1D-2（遺伝子１１）のヌ
クレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオチド
配列上の数字はヌクレオチド位置を示す。ＤＮＡ配列
は、酵素シーケナーゼを用いて、変性二重鎖プラスミド
鋳型上でのサンガー等のチェインターミネーション法に
よって決定された。長い開放された読みフレームの推定
アミノ酸配列（１文字コード）が示されている。図４に
示すｃＤＮＡ配列をもったプラスミドが構築され、ｐＳ
ＶＬ-11と命名された。このプラスミドｐＳＶＬ-11は、
1990年４月17日に第40791号のＡＴＣＣ受付け番号で、
特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約の規定に従って、アメリカ合衆国 20852
メイランド州ロックウイル 12301パークローンドライブ
に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）の特許培養寄託部に寄託された。
【図５】 遺伝子５−ＨＴ1D-1の推定アミノ酸配列（ペ
プチド 8-30-84）の、７-トランスメンブラン・スパン
ニングモデル。影を付した円内のアミノ酸は、イヌＲＤ
Ｃ４受容体中の対応する位置におけるアミノ酸とは異な
るアミノ酸である。矢印は、Ｎ-結合グリコシレーショ
ンの可能な部位を示している。膜を表わす線を跨いでい
る円内のアミノ酸は、この出願の目的のための膜通過領
域ではないと考えられる。
【図６−１】 ヒト５−ＨＴ1D受容体一次構造と、他の
セロトニン受容体との比較。アミノ酸配列（１文字コー
ド）は相同性を最適化するように並べられている。推定
のトランスメンブラン・スパンニング・ドメインが星印
によって示され、またローマ数字によって同定される
（ＴＭＩ−VII）。
【図６−２】 ヒト５−ＨＴ1D受容体一次構造と、他の
セロトニン受容体との比較。アミノ酸配列（１文字コー
ド）は相同性を最適化するように並べられている。推定
のトランスメンブラン・スパンニング・ドメインが星印
によって示され、またローマ数字によって同定される
（ＴＭＩ−VII）。
【図６−３】 ヒト５−ＨＴ1D受容体一次構造と、他の
セロトニン受容体との比較。アミノ酸配列（１文字コー
ド）は相同性を最適化するように並べられている。推定
のトランスメンブラン・スパンニング・ドメインが星印
によって示され、またローマ数字によって同定される
（ＴＭＩ−VII）。
フロントページの続き (72)発明者 テレーサ・ブランチェック アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07766、ティーネック、マーテンス・アビ ニュー 541 (72)発明者 ポール・アール・ハーティグ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07430、マーワ、リンデン・ストリート 179 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 DA02 EA04 GA11 HA01 4C084 AA17 NA14 ZA082 ZC412

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者の偏頭痛を治療するための薬学的組
    成物であって、許容可能な担体と、ヒト５−ＨＴ１Ｄ受
    容体に選択的に結合し、これを活性化するが、５−ＨＴ
    １Ａ受容体、５−ＨＴ１Ｅ受容体、５−ＨＴ２受容体、
    ５−ＨＴ３受容体、５−ＨＴ４受容体には選択的に結合
    せず、これを活性化しない、前記患者の偏頭痛を治療す
    るのに有効な量の化学物質とを含み、前記ヒト５−ＨＴ
    １Ｄ受容体が、ヒト５−ＨＴ１Ｄ−１受容体およびヒト
    ５−ＨＴ１Ｄ−２受容体からなる群より選択され、前記
    化学物質が、メチルエルゴノビン、エルゴタミン、スマ
    トリプタン、又はピンドロールでない薬学的組成物。
  2. 【請求項２】 患者の偏頭痛を治療するための薬学的組
    成物であって、許容可能な担体と、ヒト５−ＨＴ１Ｄ受
    容体に選択的に結合し、これを活性化するが、他の任意
    のセロトニン受容体には選択的に結合せず、これを活性
    化しない、前記患者の偏頭痛を治療するのに有効な量の
    化学物質とを含み、前記ヒト５−ＨＴ １Ｄ受容体が、ヒ
    ト５−ＨＴ１Ｄ−１受容体およびヒト５−ＨＴ１Ｄ−２
    受容体からなる群より選択され、前記化学物質が、メチ
    ルエルゴノビン、エルゴタミン、スマトリプタン、又は
    ピンドロールでない薬学的組成物。
  3. 【請求項３】 患者の偏頭痛を治療するための薬学的組
    成物であって、許容可能な担体と、ヒト５−ＨＴ
    １Ｄ−１受容体およびヒト５−ＨＴ１Ｄ−２受容体に選
    択的に結合し、これを活性化するが、５−ＨＴ１Ａ受容
    体、５−ＨＴ１Ｅ受容体、５−ＨＴ２受容体、５−ＨＴ
    ３受容体、５−ＨＴ４受容体には選択的に結合せず、こ
    れを活性化しない、前記患者の偏頭痛を治療するのに有
    効な量の化学物質とを含み、前記化学物質が、メチルエ
    ルゴノビン、エルゴタミン、スマトリプタン、又はピン
    ドロールでない薬学的組成物。
  4. 【請求項４】 患者の偏頭痛を治療するための薬学的組
    成物であって、許容可能な担体と、ヒト５−ＨＴ
    １Ｄ−１受容体およびヒト５−ＨＴ１Ｄ−２受容体に選
    択的に結合し、これを活性化するが、他の任意のセロト
    ニン受容体には選択的に結合せず、これを活性化しな
    い、前記患者の偏頭痛を治療するのに有効な量の化学物
    質とを含み、前記化学物質が、メチルエルゴノビン、エ
    ルゴタミン、スマトリプタン、又はピンドロールでない
    薬学的組成物。
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