FI110692B - DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt - Google Patents

DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt Download PDF

Info

Publication number
FI110692B
FI110692B FI925034A FI925034A FI110692B FI 110692 B FI110692 B FI 110692B FI 925034 A FI925034 A FI 925034A FI 925034 A FI925034 A FI 925034A FI 110692 B FI110692 B FI 110692B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
receptor
human
ht1d
cell
chemical compound
Prior art date
Application number
FI925034A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI925034A (fi
FI925034A0 (fi
Inventor
Richard L Weinshank
Theresa Branchek
Paul R Hartig
Original Assignee
Synaptic Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24073787&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI110692(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Synaptic Pharma Corp filed Critical Synaptic Pharma Corp
Publication of FI925034A publication Critical patent/FI925034A/fi
Publication of FI925034A0 publication Critical patent/FI925034A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI110692B publication Critical patent/FI110692B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/82—Subcellular parts of microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 110692 DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt - DNA kodande människo-5-HTXD receptorer och användningen därav 5 Läpi tämän hakemuksen viitataan erilaisiin julkaisuihin, joiden täydet lainaukset ovat suluissa. Näiden julkaisujen esitykset kokonaisuutenaan ovat täten liitetty viitteenä tähän hakemukseen, jotta kuvattaisiin täydellisemmin alan tilaa, johon tämä keksintö kuuluu.
10
Farmakologiset tutkimukset ja viime aikoina geenikloonaus ovat osoittaneet, että on olemassa moninaisia reseptori-alatyyppejä useimmille ellei kaikille neurotransmitte-reille. Moninaisten reseptorialatyyppien olemassaolo an-15 taa mekanismin, jolla yksittäinen neurotransmitteri voi saada esiin selvästi erotettavia soluvasteita. Muuntelu soluvasteessa voidaan saada aikaan yhdistämällä yksittäisiä reseptorialatyyppejä erilaisten G-proteiinien kanssa ja erilaisten signaalisysteemien kanssa. Lisää jousta-20 vuutta saadaan saman ligandin yksittäisten reseptorien kyvyllä aktivoida tai inhiboida sama toinen lähettisys-teemi.
Yksittäiset reseptorialatyypit paljastavat luonteenomai- • · · •••25 set erot niiden kyvyissä sitoa lukuisia ligandeja, mutta : '.· rakenteellista perustaa erillisille ligandia sitoville /./ oiminaisuuksille ei tunneta. Fysiologit ja farmakologit ; ovat yrittäneet määrätä tarkoin joidenkin reseptoriala- tyyppien erityisiä biologisia toimintoja tai anatomisia //30 sijainteja, mutta tällä on ollut niukka menestys. Samalla lailla biologiset mekanismit, joilla nämä reseptorit • · transdusoivat signaaleja yli solupinnan, ovat olleet vai- !./ keitä varmistaa ilman, että olisi hyvin kuvatut solupopu- laatiot, jota ekspressoivat ainoastaan yhtä reseptori-’./.35 alatyyppiä.
I I M I
‘ · Koska serotoniinin tyyppiset reseptorit tunnistavat sero- 2 110692 toniinin, on tunnistettu lukuisia farmakologisesti erillisiä serotoniinireseptorien alatyyppejä ja niille on annettu luokittelunimi 5-HTx, missä X tunnistaa jokaisen a-latyypin. Monissa tapauksissa nämä alatyypit ovat olleet 5 tai liittyvät yhteen yksittäisten geenituotteiden kanssa, mutta joissakin tapauksissa voidaan yksittäisessä alatyypissä havaita olevan useita erilaisia reseptoriproteiine-ja (geenituotteet) tai kahden erilaisen alatyypin voidaan myöhemmin osoittaa nousevan saman reseptoriproteiinin e-10 rilaisista ominaisuuksista, jotka on osoitettu, kun sitä on ekspressoitu erilaisissa kudosympäristöissä. Monissa tapauksissa on osoitettu erilaisten serotoniinireseptorien alatyyppien kytkeytyvän erilaisiin toisen lähetin reitteihin, jotka ovat liittyneet guaniini-nukleotidisää-15 telyproteiinien (G) kautta.
Radioligandisuodatus-sitomistekniikkoja on käytetty yli 10 vuotta yrityksenä karakterisoida täydellisemmin resep-torialatyyppejä serotoniinireseptoriperheessä (Schmidt ja 20 Peroutka, FASED J. 3:2242 (1989)). Käyttämällä näitä me netelmiä on kuvattu kaksi selvää G-proteiini-kytkeytynyttä serotoniini-reseptorien luokkaa, 5-HTi ja 5-HT2. Nämä eroavat niiden lääkeselektiivisyydessään. 5-HTjL-resepto-reilla on korkea (nmol) affiniteetti serotoniiniin ja •25 voidaan leimata [3H]5-HT: llä. 5-HTa-reseptoreilla on pieni • * · · affiniteetti serotoniinille, mutta niillä on korkea affi-,···. niteetti antagonisteille, kuten Ketanseriini, Mesulergi- ne, Metergoline ja d-LSD.
;3° 5-HTi-reseptoriluokassa on erotettu lukuisia alatyyppejä • · niiden farmakologisten sitomisprofiilien, toisen lähetti-kytkennän ja fysiologisten osien perusteella. Yksi sel-lainen alatyyppi, 5-HT1D-reseptori kuvattiin alunperin / : [3H]5-HT-sitomiskohdan erityiseksi tyypiksi naudan cauda- ,·,35 tuksessa(Heuring ja Peroutka, J. Neurosci. 7:894 (1987)).
’ Tämä kuvaus ei perustunut yksittäisen puhdistetun resep- , toriproteiinin tai yksittäisen geenituotteen ominaisuuk-
i I ft 4 I
3 Ί10692 siin, vaan perustui mieluummin kokeellisiin havaintoihin mallikudoksessa. Kuten alla keskustellaan, myöhempi tutkimus on osoittanut, että tässä mallikudoksessa voi olla moninaisia reseptoriproteiineja (tunnettu alatyyppeinä), 5 joista kaikki myötävaikuttavat sitomisprofiiliin, jota käytettiin kuvaamaan 5-HT1D-reseptoria.
5-HTID-reseptorin alatyypin on osoitettu inhiboivan ade-nylaattisyklaasi-aktiivisuutta (Schoeffter, P. ja Hoyer, 10 D., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 340:285 (19- 89)). 5-HT1D-reseptorin alatyyppi on karakterisoitu marsussa (Waeber, et ai. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 340:479-485 (1989), kyyhkysessä (Waeber, 1989, siassa (Waeber, et ai. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 15 377:595-601 (1988), vasikassa (Waeber, et ai. (1988)) ja ihmisen aivoissa (Waeber, et ai. (1988); Herrick-Davis ja Titeler, J. Neurochem., 50:1624-1631 (1988)). Muista se-rotoniinireseptorialatyypeistä 5-HT1A- ja 5-HT1B-reseptorit inhiboivat adenylaattisyklaasia ja 5-HTlc- ja 5-HT2-resep-20 torit aktivoivat fosfolipaasi C-reittejä stimuloiden po- lyfosfoinositidien hajoamista (Schmidt ja Peroutka, FASED J. 3:2242 (1989)).
Sumatripaanin (GR43175), uusi migreeniä vastaan oleva ;25 lääkitys, jota Glaxo Pharmaceutical Corp. kehittää, far- ; makologiset vaikutukset on liitetty 5-HT1D-reseptorikoh- taan (Peroutka ja McCarthy, Eur. J. Pharmacology 163:133 - (1989)); Schoeffter ja Hoyer, Naunyn-Schmiedeberg Arch.
! Pharmacol. 340:135 (1989)). Äskettäin eräs raportti on ;.,30 osoittanut, että porsaiden caudatuksen 5-HT1D-sitomiskohta ·’ 1 voitaisiin jakaa kahden kohdan alaosastoon perustuen su- matriptaanin ja 5-karboksiamidotryptamiinin (5-CT) sito- « 1 . : misaffiniteetteihin (Sumner ja Humphrey, Br. J. Pharma- » »· : col. 98:29 (1989)). Yksi näistä sitomiskohdista, jolla on \ 35 alhainen sumatriptaani- ja 5-CT-affiniteetti, muistuttaa ihmisen aivokuoren 5-HT1E-kohtaa (Leonhardt, Herrick-Davis . ja Titeler, J. Neurochem. 53:465 (1989)), kun taas sito- > 1 · j » 4 110692 miskohta, jolla on korkea affiniteetti näille yhdisteille, muistuttaa klassista 5-HT1D-reseptoria ja sumatriptaa-nin toimintakohtaa.
5 Eräs toinen tutkimus, Xiong ja Nelson (Life Sei. 45:1433- 1442 (1989)) osoitti, että korkean affiniteetin [3H]5-HT-sitomiskohta kanin caudatuksessa, rajasi 5-HT1B-sitomis-kohtaa, on samanlainen kuin, mutta farmakologisesti erilainen kuin, 5-HT1D-sitomiskohta, joka kuvattiin naudan 10 caudatuksessa. Nämä kirjottajät esittivät materiaalia, joka osoitti että kahdella lääkkeellä, spiperonilla ja spirileenilla, on merkittävästi alempi affiniteetti 5-HT1B-sitomiskohdalle kuin 5-HT1D-reseptorille ja kiinnittivät huomiota useisiin muihin eroihin sitomisominaisuuk-15 sissa näiden kohtien välillä. Naudan caudatuksen tutkimi nen näiden havaintojen valossa johti johtopäätöksiin, että naudan caudatuksessa voi olla 5-HT1D-reseptorin komponentti, joka edustaa 5-HT1B-sitomiskohtaa. Vaihtoehtoisesti, kirjoittajat spekuloivat siitä että 5-HT1D-sitomiskoh-20 ta naudan caudatuksessa voi olla kohtien, joilla on sa manlaiset ominaisuudet, heterogeeninen ryhmä. Kuten kirjoittajat panevat merkille, on selvää että tarvitaan lisätyötä selvittämään nämä kysymykset.
:25 Libert et ai. eristivät äskettäin G-proteiinikytketyn reseptorin koiran cDNA-kirjastosta (Science 244:569-572, i 1989). Tätä geeniä, jota kutsutaan RDC4-geeniksi, eivät i t # : nämä kirjoittaneet ekspressoineet ja siksi ei tämän gee- * * ! nin koodaaman proteiinin ominaisuuksista tehty karakte- ‘ f i ’,,.30 risoinita. Hakijat eristivät ja ekspressoivat koiran ‘ ’ RDC4-geeniä ja hakijat määrittivät sen koodaavan 5-HT1D- reseptoria (ei julkaistu).
» « I * * : Serotoniini 5-HTlD-reseptorit kuuluvat reseptorien perhee- ,35 seen, jotka erotetaan niiden seitsen-transmembraani-kon- .figuraatiosta ja niiden toiminnallisesta liittymästä G-proteiineihin. Tähän perheeseen kuuluvat rodopsiini ja » » 5 110692 sen sukuiset opsiinit (Nathans, J. ja Hogness, D.S., Cell 34:807 (1983)), a- ja β-adrenergiset reseptorit (Dohlman, H.G., et al., Biochemistry 26:2657 (1987)), muskariiniko-linergiset reseptorit (Bonner, T.I., et al., Science 237: 5 527 (1987)), aine K neuropeptidireseptori (Masu, Y., et al., Nature 329:836 (1987)), hiivan parittelutekijäresep-torit (Burkholder, A.C. ja Hartwell, L.H., Nucl. Acids Res 13:8463 (1985); Hagan, D.C., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83:1418 (1986)); Nakayama, N. et al., EMBO 10 J. 4:2643 (1985) ja onkogeeni c-mas (Young, et al., Cell 45:711 (1986)). Jokaisen näistä reseptoreista on ajateltu transdusoivan solunulkoisia signaaleja olemalla vuorovaikutuksessa guaniini-nukleotidisitomis- (G) proteiinien kanssa (Dohlman, H.G., et al., Biochemistry 26:2657 (19-15 87); Dohlman, H.G., et al., Biochemistry 27:1813 (1988); O'Dowd, B.F., et al., Ann. Rev. Neurosci., (painossa).
Tämä keksintö antaa eristetyn nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria.
20 Tämä keksintö antaa myös eristetyn proteiinin, joka on ihmisen 5-HT1D-reseptori.
Tämä keksintö antaa vektorin, joka koostuu eristetystä 2S nukleiinihappomolekyylistä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D- reseptoria.
» · • · · :Tämä keksintö antaa myös vektorit, kuten plasmidit, jois- : sa on DNA-molekyyli, joka koodaa ihmisen 5-HTx„-resepto- • · · 13/5 ria, joka on adaptoitu ekspressoimaan bakteerisolussa, ' hiivasolussa tai nisäkässolussa, missä lisäksi on sääte- lyelementit, jotka ovat tarpeellisia DNA:n ekspressiolle '· ’· bakteeri-, hiiva- tai nisäkässoluissa, sijoitettuna niin *.1 1 suhteessa DNA:hän, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, .135 että sallitaan sen ekspressio.
» » Tämä keksintö antaa nisäkässolun, jossa on DNA-molekyyli, 6 joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria. 110692 Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää, voiko ligandi, jonka ei tiedetä olevan kykenevä sitoutumaan ihmisen 5-5 HT1D-reseptoriin, sitoutua ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, mi hin sisältyy,että saatetaan nisäkässolu, jossa on DNA-mo-lekyyli, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, kosketuksiin ligandin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat ligan-dien, joiden tiedetään sitoutuvan 5-HT1D-reseptoriin, o- 10 tetaan ligandi, joka on yhtään sitoutunut 5-HT1D-resepto riin ja täten määritetään, sitoutuuko ligandi 5—HT1D—reseptori in .
Tämä keksintö antaa myös menetelmän seuloa lääkkeitä, 15 jotta tunnistetaan lääkkeitä, jotka spesifisesti ovat vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat ihmisen 5-HT1D-resepto-riin solun pinnalla, mihin kuuluu että saatetaan nisäkäs-solu, jossa on DNA-molekyyli, joka kodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria solun pinnalla, kosketuksiin lukuisten lääk- 20 keiden kanssa, määritetään lääkkeet, jotka sitoutuvat nisäkässoluun ja täten tunnistetaan lääkkeet, jotka spesifisesti ovat vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat ihmisen 5-HT1D-reseptoriin.
2S Tämä keksintö antaa nukleiinihappokoettimen, mikä koostuu nukleiinihappomolekyylistä, jossa on vähintään 15 nukleo-tidiä, jotka kykenevät spesifisesti hybridisoitumaan sek-:.·. venssin kanssa, joka on nukleiinihappomolekyylin sekvenssi \ sissä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria.
• »* :30 * · · * Tämä keksintö antaa myös menetelmän havaita 5-HT1D-resep- torin ekspressio solun pinnalla havaitsemalla mRNA:n, jo-*. *: ka koodaa 5-HT1D-reseptoria, läsnäolo, mihin sisältyy että v · saadaan kokonais-mRNA solusta ja saatetaan siten saatu .'35 mRNA kosketuksiin nukleiinihappokoettimen kanssa, mikä koostuu nukleiinihappomolekyylistä, jossa on vähintään 15 • nukleotidiä, jotka kykenevät spesifisesti hybridisoitu- • »
• · I
7 110692 maan sekvenssin kanssa, joka on nukleiinihappomolekyylin sekvenssissä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria hybri-disaatio-olosuhteissa, havaitsemalla koettimeen hybridi-soidun mRNA:n läsnäolo ja täten havaitsemalla 5—HT1D—re— 5 septorin ekspressio solussa.
Tämä keksintö antaa antisense oligonukleotidin, jossa on sekvenssi, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan minkä tahansa mRNA-molekyylin sekvenssin kanssa, mikä koodaa 10 ihmisen 5-HT1D-reseptoria niin, että estetään mRNA-mole kyylin translaatio.
Tämä keksintö antaa vasta-aineen, joka on kohdistettu ihmisen 5-HT1D-reseptoria vastaan.
15 Tämä keksintö antaa transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria. Tämä keksintö antaa myös transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-resep-20 toria, joka on niin mutatoitunut, että se ei kykene nor maaliin reseptoriaktiivisuuteen ja ei ekspressoi natiivia 5-HT1D-reseptoria. Tämä keksintö antaa lisäksi transgeenisen, ei-ihmisnisäkkään, jonka genomi koostuu antisense DNA:sta, joka on komplementaarinen DNA:n kanssa, joka ,,255 koodaa ihmisen 5-HT10-reseptoria, joka on sijoitettu niin, että se transkriboidaan antisense mRNA:han, joka on komp-lementaarinen mRNA:n kanssa, joka koodaa 5-HT1D-reseptoria : ja joka hybridisoituu mRNA:han, joka koodaa 5-HT1D-resep- ; toria täten vähentäen sen translaatiota.
• · · 2Ό * · · • · · Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja ihmi-sen 5-HT1D-reseptoreja, mihin kuuluu että tuotetaan trans- ( I » geeninen ei-ihmis eläin, jonka ihmisen 5-HT1D-reseptorin • 135 ekspressiotasot vaihtelevat käytettäessä indusoituvaa promoottoria, joka säätelee ihmisen 5-HT1D-reseptorin eks-• pressiota.
· 110692 Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja ihmisen 5-HT1D-reseptore ja, mihin kuuluu että tuotetaan trans- 5 geenisten ei-ihmis-eläinten paneeli, joista jokainen eks- pressoi erilaisen määrän ihmisen 5-HT1D-reseptoria.
Tämä keksintö antaa menetelmän diagnosoida taipumuksen häiriöön, joka liittyy spesifisen ihmisen 5-HT1D-resepto-10 rialleelin ekspressioon, mihin kuuluu: a. saadaan DNA:ta kohteelta, jolla on häiriö; b. suoritetaan DNA:n restrik-tiopilkkominen restriktioentsyymien paneelilla; c. erotetaan elektroforeettisesti saadut DNA-fragmentit kokoon jakavassa geelissä; d. saattamalla saatu geeli kosketuk-15 siin nukleiinihappokoettimen kanssa, joka spesifisesti kykenee hybridisoitumaan DNA:hän, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, ja joka on leimattu havaittavalla markke-rilla; e. osoitetaan leimatut juovat, jotka ovat hybri-disoituneet DNA:hän, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-resepto-20 ria, joka on leimattu havaittavalla markkerilla, jotta luodaan ainutlaatuinen juovakuvio, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien kohteiden DNA:lie; f. valmistetaan saatu DNA diagnoosia varten vaiheilla a-e; ja g. verrataan ainutlaaatuista juovakuviota, joka on spesifinen » .,$5 häiriöstä kärsivien kohteiden DNA:lie vaiheesta e ja : ' : DNA:ta, joka saatiin diagnoosia varten vaiheesta f, jotta määritetään, ovatko kuviot samat vai erilaiset ja täten : diagnosoidaan alttius häiriölle, jos kuviot ovat samat.
I * I * : Tätä menetelmää voidaan myös käyttää diagnosoimaan häi- ( I | ,•£0 riötä, joka liittyy spesifisen 5-HT1D-reseptorialleelin ekspressioon, on diagnosoitu.
* · ’ ['· Tämä keksintö antaa menetelmän valmistaa eristetty 5-HT1D- t * a ·' ’ reseptori, mihin sisältyy että indusoidaan solut ekspres- * ;'3,$ soimaan 5-HT1D-reseptoria, otetaan reseptori talteen saa- duista soluista ja puhdistetaan siten talteenotettu re-* . septori.
t > »
* I
9 110692 Tämä keksintö antaa menetelmän valmistaa eristetty 5-HT1D-reseptori, mihin sisältyy että insertoidaan 5-HT1D-resep-toria koodaava nukleiinihappo sopivaan reseptoriin, in-5 sertoidaan saatu vektori sopivaan isäntäsoluun, otetaan talteen saadulla solulla tuotettu reseptori ja puhdistetaan siten saatu reseptori.
Tämä keksintö antaa antisense oligonukleotidin, jolla on 10 sekvenssi, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan minkä tahansa mRNA-molekyylin, joka koodaa reseptoria niin että estetään mRNA-molekyylin translaatio, sekvenssien kanssa.
Tämä keksintö antaa myös transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, 15 joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa reseptoria.
Tämä keksintö antaa vielä transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa reseptoria, joka on niin mutatoitunut, ettei se kykyne normaaliin 20 reseptoriaktiivisuuteen eikä ekspressoimaan natiivia re septoria.
Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja resep-255 toreja, mihin sisältyy että tuotetaan transgeeninen ei- ihmiseläin, jonka reseptorin ekspressiotasot vaihtelevat käytettäessä indusoituvaa promoottoria, joka säätelee : reseptorin ekspressiota.
f * Ψ 9 230 Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset I t | vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja resep toreja, mihin sisältyy että tuotetaan transgeenisten ei-1: ihmiseläinten paneeli, joista jokainen ekspressoi erilai- V sen määrän reseptoria.
33 > · · • · Tämä keksintö antaa vielä transgeenisen ei-ihmisnisäk-• kään, jonka genomi koostuu antisense-DNA:sta, joka on
t · t ( I
10 110692 komplementaarinen DNA:lie, joka koodaa reseptoria, joka on sijoitettu niin, että se transkriptoidaan antisense-m-RNArksi, joka on komplementaarinen mRNArlle, joka koodaa reseptoria, ja joka hybridisoituu mRNA:n kanssa, joka koo-5 daa reseptoria täten estäen translaation.
Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää, voiko ligandi, jonka ei tiedetä kykenevän sitoutumaan reseptoriin, sitoutua reseptoriin, mihin sisältyy, että saatetaan nisä-kässolu, joka koostuu eristetystä DNA-molekyylistä, joka 10 koodaa reseptoria, kosketuksiin ligandin kanssa olosuh teissa, jotka sallivat ligandien, joiden tiedetään sitoutuvan reseptoriin, sitoutumisen, havaitaan minkä tahansa ligandin, joka on sitoutunut reseptoriin, läsnäolo ja täten määritetään, sitoutuuko ligandi reseptoriin.
15 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Kuvio 1. cDNA-kloonit, jotka edustavat 5-HT1D1-geeniä (geeni 8-30-84).
Kaksi cDNA-kloonia eristettiin ihmisen aivoturso (hH)-20 kirjastosta seulomalla keskimäärin 106 rekombinanttia
Lambda Zap II-vektorissa. Kloonit hH-13 ja hH-46 ulottui-vat yli koko 5-HT1D j-geenin koodausalueen. Nähdään seitse-| ‘/· män oletettua α-helikaalista membraanin yli ulottuvaa ; : domeenia (TM-1 -TM-7) ja ne on erotettu ekstrasellulaari- : 25 silla (01-04) ja solunsisäisillä (11-14) silmukoilla.
'· *'· Kuvio 2. 5-HT1D_2-geenin (geeni 11) restriktiokartta.
Klooni hP-11, jossa on noin 15 kiloemästä (kb) ihmisen genomista DNA:ta, saatiin seulomalla keskimäärin 2xl06 rekombinanttia Lambda Fix II ihmisen istukan (hP) genomista 30 kirjastoa (Stratagene) 1,3 kb HindIII-Sph-I koiran RDC4- koettimen kanssa. Seitsemän oletettua a-helikaalista I I 1 membraanin yli ulottuvaa domeenia (TM-1-TM-7) johdetusta aminohapposekvenssistä nähdään alla ja on erotettu ekst-,···, rasellulaarisilla (01-04) ja solunsisäisillä (11-14) sil- 11 110692 mukoilla. Restriktiokohdat on osoitettu.
Kuvio 3. ö-HTiD^-geenin (geeni 8-30-84) nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi.
5
Ylläolevassa nukleotidisekvenssissä olevat numerot osoittavat nukleotidin sijainnin. DNA-sekvenssi määritettiin Sanger et ai., ketju-terminaatio-menetelmällä denaturoituihin kaksijuosteisiin plasmidialukkeisiin käyttämällä 10 Sequenase-entsyymiä. Pitkän avoimen lukuraamin johdettu aminohapposekvenssi (yksi-kirjainkoodi) nähdään. Plasmi-di, jossa on kuviossa 3 näkyvä cDNA-sekvenssi, on rakennettu ja on merkitty pcEXV-8-30-84. Plasmidi pcEXV-8-30-84 tallennettiin huhtikuun 17, 1990 noudattaen Budapest 15 Treaty On The International Recognition Of The Deposit Of
Microorganisms For The Purposes Of Patent Procedure sopimusehtoa Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection (ATCC) mukaisesti, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, ATCC-saantinumerolla 20 40 790.
Kuvio 4 5-HT1D_2-geenin (geeni 11) nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi.
25 Ylläolevassa nukleotidisekvenssissä olevat numerot osoit- tavat nukleotidin sijainnin. DNA-sekvenssi määritettiin ·' ·* Sanger et ai., ket ju-terminaatio-menetelmällä denaturoi- tuihin kaksi juosteisiin plasmidialukkeisiin käyttämällä i Sequenase-entsyymiä. Pitkän avoimen lukuraamin johdettu • · :#30 aminohapposekvenssi (yksi-kirjainkoodi) nähdään. Plasmi- : di, jossa on kuviossa 4 näkyvä cDNA-sekvenssi, on raken nettu ja on merkitty pSVL-11. Plasmidi pSVL-11 tallennet- : tiin huhtikuun 17, 1990 noudattaen Budapest Treaty On The • »
International Recognition Of The Deposit Of Microorga- ‘35 nisms For The Purposes Of Patent Procedure sopimusehtoa • ♦ *. ·: Patent Culture Depository of the American Type Culture
Collection (ATCC) mukaisesti, 12301 Parklawn Drive, Rock- 12 110692 ville, Maryland, 20852, USA, ATCC-saantinumerolla 40 791.
Kuvio 5. 5-HTuj.i-geenin (peptidi 8-30-84) johdetun aminohapposekvenssin seitsemän transmembraanin yli ulottuva 5 malli.
Aminohapot varjostetuissa ympyröissä ovat aminohappoja, jotka eroavat aminohapoista vastaavassa asemassa koiran RDC4-reseptorissa. Nuolet osoittavat N-kytkeytyneen gly-10 kosylaation mahdolliset kohdat. Aminohapot ympyröissä, jotka ovat viivojen, jotka esittävät membraania, molemmilla puolin, katsotaan transmembraanisen alueen ulkopuolelle tämän hakemuksen tarkoituksia varten.
15 Kuvio 6. Ihmisen 5-HT-1D-reseptorin primääristen rakentei den vertailu muiden serotoniinireseptorien kanssa.
Aminohapposekvenssit (yksi-kirjainkoodi) on asetettu suoraan riviin homologian optimoimiseksi. Mahdolliset trans-20 membräänin yli ulottuvat domeenit on osoitettu tähdillä ja tunnistettu roomalaisilla numeroilla (TM I-VII).
Kuten tässä on käytetty, 5-HT-reseptoriperhe on kuvattu ryhmäksi nisäkäsproteiineja, jotka toimivat serotoniini- 25 reseptoreina. 5-HT-reseptorin alaperhe on kuvattu prote- iinien, jotka kuuluvat 5-HT-reseptoriperheeseen, osajou- • koksi, joita koodaavat geenit, joilla on 65 % homologia, '···’ tai korkeampi, toistensa kanssa niiden johdetuissa amino- : happosekvensseissä oletetuilla transmembraanialueilla • · ’.’30 (lineaarisesti viereisiä hydrofobisten aminohappojen pät- : ! : kiä, joita rajaavat varatut tai polaariset aminohapot, jotka ovat tarpeeksi pitkiä muodostamaan sekundaarisia : proteiinirakenteita, jotka ulottuvat lipidi-kaksoisker- . roksen yli). Voidaan erottaa kolme ihmisen 5-HT-resepto- ’•35 rin alaperhettä perustuen tällä hetkellä saatavilla ole- vaan informaatioon. 5-HT2-reseptorin alaperhe sisältää • ”’ ihmisen 5-HT2-reseptorin. Vaikka tämän perheen muita ih- 13 110692 misjäseniä ei ole kuvattu, muodostavat rotan 5-HT2-resep-tori (Prichett, et ai. 1988; Julius, et ai. Proc. Natl. Äcad. Sei. USA 87:928-932, 1990) ja rotan 5HTlc-reseptori (Julius, et ai. 1988) rotan 5-HT-reseptorin alaperheen.
5 5-HT alaperhe sisältää ihmisen 5-HTXA-reseptorin, tunne taan myös G-21:nä (Fargin, et ai. 1988) 5-HT1D-reseptorin alaperheessä on kaksi jäsentä, 5-HTXD_x-reseptori (myös kutsutaan 5-HTXD:ksi ja/tai peptidi 8-30-84:ksi) ja 5-HT1D_2-reseptori (myös kutsutaan 5-HT1D:ksi ja/tai peptidi 10 ll:ksi), jotka on kuvattu tässä. Siksi termi "ihmisen 5- HT1D-reseptori", kuten tässä on käytetty, on kuvattu tarkoittamaan yläpuolella kuvatun 5-HT1D-reseptorin alaperheen jäsentä. Vaikka tämä kuvaus eroaa aikaisemmin käytetystä farmakologisesta kuvauksesta, on merkittävä pääl- 15 lekkyisyys tämän kuvauksen ja farmakologisen kuvauksen välillä. Siten kuvattuihin 5-HTXD-reseptorin alaperheen jäseniin kuuluvat 5-HTXD_x-reseptori, 5-HTXD_2-reseptori ja mikä muu tahansa reseptori, jolla on 65 % homologia kuviossa 3 osoitetun DNA:n ja aminohapposekvenssin kanssa 20 tai kuviossa 4 osoitetun DNA:n ja aminohapposekvenssin kanssa "alaperheen" kuvauksen mukaisesti. Tämä keksintö koskee ihmisen 5-HTXD-reseptorin alaperheen ensimäisten jäsenten keksimistä. 1
* I
Tämä keksintö antaa eristetyn nukleiinihappomolekyylin, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria. Sellainen reseptori : on kuvaukseltaan 5-HTXD-reseptorin alaperheen jäsen. Siksi mikä tahansa reseptori, joka täyttää edellä annetut ku-· vauskriteerit, on ihmisen 5-HTXD-reseptori. Eräs keino :_30 eristää ihmisen 5-HTXD-reseptoria, on koettaa ihmisen ge- nomista kirjastoa luonnon tai keinotekoisesti suunnitellun DNA-koettimen kanssa käyttämällä alalla hyvin tunnet-: tuja menetelmiä. DNA-koettimet, jotka johdettiin ihmisen ... reseptorigeeneistä 5-HTxd_x ja 5-HTXD_2, ovat erityisen hyö- * · · *35 dyllisiä tähän tarkoitukseen. DNA- ja cDNA-molekyylejä, jotka koodaavat ihmisen 5-HT1D-reseptoreja, voidaan käyt-tää saamaan komplementaarista genomista DNA:ta, cDNA:ta 14 1 10692 tai RNA:ta ihmis-, nisäkäs- tai muista eläinlähteistä tai eristämään läheisesti yhteenkuuluvia cDNA- tai genomisia klooneja seulomalla cDNA- tai genomisia kirjastoja alla tarkemmin kuvatuilla menetelmillä. Tällöin saadaan eris-5 tetyistä geeneistä transkriptionaalisia säätelyelement tejä 5/-ei-transloidusta eristettyjen kloonien alueesta ja muita stabiilisuus-, prosessointi-, transkriptio-, translaaatio- ja kudoksen erityisyyttä määrittäviä alueita 3'- ja 5'-ei-transloiduista alueista. Esimerkkejä nuk-10 leiinihappomolekyyleistä ovat RNA, cDNA tai eristetty genominen DNA-molekyyli, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-resep-toria. Sellaisilla molekyyleillä voi olla koodaussekvens-sit, jotka ovat olennaisesti samat kuin kuviossa 3 osoitettu koodaussekvenssi tai koodaussekvenssi osoitettu 15 kuviossa 4 tai voi olla koodaussekvenssejä, joilla on 65 % tai enemmän homologiaa kuviossa 3 osoitetun koodausse-kvenssin kanssa tai kuviossa 4 osoitetun koodaussekvens-sin kanssa. Kuvion 3 ja kuvion 4 DNA-molekyylit koodaavat ihmisen 5-HT1D-reseptorigeenien 5-HT^.!- ja 5-HT1D_2-sek-20 venssejä.
Tämä keksintö antaa vielä cDNA-molekyylin, joka koodaa ihmsen 5-HT1D_j-reseptoria, jonka koodaussekvenssi on olennaisesti sama kuin kuviossa 3 osoitettu koodaussekvenssi 25 ja cDNA-molekyylin, joka koodaa 5-HT1D_2-reseptoria, jonka koodaussekvenssi on olennaisesti sama kuin kuviossa 4 ·' ·’ osoitettu koodaussekvenssi. Nämä molekyylit saadaan yllä kuvatuin keinoin.
• · I
:30 Tämä keksintö antaa eristetyn proteiinin, joka on ihmisen 5-HT1D-reseptori. Esimerkkejä sellaisista proteiineista on eristetty proteiini, jolla on olennaisesti sama aminohap-: posekvenssi, joka nähdään kuviossa 3 ja eristetty prote- iini, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi, jo-'35 ka nähdään kuviossa 4, jotka ovat ihmisen 5-HT1D-resepto- ·. ·: rit 5-HTio.i ja 5-HT1D_2. Eräs keino saada eristetty 5-HT1D- reseptori, on ekspressoida DNA:ta, joka koodaa reseptoria 15 110691·: sopivassa isännässä, kuten bakteeri-, hiiva- tai nisäkäs-solu, käyttämällä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä ja saamalla reseptoriproteiini sen jälkeen, kun sitä on eks-pressoitu sellaisessa isännässä, käyttämällä jälleen a-5 lalla tunnettuja menetelmiä. Reseptori voidaan myös eris tää soluista, jotka ekspressoivat sitä, erityisesti soluista, jotka on transfektoitu alla yksityiskohtaisemmin kuvatui11a ekspress iovektorei11a.
10 Tämä keksintö antaa vektorin, joka koostuu eristetystä nukleiinihappomolekyylistä, kuten DNA, RNA tai cDNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria. Esimerkkejä vektoreista ovat virukset, kuten bakteriofaagit (kuten lambda-faagi), kosmidit, plasmidit (kuten pUC18, saatavana Pharmacialta, 15 Piscataway, NJ) ja muut rekombinaatiovektorit. Nukleii- nihappomolekyylit insertoidaan vektorigenomeihin alalla tunnetuin menetelmin. Esimerkiksi, insertti- ja vektori-DNA voidaan molemmat altistaa restriktioentsyymeille synnyttämään komplemetaariset päät molempiin molekyyleihin, 20 jotka emäspariutuvat toistensa kanssa ja ligoidaan sitten yhteen ligaasilla. Vaihtoehtoisesti, linkkerit voidaan ligoida insertti-DNA:han, joka vastaa vektori-DNA:n, mikä sitten pilkotaan restriktioentsyymillä, joka pilkkoo tuosta kohdasta, restriktiokohtaa. Myös muita keinoja on 25 saatavilla. Spesifisiä esimerkkejä plasmideista ovat I I t plasmidi, joka koostuu cDNA:sta, jossa on koodaussekvens- • · · si olennaisesti sama kuin kuviossa 3 nähty koodaussek- » ·...· venssi ja merkitty klooni p5HT-8-30-84, ja plasmidi, joka « « :,i : koostuu cDNA:sta, jossa on koodaussekvenssi olennaisesti • * :.3$) sama kuin kuviossa 4 nähty koodaussekvenssi ja merkitty :Y: klooni p5HT-ll.
: Tämä keksintö antaa myös vektorit, jotka koostuvat DNA- molekyylistä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, joka « · ♦ ‘35 on adaptoitu ekspressoimaan bakteerisolussa, hiivasolussa tai nisäkässolussa, missä lisäksi on säätelyelementit, : jotka ovat tarpeelliset DNA:n ekspressioon bakteeri-, I » » 16 11069.': hiiva- tai nisäkässoluissa sijoitettuna niin suhteessa ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaavaan DNA:hän, että sen ekspressio sallitaan. DNA, jolla on koodaussekvenssit olennaisesti sama kuin kuviossa 3 nähty koodaussekvenssi 5 tai kuviossa 4 nähty koodaussekvenssi, voidaan hyödylli sesti insertoida vektoreihin ekspressoimaan ihmisen 5-HT1D-reseptoreita. Säätelyelementteihin, joita vaaditaan ekspressiota varten, kuuluu promoottorisekvenssit sitomaan RNA-polymeraasi ja transkription aloitussekvenssit 10 ribosomin sitomista varten. Esimerkiksi bakteerin eks- pressiovektoriin kuuluu promoottori, kuten lac-promootto-ri transkription aloitusta varten Shine-Dalgarno-sekvens-si ja aloituskodoni AUG (Maniatis, et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Samalla lail-15 la eukaryoottiseen ekspressiovektoriin kuuluu heterologi- nen tai homologinen promoottori RNA polymeraasi II:ta varten, myötävirta-polyadenylaatiosignaali, aloituskodoni AUG ja lopetuskodoni ribosomin irrottamista varten. Sellaisia vektoreita voidaan saada kaupallisesti tai koottu-20 na sekvensseistä, joita kuvataan alalla hyvin tunnetuissa menetelmissä, esimerkiksi yllä kuvatut menetelmät vektoreiden rakentamista varten yleensä. Ekspressiovektorit ovat hyödyllisiä tuottamaan soluja, jotka ekspressoivat reseptoria. Tiettyjä käyttöjä sellaisille soluille on 25 kuvattu tarkemmin alla.
\ Tämä keksintö antaa vielä plasmidin, joka on adaptoitu *···’ ekspressoimaan bakteeri-, hiiva- tai erityisesti nisäkäs- i solussa, mihin sisältyy DNA-molekyyli, joka koodaa ihmi- :. 3f) sen 5-HT1D-reseptoria ja säätelyelementit, jotka ovat tar- peelliset DNA:n ekspressioon bakteeri-, hiiva- tai nisäkässoluissa sijoitettuna niin suhteessa ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaavaan DNA:han, että sen ekspressio salli- • * taan. Jotkut plasmidit, jotka on adaptoitu ekspressoimaan •35 nisäkässolussa, ovat pSVL (saatavana Pharmacialta, Pisca- ’· · taway, NJ) ja pcEXV-3 (Miller J. ja Germain R.N., J. Exp.
: Med. 164:1478 (1986)). Spesifisiä esimerkkejä sellaisista • · » » I * » * I · > · 17 11069;; plasmideista ovat plasmidit, jotka on adaptoitu ekspres-soimaan nisäkässolussa koostuen cDNArsta, jossa on olennaisesti samat koodaussekvenssit kuin kuviossa 3 nähty koodaussekvenssi, ja säätelyelementit, jotka ovat tar- 5 peelliset DNA:n ekspressiota varten nisäkässolussa, mitä merkitään pcEXV-8-30-84 ja tallennettu ATCC-tallennusnu-merolla 40790, ja plasmidi, joka on adaptoitu ekspressoi-maan nisäkässolussa koostuen cDNArsta, jossa on olennaisesti samat koodaussekvenssit kuin kuviossa 4 nähty koo-10 daussekvenssi, ja säätelyelementit, jotka ovat tarpeel liset DNA:n ekspressiota varten nisäkässolussa, mitä merkitään pSVL-11 ja tallennettu ATCC-tallennusnumerolla 40791. Ammattimies ymmärtää helposti, että lukuisat plasmidit, jotka on adaptoitu ekspressoimaan nisäkässolussa, 15 mihin sisältyy ihmisen 5-HT1D-reseptoreita koodaava DNA ja säätelyelementit, jotka ovat tarpeelliset ekspressoimaan sellaista DNA:ta nisäkässolussa, voidaan rakentaa käyttämällä olemassa olevia plasmideja ja adaptoida kuten tarkoituksenmukaista sisältämään säätelyelementit, jotka o-20 vat tarpeelliset ekspressoimaan DNA:ta nisäksäsolussa.
Plasmidit voidaan rakentaa menetelmillä, jotka edellä kuvattiin ekspressiovektoreille ja vektoreille yleensä ja muilla alalla tunnetuilla menetelmillä.
35 Nämä tallennukset, joista on keskusteltu, supra, ja muut t * · ;·; tässä keskusteltavat tallennukset tehtiin tyydyttäen the
Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Pro- < t ·\ί · cedure with the American Type Culture Collection (ATCC), * t ·'t*3p ja mukaisesti, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland ! : ; 20852.
: Tämä keksintö antaa nisäkässolun, joka koostuu DNA-mole-
» V · t I
, kyylistä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, kuten 1 1 35 nisäkässolu, jossa on plasmidi adaptoitu ekspressoimaan i 1 \nisäkässolussa, mihin sisältyy DNA-molekyyli, joka koodaa '»"l ihmisen 5-HT1D-reseptoria ja säätelyelementit, jotka ovat t > t » t 1 18 1.1 Q 69;: tarpeelliset DNA:n ekspressioon nisäkässolussa sijoitettuna niin suhteessa ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaavaan DNA:hän, että sen ekspressio sallitaan. Lukuisia nisäkäs-soluja voidaan käyttää isäntinä, esimerkiksi hiiren fib-5 roblastisolu NIH3T3, CHO-solut, HeLa-solut, Ltk-solut, jne. mukaanluettuina. Erityinen esimerkki Ltk-solusta on solu, jota merkitään Ltk-8-30-84:ksi ja tallennettu ATCC-tallennusnumerolla CRL 10421 ja sisältää plasmidin, jota merkitään pcEXV-8-30-84. Toinen esimerkki on solu, jota 10 merkitään Ltk-11 ja tallennettu ATCC-tallennusnumerolla CRL 10422, ja jossa on plasmidi, jota merkitään pSVL-11. Ekspressioplasmideja, kuten ne, joita kuvattiin supra, voidaan käyttää transfektoimaan nisäkässoluja alalla tunnetuin menetelmin, kuten kalsiumfosfaattisaostus tai DNA, 15 joka koodaa näitä 5-HT1D-reseptoreja, voidaan muuten viedä nisäkässoluihn, esim. mikroinjektiolla, jotta saadaan nisäkässoluja, joissa on DNA:ta, esim. cDNA tai plasmidi, joka koodaa kumpaakin 5-HT1D-reseptoria.
20 Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää, voiko ligandi, jonka ei tiedetä olevan kykenevä sitoutumaan ihmisen 5-HT1D-reseptori in, sitoutua ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, mihin sisältyy että saatetaan nisäkässolu, jossa on ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaava DNA-molekyyli, kosketuksiin 25 ligandin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat ligandien, joiden tiedetään sitoutuvan, sitoutumisen 5-HT1D-resepto-riin, havaitaan minkä tahansa 5-HT1D-reseptoriin sitoutu-: .·. neen ligandin läsnäolo ja täten määritetään, sitoutuuko [·* J ligandi 5-HT1D-ligandiin. Solussa olevalla DNA:11a voi • *« !3jö olla olennaisesti sama koodaussekvenssi kuin kuviossa 3 • nähty koodaussekvenssi tai kuviossa 4 nähty koodaussek venssi. Nisäkässolu on edullisesti ei-neuronaalista al-” kuperää. Esimerkki ei-neuronaalisesta nisäkässolusta on *.’* · Ltk-solu, erityisesti Ltk-solu, jota merkitään L-5HT-8- .*33 30-84, tai Ltk-solu, jota merkitään L-5HT-11. Edulliseen menetelmään määrittää, kykeneekö ligandi sitoutumaan ih-• misen 5-HT1D-reseptoreihin, sisältyy, että saatetaan 19 110692 transfektoitunut nisäkässolu (s.o. solu, joka ei luonnollisesti ekspressoi minkään tyypin 5-HT- tai G-proteiiniin kytkeytynyttä reseptoria, täten ekspressoi vain sellaista reseptoria, jos se on transfektoitu soluun), joka eks-5 pressoi 5-HT1D-reseptoria pinnallaan, kosketuksiin tai saatetaan valmiste, joka on johdettu sellaisesta trans-fektoituneesta solusta, kosketuksiin ligandin kanssa olosuhteissa, jotka ovat tunnetusti vallitsevat, ja täten liittyvät ligandien in vivo sitoutumiseen 5-HT1D-resepto-10 riin, havaitaan minkä tahansa testatun ligandin, joka on sitoutunut 5-HT1D-reseptoriin solun pinnalla, läsnäolo ja täten määritetään, sitoutuuko ligandi 5-HT1D-reseptoriin. Tämä vastesysteemi saadaan transfektoimalla eristetty DNA sopivaan isäntäsoluun, jossa on toivottu toinen lähetti-15 systeemi, kuten fosfoinositidihydrolyysi, adenylaattisyk- laasi, guanylaattisyklaasi tai ionikanavat. Sellainen i-säntäsysteemi eristetään aikaisemmin olemassaolevista so-lulinjoista tai voidaan synnyttää insertoimalla toisten lähettisysteemien sopivat komponentit olemassa oleviin 20 solulinjoihin. Sellainen transfektiosysteemi antaa täy dellisen vastesysteemin tutkittaessa tai määritettäessä ihmisen 5-HT1D-reseptorien aktiivisuutta ligandien kanssa, kuten edellä kuvattiin. Transfektiosysteemit ovat hyödyllisiä elävinä soluviljelminä kilpailevia sitoutumismääri-25 tyksiä varten tunnettujen tai ehdokaslääkkeiden ja ligan- dien, jotka sitoutuvat reseptoriin ja jotka ovat radioak- • · tiivisilla, spektroskooppisesti tai muilla reagensseilla • · * :.·. leimatut, välillä. Membraanivalmisteet, joissa on trans- ] fektoiduista soluista eristetty reseptori, ovat myös hyö- * · · ’.3.0 dyllisiä näille kilpaileville sitomismäärityksille. Tois- • * · ’ ten lähettisysteemien tai niiden seuraajien toiminnalli set määritykset transfektiosysteemeissä toimivat määri-tyksinä sitomisaffiniteetille tai -tehokkuudelle resep-V ’ torin toiminnan aktivaaatiossa. Transfektiosysteemi muo- ,•39 dostaa "lääkkeen pal j as tus systeemi n", joka on hyödyllinen luonnon tai synteettisten yhdisteiden, joilla on mahdol-• lisuutta lääkkeen kehittämiseen, tunnistamiselle, joita I · » · · 20 n 0692 voidaan modifioida edelleen tai käyttää suoraan terapeuttisina yhdisteinä aktivoimaan tai inhiboimaan ihmisen 5-HT1D-reseptorin luonnollisia toimintoja. Transfektiosys-teemi on myös hyödyllinen määritettäessä tunnettujen 5 lääkkeiden affiniteettia ja tehokkuutta ihmisen 5-HT1D- reseptorikohtiin.
Tämä keksintö antaa myös menetelmän seuloa lääkkeitä tunnistamaan lääkkeitä, jotka spesifisesti ovat vuorovaiku-10 tuksessa ja sitoutuvat ihmisen 5-HT10-reseptoriin solun pinnalla, mihin sisältyy että saatetaan nisäkässolu, jossa on DNA-molekyyli, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria solun pinnalla, kosketuksiin lukuisten lääkkeiden kanssa, määritetään ne lääkkeet, jotka sitoutuvat nisäkässoluun 15 ja täten tunnistetaan lääkkeet, jotka spesifisesti ovat vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat ihmisen 5-HT1D-resepto-riin. Solussa olevalla DNA:11a voi olla olennaisesti sama koodaussekvenssi kuin kuviossa 3 nähty koodaussekvenssi tai kuviossa 4 nähty koodaussekvenssi. Nisäkässolu on e-20 dullisesti ei-neuronaalista alkuperää. Esimerkki ei-neu- ronaalisesta nisäkässolusta on Ltk-solu, erityisesti Ltk-solu, jota merkitään L-5HT-8-30-84, tai Ltk-solu, jota merkitään L-5HT-11. Lääke-ehdokkaat tunnistetaan valitsemalla kemialliset yhdisteet, jotka sitoutuvat korkealla 25 affiniteetilla ekspressoituun 5-HT1D-reseptoriproteiiniin transfektoiduissa soluissa käyttämällä alalla hyvin tun-nettuja radioligandisitomismenetelmiä, joista esimerkkejä « · · :nähdään tässä kuvatuissa sitomismäärityksissä. Lääke-eh- t'-[ ] dokkaista seulotaan myös selektiivisyys tunnistamalla yh- • * · !3.0 disteitä, jotka sitoutuvat suurella affiniteetilla yhteen * erityiseen 5-HT10-reseptorin alatyyppiin, mutta eivät si toudu korkealla affiniteetilla mihinkään toiseen seroto-
I « I
. niini-reseptorin alatyyppiin tai mihinkään toiseen tun- v ’ nettuun reseptorikohtaan. Koska selektiivinen, korkean .’33 affiniteetin yhdisteet ovat pääasiassa vuorovaikutuksessa kohteen 5-HT1D-reseptorikohdan kanssa sen jälkeen, kun on I · annettu potilaalle, mahdollisuudet tuottaa lääkettä, joi- » · 2i 110692 la on ei-toivut sivuvaikutukset, minimoidaan tällä suoritusmuodolla. Tämä keksintö antaa farmaseuttisen koostumuksen, missä on lääke, joka on tunnistettu edellä kuvatulla menetelmällä, ja farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja.
5
Kun ehdokaslääkkeen on kerran osoitettu olevan sopivasti biologisesti saatavilla seuraamalla erityistä antamisreit-tiä, esimerkiksi suun kautta tapahtuva tai injektiolla (riittävä terapeuttinen pitoisuus täytyy ylläpitää toimin-10 takohdassa riittävä jakso, jotta saadaan toivottu terapeut tinen hyöty) ja on osoitettu olevan ei-toksinen ja terapeuttisesti tehokas sopivissa tautimalleissa, lääkettä voidaan antaa potilaille sillä antotavalla, joka määritettiin tekemään lääke biologisesti saatavilla olevaksi, sopivassa 15 kiinteässä tai liukoisessa formulaatiossa, jotta saavute taan haluttu terapeuttinen hyöty.
Tämä keksintö antaa nukleiinihappokoettimen, joka koostuu vähintään 15 nukleotidin, jotka kykenevät spesifisesti 20 hybridisoitumaan sekvenssin kanssa, joka on ihmisen 5-HT]D- ···' reseptoria koodaavan nukleiinihappomolekyylin sek- : .· venssissä, nukleiinihappomolekyylistä, esimerkiksi koo- daussekvenssin kanssa, joka on kuviossa 3 tai kuviossa 4 :: : nähdyssä sekvenssissä. Nukleiinihappokoetinteknologia on : .’25 tunnettua ammattimiehelle, jotka helposti ymmärtävät, että sellaiset koettimet voivat suuresti vaihdella pituudeltaan ja voidaan leimata havaittavalla markkerilla, kuten radio-isotooppi tai fluoresoiva väri, helpottamaan koettimen osoittamista. Nukleiinihappoa koodaavan ihmisen . .30 5-HT1D-reseptorien osoittaminen on hyödyllinen diagnosti- isena testinä mille tahansa tautiprosessille, missä vastaavan 5-HT1B-reseptorin ekspressiotasot on muuttunut. DNA-koetinmolekyylit tuotetaan insertoimalla DNA-molekyy-li, mikä koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria tai sen frag-; 35 mentteja sopiviin vektoreihin, kuten plasmidit tai bakte- ’ riofaagit, jonka jälkeen seuraa insertio sopiviin baktee- 22 110 6 9 2 ri-isäntäsoluihin ja replikaatio ja DNA-koettimien kerääminen, kaikki käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi, DNA voidaan uuttaa solulysaatista käyttämällä fenolia ja etanolia, pilkotaan restriktioentsyymeillä 5 vastaten DNA:n insertiokohtia vektoriin (keskusteltu yl lä), elektroforesoidaan ja pilkotaan saadusta geelistä. Esimerkkejä sellaisista DNA-molekyyleistä nähdään kuviossa 3 ja kuviossa 4. Koettimet ovat hyödyllisiä "in situ" hybridisaatiossa tai jotta paikannetaan kudokset, jotka 10 ekspressoivat tätä geeniperhettä, tai näiden geenien tai niiden mRNA:n läsnäolon muihin hybridisaatiomäärityksiin erilaisissa biologisissa kudoksissa. Lisäksi syntetisoidut oligonukleotidit (tuotettu DNA-syntetisaattorilla), jotka on komplementaarisia DNA-molekyylin sekvenssille, 15 joka koodaa ihmisen 5-HTXD-reseptoria, ovat hyödyllisiä koettimina näille geeneille, niiden yhteen liittyneelle mRNArlle tai sukua olevien geenien eristämisessä genomi-sesta tai cDNA-kirjastoista homologiaseulomisella tai käyttämällä amplifikaatiotekniikkoja, kuten polymeraasi-20 ketjureaktio.
Tämä keksintö antaa myös menetelmän havaita 5-HT1D-resep-torin ekspression solun pinnalla havaitsemalla 5-HT1D-re-septoria koodaavan mRNA:n läsnäolo, mihin sisältyy että 25 saadaan kokonais-mRNA solusta käyttämällä alalla tunnet- tuja menetelmiä ja saattamalla siten saatu mRNA kosketuk-.···. siin nukleiinihappokoettimen kanssa, joka koostuu vähin- ;tään 15 nukleotidin nukleiinihappomolekyylistä, joka ky-! kenee spesifisesti hybridisoitumaan sekvenssin kanssa, 13.0 joka on ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaavan nukleiinihap- '·' * pomolekyylin sekvenssissä, hybridisaatio-olosuhteissa, o- soittamalla koettimeen hybridisoidun mRNA:n läsnäolo ja k t täten osoittaemalla solun ekspressoima 5-HT1D-reseptori.
V : Koettimien hybridisaatioon kohdenukleiinihappomolekyylei- .•35 hin, kuten mRNA-molekyylit, käytetään alalla tunnettuja « k· tekniikoita. Eräässä mahdollisessa keinossa suorittaa k k . tätä menetelmää nukleiinihapot uutetaan saostamalla lyy- k k k k k * k k k 110692 23 satuista soluista ja mRNA eristetään uutteesta käyttämällä pylvästä, joka sitoo mRNA-molekyylien poly-A-hännät. Sitten mRNA altistetaan radioaktiivisesti leimatulle ko-ettimelle nitroselluloosamembraanilla ja koetin hybridi-5 soituu ja siten leimaa komplementaariset mRNA-sekvenssit.
Sitoumista voidaan tarkkailla autoradiografiällä tai tui-kelaskimella. Ammattimiehille on kuitenkin tunnettuja muita menetelmiä suorittaa nämä vaiheet ja edellä ollut keskustelu on pelkästään esimerkki.
10 Tämä keksintö antaa antisense oligonukleotidin, jossa on sekvenssi, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan minkä tahansa mRNA-molekyylin, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria niin, että estetään mRNA-molekyylin translaatio, 15 sekvenssien kanssa. Antisense oligonukleotidillä saattaa olla sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti minkä tahansa cDNA-molekyylin sekvenssien kanssa, mikä sekvenssi nähdään kuviossa 3 tai cDNA-molekyylin kanssa, jonka sekvenssi nähdään kuviossa 4. Erityinen esimerkki 20 antisense oligonukleotidistä on antisense oligonukleoti- di, jossa on nukleotidien kemiallisia analogeja.
Tämä keksintö antaa farmaseuttisen koostumuksen, joka koostuu edellä kuvatusta määrästä oligonukelotidiä, joka 25 on tehokas vähentämään ihmisen 5-HT1D-reseptorin ekspres- Γ·’: siota kulkemalla solumembraanin läpi ja sitoutumalla spe- sifisesti solussa ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaavan m-; .·. RNA:n kanssa niin, että estetään sen translaatio ja far- '·,· maseuttisesti hyväksyttävä hydrofobinen kantaja, joka i * » kykenee kulkemaan solumembraanin läpi. Oligonukleotidi i · · • voidaan kytkeä aineeseen, joka inaktivoi mRNA:n, kuten ribotsyymi. Farmaseuttisesti hyväksyttävässä hydrofobi- i » * • *; sessa kantajassa, joka kykenee kulkemaan solumembraanien v * läpi, voi myös olla rakenne, joka sitoutuu reseptoriin, /35 joka on spesifinen valitulle solutyypille ja valitun so- • » lutyypin solut ottavat sen sisään. Rakenne voi olla osa • proteiinia, jonka tiedetään sitovan solutyyppi-spesifisen il·»* I I · I * » » 110692 24 reseptorin, esimerkiksi insuliinimolekyyli, jonka kohteena olisivat haimasolut. DNA-molekyylejä, joilla on olennaisesti samat koodaussekvenssit kuin kuviossa 3 nähdyt koodaussekvenssit tai koodaussekvenssit, jotka nähdään 5 kuviossa 4, voidaan käyttää farmaseuttisen koostumuksen oligonukleotideinä.
Tämä keksintö antaa myös menetelmän käsitellä epänormaalisuuksia, joita lievitetään vähentämällä 5-HT1D-resepto-10 rin ekspressiota, mihin kuuluu, että annetaan kohteelle edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta sellainen määrä, joka on tehokas vähentämään kohteen 5-HT1D-reseptorin ekspressiota. Tämä keksintö antaa vielä menetelmän käsitellä epänormaalia olotilaa, joka liittyy 5-HT1D-resepto-15 riaktiivisuuteen, mihin kuuluu, että annetaan kohteelle edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta sellainen määrä, joka on tehokas vähentämään kohteen 5-HTlc-reseptorin ekspressiota. Lukuisia esimerkkejä sellaisista epänormaaleista olotiloista on dementia, Parkinsonin tauti, syö-20 mishäiriö, sairaaloinen ahdistus tai migreeni päänsärky.
: .' Antisense oligonukleotidilääkkeet inhiboivat näitä resep- toreja koodaavan mRNA:n translaation. Synteettiset oli-: gonukleotidit tai muut antisense kemialliset rakenteet ·. 25 on suunniteltu sitoutumaan 5-HT1D-reseptoria koodaavaan mRNA:han ja inhiboimaan mRNA:n translaatiota ja ovat hyödyllisiä lääkkeinä inhiboimaan 5-HT1D-reseptorigeenien ekspressiota potilaissa. Tämä keksintö antaa keinot terapeuttisesti muuttaa ihmisen 5-HT1D-reseptorien ekspressio-, 30 tasoja käyttämällä synteettistä antisense oligonukleoti- ;t> dilääkettä (SAOD) , joka inhiboi näitä reseptoreja koodaa van mRNA:n translaation. Synteettiset oligonukleotidit tai : ·, muut antisense kemialliset rakenteet, jotka on suunniteltu ··_ tunnistamaan ja selektiivisesti sitoutumaan m-RNA:han, ‘' 35 on rakennettu olemaan komplemetaarisia osille nukleoti- disekvenssejä, jotka nähdään kuvion 3 tai kuvion 4, DNA:ssa, RNArssa tai kemiallisesti modifioituja, keinote- 25 1 10692 koisia nukleiinihapooja. SAOD on suunniteltu olemaan stabiili verenkierrossa annettaessa potilaille ruiskeella tai laboratoriosoluviljelmäolosuhteissa, annettavaksi soluille, jotka on poistettu potilaasta. SAOD on suunni-5 teltu niin, että se kykenee kulkemaan solumembraanien läpi mennäkseen solun sytoplasmaan SAOD:n fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien nojalla, mikä muuttaa sen kykeneväksi kulkemaan solumembraanien läpi (esim. suunnittelemalla pieniä, hydrofobisia SAOD-kemiallisia raken-10 teitä) tai tiettyjen kuljetussysteemien nojalla solussa, joka tunnistaa ja kuljettaa SAOD:n soluun. Lisäksi SAOD voidaan suunnitella annettavaksi vain tietyille valituille solupopulaatioille kohdentamalla SAOD niin, että spesifinen solun sisäänottomekanismi, joka sitoo ja ottaa 15 SAOD:n sisään vain tietyssä valitussa solupopulaatioissa, tunnnistaa sen. Esimerkiksi SAOD voidaan suunnitella sitoutumaan reseptoriin, jota on vain tietyssä solutyypissä, kuten edellä keskusteltiin. SAOD on myös suunniteltu tunnistamaan ja selektiivisesti sitoutumaan kohteena ole-20 vaan mRNA-sekvnssiin, joka voi vastata sekvenssiä, joka on kuviossa 4 ja 5 nähdyissä sekvensseissä, komplemetaa-risen mRNArhan emäspariutumisen nojalla. Lopuksi SAOD on suunniteltu inaktivoimaan kohteena oleva mRNA-sekvenssi millä tahansa kolmella mekanismilla: 1) sitoutumalla koh-25 teenä olevaan mRNA:han ja täten indusoimalla mRNA:n hajo- aminen solun sisäisillä mekanismeilla, kuten RNAasi I-: pilkkominen, 2) inhiboimalla mRNA-kohteen translaatio sekaantumalla translaatiota säätelevien tekijöiden tai j f; ribosomien sitomiseen tai 3) liittämällä muita kemialli- ,'30 siä rakenteita, kuten ribotsyymisekvenssit tai reaktiivi- set kemialliset ryhmät, jotka joko hajottavat tai kemiallisesti modifioivat kohde-DNA:n. Synteettisten antisense . , oligonukleotidilääkkeiden on osoitettu kykenevän edellä kuvattuihin ominaisuuksiin, kun ohjataan mRNA-kohteita ’•35 vastaan (J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sei. 10, 435 (19- 89); H.M. Weintraub, Sei. Am. January (1990) s. 40). Li-säksi ribotsyymien kytkeminen antisense oligonukleotidei- 26 1 10 6 9 2 hin on lupaava strategia kohteena olevan mRNA:n inakti-voimiseksi (N. Sarver et ai., Science 247, 1222 (1990)). SAOD toimii tehokkaana terapeuttisena aineena, jos se on suunniteltu annettavaksi potilaalle injektiolla tai jos 5 potilaan kohdesolut poistetaan, käsitellään SAOD:11a la boratoriossa ja korvataan potilaassa. Samalla tavalla SAOD toimii terapiana vähentämään reseptorin ekspressiota potilaan tietyissä kohdesoluissa, missä tahansa kliinisessä tilassa, mikä voi hyötyä vähentyneestä 5-HT1D-resep-10 torien ekspressiosta.
Tämä keksintö antaa vasta-aineen, joka on suunnattu ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, esimerkiksi monoklonaalinen vasta-aine, joka on suunnattu solun pinnalla olevan ihmisen 5-15 HT1D-reseptorin epitooppiin, ja jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin ihmisen 5-HT1D-reseptorin solu-pinnan epitoopin aminohapposekvenssi, joka sisältyy kuviossa 3 nähtyyn aminohapposekvenssiin tai sisältyy kuviossa 4 nähtyyn aminohapposekvenssiin. Aminohapposek-20 venssit voidaan analysoida alalla tunnetuin menetelmin, jotta määritetään, tuottavatko ne hydrofobisia tai hydro-fiilisiä alueita proteiineissa, joita ne rakentavat. So-lumembraaniproteiinien tapauksessa hydrofobisten alueiden tiedetään muodostavan osan proteiinista, joka insertoi-25 daan lipidikaksoiskerrokseen, joka muodostaa solumembraa- nin, koska hydrofiiliset alueet on sijoitettu solun pin-nalle vesipitoisessa ympäristössä.
: Siksi kuviossa 3 tai kuviossa 4 nähdyt hydrofiilisten a- ,'3Q minohapposekvenssien vasta-aineet sitoutuvat ihraisen 5- * i · HT1D-reseptorin pintaepitooppiin, kuten kuvattiin. Ihmisen * * » ‘ 5-HT1D-reseptoreihin suunnatut vasta-aineet voivat olla seerumista johdettuja tai monoklonaalisia ja valmistetaan * ♦ · käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi, • · · *39 monoklonaaliset vasta-aineet valmistetaan käyttämällä hybridomateknologiaa fuusioimalla vasta-aineita tuottavat B-solut immunisoiduista eläimistä myeloomasolujen kanssa * · · * · 110692 27 ja valikomalla saatu hybridoma solulinja, joka tuottaa toivottua vasta-ainetta. Soluja, kuten SR3T3-soluja tai Ltk-soluja voidaan käyttää immunogeeneinä nostamaan sellainen vasta-aine. Vaihtoehtoisesti, synteettiset pepti-5 dit voidaan valmistaa käyttämällä kaupallisesti saatavil la olevia koneita ja aminohapposekvenssejä, jotka nähdään kuviossa 3 tai kuviossa 4. Vielä lisävaihtoehtona voidaan DNA, kuten cDNA tai sen fragmentti, kloonata ja ekspres-soida ja saadut polypeptidit saada talteen ja käyttää im-10 munogeeninä. Nämä vasta-aineet ovat hyödyllisiä osoitet taessa eristetyn DNA:n koodaamien ihmisen 5-HT1D-resepto-rien läsnäolo tai inhiboimaan reseptorien toiminta elävissä eläimissä, ihmisissä tai biologisissa kudoksissa tai nesteissä, jotka on eristetty eläimistä tai ihmisis-15 tä.
Tämä keksintö antaa farmaseuttisen koostumuksen, mikä koostuu määrästä vasta-ainetta, joka on suunnattu ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, joka on tehokas blokkaamaan luonnolli-20 sesti esiintyvien ligandien sitomisen 5-HT1D-reseptoriin, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan. Monoklonaali-nen vasta-aine, joka on suunnattu solun pinnalla olevan ihmisen 5-HT1D-reseptorin epitooppiin, ja jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin ihmisen 5-HT^-re-25 septorin solupinnan epitoopin aminohapposekvenssi, joka sisältyy kuviossa 3 nähtyyn aminohapposekvenssiin tai si- • · · : ' : sältyy kuviossa 4 nähtyyn aminohapposekvenssiin, ovat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen.
,‘30 Tämä keksintö antaa myös menetelmän käsitellä epänormaali·, lisuuksia, joita lievitetään vähentämällä ihmisen 5-HT1D- reseptorin ekspressiota, mihin kuuluu, että annetaan koh-. . teelle edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta sellai- • / nen määrä, joka on tehokas blokkaamaan luonnollisesti e- •35 siintyvien ligandien sitomisen 5-HT1D-reseptoriin ja täten lievittäen ihmisen 5-HT1D-reseptorin yliekspressoitumises-ta johtuvia epänormaalisuuksia. Vasta-aineen sitoutuminen 1 mv 2 reseptoriin estää reseptoria toimimasta täten neutraloiden yliekspressoitumisen vaikutukset. Edellä kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet ovat molemmat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen. Tämä keksintö antaa lisäksi menetelmän 5 käsitellä epänormaalia tilaa, joka on läheisesti yhteen kuuluva 5-HT1D-reseptorin ylimääräisen aktiivisuuden kanssa, mihin kuuluu että annetaan kohteelle edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta sellainen määrä, joka on tehokas blokkaamaan luonnollisesti esiintyvien ligandien si-10 tömisen 5-HT1D-reseptoriin ja täten lievittäen epänormaa lia tilaa. Joitakin esimerkkejä sellaisista epänormaaleista olotiloista ovat dementia, Parkinsonin tauti, syömishäiriö, sairaaloinen ahdistus tai migreeni päänsärky.
15 Tämä keksintö antaa menetelmän osoittaa 5-HT1D-reseptorin läsnäolo solun pinnalla, mihin kuuluu että saatetaan solu kosketuksiin vasta-aineen kanssa, joka on suunnattu ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aineen sitoumisen reseptoriin, osoitetaan soluun si-20 toutuneen vasta-aineen läsnäolo ja täten ihmisen 5-HT1D- reseptorin läsnäolo solun pinnalla. Sellainen menetelmä on hyödyllinen määritettäessä, onko annettu solu vajavainen 5-HT1D-reseptorien ekspressoinnissa solun pinnalla. Sidotut vasta-aineet osoitetaan alalla tunnetuin menetel-25 min, esimerkiksi sitomalla fluoresoiva markkeri vasta- aineisiin ja tutkimalla solunäyte fluoresenssimikroskoo- « * * | ' ’ pin alla, jotta havaitaan solussa oleva fluoresenssi, joka on osoitus vasta-aineen sitomisesta. Edellä kuvatut l vasta-aineet ovat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen.
/30 ·;·. Tämä keksintö antaa transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria.
, , Tämä keksintö antaa myös transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, / joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-resep- ‘•35 toria, joka on niin mutatoitunut, että se ei kykene nor- maaliin reseptoriaktiivisuuteen ja ei ekspressoi natiivia 5-HT1D-reseptoria. Tämä keksintö antaa myös transgeenisen, 29 11069;:- ei-ihmisnisäkkään, jonka genomi koostuu antisense DNA: sta, joka on komplementaarinen DNA:n kanssa, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, joka on sijoitettu niin, että se transkriboidaan antisense mRNA:han, joka on komplemen-5 taarinen mRNA:n kanssa, joka koodaa 5-HT1D-reseptoria ja joka hybridisoituu mRNA:han, joka koodaa 5-HT1D-reseptoria täten vähentäen sen translaatiota. DNA:ssa voi lisäksi olla indusoituva promoottori tai voi lisäksi olla kudos-spesifiset säätelyelementit, niin että ekspressio voidaan 10 indusoida tai restriktoida spesifisiin solutyyppeihin. E- simerkkejä DNA:sta ovat DNA- tai cDNA-molekyylit, joiden koodaussekvenssi on olennaisesti sama kuin kuviossa 3 nähty koodaussekvenssi tai kuviossa 4 nähty koodaussekvenssi. Esimerkki transgeenisestä eläimestä on transgee-15 ninen hiiri. Esimerkkejä kudosspesifisyyttä määräävistä alueista ovat metallotioneiniipromoottori (Low, M.J., Lechan, R.M., Hammer, R.E. et ai. Science 231:1002-1004 (1986)) ja L7-promoottori (Oberdick, J., Smeyne, R.J., Mann, J.R., Jackson, S. ja Morgan, J.I. Science 248:223-20 226 (1990)).
Eläinmallisysteemit, jotka valaisivat ihmisen 5—HT1D—reseptorien fysiologisia ja käyttäytymisrooleja, tuotettiin luomalla transgeeniset eläimet, joissa 5-HT1D-reseptorin 25 ekspressio on joko lisääntynyt tai vähentynyt tai eks- ;i‘ pressoituneen 5-HT1D-reseptoriproteiinin aminohapposek- ·1·’: venssi on muuttunut, suurella määrällä tekniikkoja. Esi- merkkeihin näistä tekniikoista kuuluvat: 1) Insertoidaan : näiden geenien ihmisen 5-HT1D-reseptoria tai homologisia t'15Q eläinversioita koodaavan DNA:n normaali- tai mutanttiver-
• t I
siot mikroinjektiolla, retroviraalisella infektiolla tai * · · • t· ' muilla ammattimiehelle tunnetuin keinoin, sopiviin hedel- möitettyihin alkioihin transgeenisen eläimen tuottamisek- i 1 t si (Hogan B et ai. Manipulating the Mouse Embryo, A Labo-:39 ratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory (1986). 2) : Näiden geenien mutantti- tai normaali-, ihmis- tai eläin- versioiden homologinen rekombinaatio (Capecchi M.R. Sei-
* I
t t » » 110692 30 ence 244:1292 (1989); Zimmer, A. ja Gruss, P. Nature 338: 150-153 (1989)) natiivin geenilokuksen kanssa transgeeni-sissä eläimissä ekspression säätelyn tai näiden 5-HT1D-reseptorien rakenteen muuttamiseksi. Homologisen rekom-5 binaation tekniikka on alalla tunnettu. Se korvaa natii vin geenin insertoidulla geenillä ja on siten hyödyllinen tuottamaan eläimen, joka ei voi ekspressoida natiivia reseptoria, mutta ekspressoi esimerkiksi insertoitua mu-tanttireseptoria, joka on korvannut natiivin reseptorin 10 eläimen genomissa rekombinaatiolla johtaen reseptorin aliekspressioon. Mikroinjektio lisää geenejä genoraiin, mutta ei poista niitä ja on siten hyödyllinen tuottamaan eläimen, joka ei ekspressoi sen omia ja lisättyjä reseptoreja johtaen reseptorin yliekspressioon. Eräs saatavil-15 la oleva keino tuottaa transgeenistä eläintä, hiiri esi merkkinä, on seuraava: Naarashiiret paritetaan ja saadut hedelmöitetyt munat leikellään ulos niiden munanjohtimis-ta. Munat varastoidaan sopivassa alustassa, kuten M2-a-lusta (Hogan B. et ai. Manipulating the Mouse Embryo, A 20 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)).
Ihmisen 5-HT1D-reseptoria koodaava DNA tai cDNA puhdistetaan vektorista (kuten edellä kuvattu plasmidi p5HT-8-30-84 tai p5HT-ll) alalla tunnetuin menetelmin. Indusoitavat promoottorit voidaan fuusioida DNA:n koodausalueen kanssa 25 antamaan kokeelliset keinot säädellä trans-geenin eks- pressiota. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi kudosspesifiset **·’: säätelyelementit voidaan fuusioida koodausalueen kanssa trans-geenin kudosspesifisen ekspression sallimiseksi.
; DNA, sopivasti puskuroidussa liuoksessa, laitetaan mik- i · * I | · · ,‘3Q roinjektioneulaan (joka voidaan tehdä kapillaariputkesta käyttämällä pipettivedintä) ja injektoitava muna laite- « » · taan objektilasin painumaan. Neula insertoidaan munan e-situmaan ja DNA-liuos injektoidaan. Injektoitu muna siir- f » · *· *· retään sitten valeraskaan hiiren munajohtimeen (hiiri '33 stimuloitu sopivilla hormooneilla ylläpitämään raskautta, t mutta joka ei todellisuudessa ole raskaana), mistä se e- tenee kohtuun, kiinnittyy ja kehittyy määräaikaan. Kuten * * * t » » » * » t * edellä mainittiin, ei mikroinjektio ole ainoa menetelmä insertoida DNA:ta munasoluun ja käytetään tässä vain esi merkilliseen tarkoitukseen.
,, 110652 5 Koska reseptori-spesifisten lääkkeiden normaalin toimin nan tarkoitus on aktivoida tai inhiboida reseptoria, e-dellä kuvatut transgeeniset eläinmallisysteemit ovat hyödyllisiä testaamaan näitä 5-HT1D-reseptoreja vastaan suunnattujen lääkkeiden biologista aktiivisuutta jopa ennen 10 kuin sellaiset lääkkeet tulevat saataville. Nämä eläin mallisysteemit ovat hyödyllisiä ennustettaessa tai arvioitaessa lääkkeiden, jotka aktivoivat tai inhiboivat näitä 5-HT1D-reseptoreja indusoimalla tai inhiboimalla natii-vin tai trans-geenin ekspressiota ja täten lisäten tai 15 vähentäen normaalien tai mutantti-5-HT1D-reseptorien eks pressiota elävässä eläimessä, mahdollisia terapeuttisia sovellutuksia. Täten tuotetaan mallisysteemi, jossa lääkkeiden biologinen aktiivisuus, joka on suunnattu näitä 5-HT1D-reseptoreja vastaan, arvioidaan ennen kuin sellaiset 20 lääkkeet tulevat saataville. Transgeeniset eläimet, jotka yli- tai alituottavat 5-HT1D-reseptoria, osoittavat fysiologisella tilallaan, onko 5-HT1D-reseptorin yli- vai ali-tuotanto terapeuttisesti hyödyllistä. Siksi on hyödyllistä arvioida lääkkeen toiminta perustuen transgeeniseen 25 mallisysteemiin. Yksi käyttö perustuu tosiasiaan, että ψ '!* alalla on tunnettua, että lääke, kuten masennusta ehkäi- sevä lääke toimii blokkaamalla neurotransmitter in sisään-ottoa ja täten lisää neurotransmitterin määrää synapti- * »· sessa halkeamassa. Tämän toiminnan fysiologinen tulos on ,stimuloida kohdatut solut tuottamaan vähemmän reseptoria, • » ( johtaen todennäköisesti aliekspressioon. Siksi eläin, ‘ joka aliekspressoi reseptoria, on hyödyllinen testisys- teeminä tutkimaan, ovatko sellaisten lääkkeiden, jotka t t * *· ' johtavat aliekspressioon, toiminnat tosiasiassa terapeut- ‘33 tisia. Toinen käyttö on, että jos yliekspression havai- ; . ; taan johtavan epänormaalisuuksiin, silloin lääke, joka » » alisäätelee tai toimii antagonistina 5-HTXD-reseptorille,
♦ » I > I
32 11069: on osoitettu kehittämisen arvoiseksi ja jos lupaava terapeuttinen sovellutus paljastetaan näillä eläinmallisys-teemeillä, saavutetaan 5-HT1D-reseptorin aktivaatio tai inhibiitio terapeuttisesti joko tuottamalla agonisti- tai 5 antagonisti-lääkkeitä, jotka on suunnattu näihin 5-HT1D- reseptoreihin tai millä tahansa menetelmällä, joka lisää tai vähentää näiden 5-HT1D-reseptorien ekspressiota ihmisessä.
10 Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset ekspressoitaessa vaihtelevia tasoja ihmisen 5-HT1D-reseptoreja, mihin kuuluu että tuotetaan transgee-ninen ei-ihmiseläin, jonka ihmisen 5-HT1D-reseptorin eks-pressiotasoja vaihdellaan käyttämällä indusoituvaa pro-15 moottoria, joka säätelee ihmisen 5-HT1D-reseptorin eks pressiota. Tämä keksintö antaa myös menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset ekspressoitaessa vaihtelevia tasoja ihmisen 5-HT1D-reseptoreja, mihin kuuluu että tuotetaan transgeeninen ei-ihmiseläinten paneeli, joista jo-20 kainen ekspressoi eri määrän ihmisen 5-HT1D-reseptoria.
Sellaisia eläimiä voidaan tuottaa viemällä eri määrät DNA:ta, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, varhais-munasoluihin, joista transgeeniset eläimet kehittyvät.
...25 Keksintö antaa myös menetelmän tunnistaa aineen, joka : kykenee lievittämään ihmisen 5-HT1D-reseptorin yliekspres- : .* siosta johtuvia epänormaalisuuksia, mihin sisältyy että : annetaan ainetta transgeeniselle ei-ihmisnisäkkäälle, ;\{ joka ekspressoi ainakin yhtä keinotekoisesti tuotua DNA- . :30 molekyyliä, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria ja mää ritetään, lievittääkö aine fysikaalisia ja käyttäytymi-. . seen liittyviä epänormaalisuuksia, joita transgeeninen ; ei-ihmisnisäkäs osoittaa ihmisen 5-HT1D-reseptorin ylieks- ‘ ’ pressoitumisen tuloksena. Esimerkkejä DNA-molekyyleistä :’35 ovat DNA- tai cDNA-molekyylit, joilla on olennaisesti ·:·*: samat koodaussekvenssit kuin kuviossa 3 nähdyt tai ku- ‘, viossa 4 nähdyt koodaussekvenssit.
• I » « * 4 33 110692
Keksintö antaa farmaseuttisen koostumuksen, joka koostuu määrästä ainetta, joka on kuvattu supra, joka on tehokas lievittämään epänormaalisuuksia, jotka johtuvat 5-HT1D-5 reseptorin yliekspressoitumisesta ja farmaseuttisen kan tajan.
Tämä keksintö antaa vielä menetelmän käsitellä epänormaalisuuksia, jotka johtuvat ihmisen 5-HT1D-reseptorin yli-10 ekspressoitumisesta, mihin sisältyy, että annetaan koh teelle määrä farmaseuttista edellä kuvattua koostumusta, joka on tehokas lievittämään epänormaalisuuksia, jotka johtuvat ihmisen 5-HT1D-reseptorin yliekspressoitumisesta.
15 Tämä keksintö antaa menetelmän tunnistaa aineen, joka kykenee lievittämään epänormaalisuuksia, jotka johtuvat ihmisen 5-HT1D-reseptorin aliekspressoitumisesta, mihin sisältyy, että annetaan ainetta edellä kuvatulle trans-geeniselle ei-ihmisnisäkkäälle, joka ekspressoi vain ei-20 toiminnallista ihmisen 5-HT1D-reseptoria ja määritetään, lievittääkö aine fysikaalisia ja käyttäytymiseen liittyviä epänormaalisuuksia, joita transgeeninen ei-ihmisni-säkäs osoittaa ihmisen 5-HT1D-reseptorin aliekspressoitu-misen tuloksena.
..:¾ »* · • V Keksintö antaa farmaseuttisen koostumuksen, joka koostuu : : määrästä ainetta, joka on tehokas lievittämään epänormaa- : lisuuksia, jotka johtuvat 5-HT1D-reseptorin aliekspressoi- ./.,: tumisesta, ja farmaseuttisen kantajan.
Tämä keksintö antaa vielä menetelmän käsitellä epänormaa-, . lisuuksia, jotka johtuvat ihmisen 5-HT1D-reseptorin ali- ekspressoitumisesta, mihin sisältyy, että annetaan koh-'•l ' teelle määrä farmaseuttista edellä kuvattua koostumusta, :[35 joka on tehokas lievittämään epänormaalisuuksia, jotka ·:*·': johtuvat ihmisen 5-HT1D-reseptorin aliekspressoitumisesta.
34 110692 Tämä keksintö antaa menetelmän diagnosoida taipumuksen häiriöön, joka liittyy spesifisen ihmisen 5-HT1D-resepto-rialleelin ekspressioon, mihin sisältyy: a. saadaan DNA:-ta kohteelta, jolla on häiriö; b. suoritetaan DNA:n rest-5 riktiopilkkominen restriktioentsyymien paneelilla; c. e- rotetaan elektroforeettisesti saadut DNA-fragmentit kokoon perutuvassa geelissä; d. saattamalla saatu geeli kosketuksiin nukleiinihappokoettimen kanssa, joka spesifisesti kykenee hybridisoitumaan DNA:hän, joka koodaa 10 ihmisen 5-HT1D-reseptoria ja joka on leimattu osoitetta valla markkerilla; e. osoitetaan leimatut juovat, jotka ovat hybridisoituneet DNA:hän, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoria, joka on leimattu osoitettavalla markkerilla, jotta luodaan ainutlaatuinen juovakuvio, joka on spesifi-15 nen häiriöstä kärsivien kohteiden DNA:lie; f. valmiste taan saatu DNA diagnoosia varten vaiheilla a-e; ja g. verrataan ainutlaaatuista juovakuviota, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien kohteiden DNA:lie vaiheesta e ja DNA:ta, joka saatiin diagnoosia varten vaiheesta f, jotta 20 määritetään, ovatko kuviot samat vai erilaiset ja täten diagnosoidaan alttius häiriölle, jos kuviot ovat samat. Tätä menetelmää voidaan myös käyttää diagnosoimaan häiriötä, joka liittyy spesifisen S-HT^-reseptorialleelin ekspressioon.
...'25 • V Tämä keksintö antaa menetelmän valmistaa eristetty 5-HT1D- : reseptori, mihin sisältyy että indusoidaan solut ekspres- • soimaan 5-HT1D-reseptoria, otetaan reseptori talteen saa- : duista soluista ja puhdistetaan siten talteenotettu re- ,:3.0 septori. Esimerkki eristetystä 5-HT1D-reseptorista on e- ristetty proteiini, jolla on olennaisesti sama aminohap-. . posekvenssi kuin kuviossa 3 nähty aminohapposekvenssi.
Toinen esimerkki eristetystä 5-HT1D-reseptorista on eris-'·’ ‘ tetty proteiini, jolla on olennaisesti sama aminohappo- :’·35 sekvenssi kuin kuin kuviossa 4 nähty aminohapposekvenssi.
·:·· Solut voidaan esimerkiksi indusoida ekspressoimaan resep toreja altistamalla aineille, kuten hormonit. Sitten so- I * 35 110692 lut voidaan homogenisoida ja reseptori eristetään homo-genaatista käyttämällä affiniteettipylvästä, missä on esimerkiksi serotoniinia tai toista ainetta, jonka tiedetään sitoutuvan reseptoriin. Saadut fraktiot voidaan sit-5 ten puhdistaa saattamalla ne kosketuksiin ioninvaihtopyl- vään kanssa ja määritetään, missä fraktiossa on resepto-riaktiivisuutta tai sitoo anti-reseptori-vasta-aineita.
Tämä keksintö antaa menetelmän valmistaa eristetty 5-HT1D-10 reseptori, mihin sisältyy että insertoidaan 5-HT1D-resep- toria koodaava nukleiinihappo sopivaan reseptoriin, insertoidaan saatu vektori sopivaan isäntäsoluun, otetaan talteen saadulla solulla tuotettu reseptori ja puhdistetaan siten saatu reseptori. Esimerkki eristetystä 5-HT1D-15 reseptorista on eristetty proteiini, jolla on olennaises ti sama aminohapposekvenssi kuin kuviossa 3 nähty aminohapposekvenssi. Toinen esimerkki eristetystä 5-HT1D-resep-torista on eristetty proteiini, jolla on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin kuviossa 4 nähty aminohappo-20 sekvenssi. Tämä menetelmä 5-HTj.D-reseptorin valmistamisek si käyttää alalla tunnettuja rekombinantti-DNA-teknolo-giamenetelmiä. Esimerkiksi eristetty nukleiinihappo, joka koodaa 5-HT1D-reseptoria, insertoidaan sopivaan vektoriin, kuten ekspressiovektori. Sopiva isäntäsolu, kuten baktee-..35 risolu tai eukaryoottinen solu, kuten hiivasolu, trans- : * : fektoidaan vektorilla. 5-HT1D-reseptori eristetään kasva- tusalustasta af f initeettipuhdistuksella tai -kromatogra- : fialla tai muilla alalla tunnetuin menetelmin.
• · * · ,•£9 Keksintö antaa antaa antisense oligonukleotidin, jolla on sekvenssi, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan minkä . . tahansa mRNA-molekyylin, joka koodaa reseptoria niin että ’; · estetään mRNA-molekyylin translaatio, sekvenssien kanssa.
:’35 Tämä keksintö antaa myös transgeenisen ei-ihmisnisäkkään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa reseptoria.
110692 36 Tämä keksintö antaa vielä transgeenisen ei-ihmisnisäk-kään, joka ekspressoi DNA:ta, joka koodaa reseptoria, joka on niin mutatoitunut, ettei se kykyne normaaliin reseptoriaktiivisuuteen eikä ekspressoimaan natiivia re-5 septoria.
Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja reseptoreja, mihin sisältyy että tuotetaan transgeeninen ei-10 ihmiseläin, jonka reseptorin ekspressiotasot vaihtelevat käytettäessä indusoituvaa promoottoria, joka säätelee reseptorin ekspressiota.
Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää fysiologiset 15 vaikutukset, kun ekspressoidaan vaihtelevia tasoja resep toreja, mihin kuuluu että tuotetaan transgeenisten ei-ihmiseläinten paneeli, joista jokainen ekspressoi erilaisen määrän reseptoria.
20 Tämä keksintö antaa vielä transgeenisen ei-ihmisnisäk- kään, jonka genomi koostuu antisense-DNA:sta, joka on komplementaarinen DNA:lie, joka koodaa reseptoria, joka on sijoitettu niin, että se transkriptoidaan antisense-m- RNA:ksi, joka on komplementaarinen mRNA:lie, joka koodaa ...25 reseptoria, ja joka hybridisoituu mRNA:n kanssa, joka • V koodaa reseptoria täten estäen translaation.
• · « | · ! Tämä keksintö antaa menetelmän määrittää, voiko ligandi, :\j jonka ei tiedetä kykenevän sitoutumaan reseptoriin, si- ,:ao toutua reseptoriin, mihin sisältyy, että saatetaan nisä- kässolu, joka koostuu eristetystä DNA-molekyylistä, joka . . koodaa reseptoria, kosketuksiin ligandin kanssa olosuh- teissä, jotka sallivat ligandien, joiden tiedetään sitou- I t « ’* ’ tuvan reseptoriin, sitoutumisen, osoitetaan minkä tahansa :’’3S ligandin, joka on sitoutunut reseptoriin, läsnäolo ja tä- ·;··· ten määritetään, sitoutuuko ligandi reseptoriin.
37 110 6 9 2
Hakijat ovat tunnistaneet yksittäisiä reseptorin alatyypin proteiineja ja ovat kuvanneet menetelmät farmakologisten yhdisteiden tunnistamiseksi terapeuttisia käsittelyjä varten. Farmakologisista yhdisteistä, jotka on suun-5 nattu spesifisiä reseptorin alatyyppejä vastaan, saadaan tehokkaita uusia terapioita minimaalisilla sivuvaikutuksilla.
5-HT1D-reseptorin alatyyppi osoitettiin ensimmäiseksi nau-10 dan aivojen nukleus caudatuksessa. On laajasti hyväksyt tyä, että 5-HT1D on 5-HT1D-reseptorin ei-jyrsijä-analogi, jolla on vahva sijainti basaaligangliossa (Schmidt ja Peroutka, FASEB J. 3:2242 (1989)). Koska basaaligangliot ovat mukana liikkeen kontrollissa, on 5-HT1D-reseptori 15 tärkeä liikkeen kontrollissa. Lisäksi aikaisempien 5-HTi- reseptoria koskevien raporttien uudelleentutkiminen Parkinsonin tautipotilaissa, äskettäin kuvatun 5-HT1D-resep-tori-farmakologian valossa, tuottaa mielenkiintoisen havainnon. Parkinsonin potilaat, joilla on dementiaa, o-20 soittavat suurta 5-HTj-reseptorien vähenemistä frontaa- lissa aivokuoressa. (Cross, A.J., Crow, T.J., Johnston, J.A., Perry, E. K., Perry, R.H., Blessed, G. ja Tomlinson, B.E., J. Neurol. Sei. 60:383-392, (1989)). Tämän alueen on äskettäin osoitettu sisältävän pääasiassa 5-/,25 HTlD-reseptoreja 5-HTi-luokassa. (Herrick-Davis, K., Tite- i ·’: ler, M., Leonhardt, S., Struble, R. ja Price, D., J. Neu- /": rochem. 51: 1906-1912 (1988)). Tämä materiaali osoittaa, : että 5-HTi-agonistilla on merkittävä terapeuttinen arvo « * · t : parannettaessa Parkinsonin taudin dementiaa ja muiden i * t '3Ö dementioiden, joihin 5-HTi-reseptorit liittyvät, käsitte lyssä.
5-HT1D-reseptorit ovat osallisena syömiskäyttäytymisen v * säätelyssä, täten antaen hoidon liikalihavuudelle ja mah- /35 dollisen syvän ymmärryksen anorexialle ja bulimialle.
Rottamalleissa 5-HT1D-reseptorianalogi 5-HT1D on ollut o- • Sallisena syömisessä. 5-HT1D-reseptorin agonistit, kuten
Mill * » t i e • » 38 110691: RU 24924 (mutta ei DPAT) ja mCPP molemmat vähentävät syömistä (Hutson, P.H., Kennett, G.A., Donohoe, T.P., Dou-rish, C.T. ja Curzon, G. teoksessa Behavioral Pharmacology of 5-HT, Bevan, P., Cools, A.R., ja Archer, T., toim.
5 Lawrence Erlbaum Associates, Publishers; N.J. (1989) ss.
283-286; Samanin, R. teoksessa Behavioral Pharmacology of 5-HT, Bevan, P., Cools, A.R., ja Archer, T., toim. Lawrence Erlbaum Associates, Publishers; N.J. (1989) ss.
259- 283). Muissa tutkimuksissa 5-HT1D-reseptori-anta-10 gonistit aiheuttavat anorexiaa (Leander, J.D., teoksessa
Behavioral Pharmacology of 5-HT, Bevan, P., Cools, A.R., ja Archer, T., toim. Lawrence Erlbaum Associates, Publishers; N.J. (1989) ss. 287-290). 5-HT1D-reseptorien sijainti nucleus accubensissa (Samanin, 1989, ibid.) syö-15 miskäyttätymisen neuraalisubstraattiosa, osoittavat että 5-HT1D-agonisteilla on terapeuttista arvoa liikalihavuuden kontrollissa. Lisäksi 5-HT1D-antagonistit ovat hyödyllisiä kumotessa endogeenistä anorexiaa ja bulimisen käyttäytymisen kontrollissa.
20 5-HT1D-reseptorit ovat mukana myös ahdistuksessa. Rotta-analogimallissa 5-HT1D-reseptoriagonistien on raportoitu vähentävän säpsähdysvastetta rotissa ja vaikuttavan puolustavaan hautaamiskäyttäytyrniseen (Bevan, P., Lorens, S. ;25 ja Archer, T. teoksessa Behavioral Pharmacology of 5-HT,
Bevan, P., Cools, A.R., ja Archer, T., toim. Lawrence r ·
Erlbaum Associates, Publishers; N.J. (1989) ss. 459-474).
; .·, Molemmat paradigmat osoittavat ihmisen 5-HT1D-agonistien : mahdollisia terapeuttisia osuuksia ahdistusta lievittävi- a < · Ϊ30 nä. Lisäksi johimbiinin (5-HT1D-antagonisti) on osoitettu » · · ' pahentavan paniikkikohtauksia ihmisessä (Charney, D.S.,
Henenger, G.R. ja Breier, A., Arch. Gen. Psychiat. 41; ;· : 751-763 (1984)).
.'35 Paras osoitettu terapeuttinen 5-HT1D-reseptorifarmakolo- gian sovellutus on migreenin hoito. Suraatriptaanin, tiet-• tyjen 5-HT1D-reseptorikohtien agonisti, on osoitettu ole-
t . t M
a · * » 110692 39 van tehokas akuuttien migreenikohtauksien kontrollissa kliinisissä tutkimuksissa (Doenicke, A., Melchart, D., Bayliss, E.M., Caphalalgia 9 suppl 9:89-92 (1989)), jolla on muutama sivuvaikutus ja hyvä tehokkuus (Baer, H.A., 5 Brand, J., Doenicke, A., Melchart, D., Tryba, M. ja Sah- lender, H.M., Cephalalgia 9 (suppl 9): 83-87 (1989), Perrin, V.L., Parkkila, J., Goasguen, J., Doenicke, A., Brand, J. ja Tfelt-Hansen, P., Cephalalgia 9 (suppl 9) 63-72, (1989)). Sumatripaani näyttää olevan tehokas, ei 10 ainoastaan päänsärkyä vastaan, vaan myös kuvotusta, pa hoinvointia ja migreenipotilaiden kärsimiin tuntohäiriöihin. Hakijat ovat osoittaneet (taulukko 1), että sumat-riptaanilla on äärettömän suuri affiniteetti ihmisen 5-HTiu.!- ja 5-HT1D_2-reseptoreihin.
15 Tämä keksintö tunnistaa nyt ensimmäisen kerran kaksi uutta reseptoriproteiinia, niiden aminohapposekvenssit ja niiden ihmisen geenit. Lisäksi tämä keksintö kuvaa aikaisemmin tunnistamattoman ryhmän reseptoreja, jotka sisäl-20 tyvät 5-HT1D-reseptorin kuvaukseen. Tämän havainnon tuoma tieto ja kokeelliset työvälineet ovat hyödyllisiä tuottamaan uusia terapeuttisia aineita ja uusia terapeuttisia tai diagnostisia määrityksiä näille uusille reseptoripro-teiineille, niihin liittyneille mRNA-molekyyleille tai ,.&5 niihin liittyvälle genomiselle DNA:lie. Tämän havainnon f ’! tuoma tieto ja kokeelliset työvälineet tulevat olemaan hyödyllisiä tuottamaan uusia terapeuttisia aineita ja i * * > uusia terapeuttisia tai diagnostisia määrityksiä näille t t * * : uusille reseptoriproteiineille, niihin liittyneille mRNA- , ;3,0 molekyyleille tai niihin liittyvälle genomiselle DNA:lie.
i * * , , Erityisesti tämä keksintö koskee ensimmäistä ihmisen I ’ * 'cDNA:n ja genomisten kloonien, jotka koodaavat 5-HT1D-re-
> t I
'·[ * septoreja, eristystä. Kaksi uutta ihmisen reseptorien •*'3j5 geeniä, jotka on tunnistettu tässä S-HT^^ksi ja 5-HT1D_ ;·'* 2:ksi, on tunnistettu ja karakterisoitu ja sarja lähei sesti yhteenkuuluvia cDNA- ja genomisia klooneja on eris- i * « · » » » I * t t » t ♦ 40 110692 tetty. Lisäksi ihmisen 5-HT1D-reseptoreja on ekspressoitu Ltk-soluissa transfektoimalla solut plasmideilla pcEXV-8-30-84 ja pSVL-11. Koodattujen proteiinien farmakologiset sitomisominaisuudet on määritetty ja nämä sitomisominai-5 suudet luokittavat nämä proteiinit serotoniini 5-HT1D-re- septoreiksi. On rakennettu nisäkässolulinjat, jotka eks-pressoivat näitä ihmisen 5-HT1D-reseptoreja solun pinnalla, täten luoden ensimmäiset hyvin kuvatut, viljellyt so-lulinjat, joiden kanssa näitä 5-HT1D-reseptoreja tutkitaan.
10
Keksintöä ymmärretään paremmin viittaamalla seuraaviin kokeellisiin yksityiskohtiin, mutta ammattimies ymmärtää helposti, että kuvatut spesifiset kokeet ovat vain keksintöä valaisevia, kuten on kuvattu täydellisemmin pa-15 tenttivaatimuksissa, jotka seuraavat niiden jälkeen.
Kokeelliset yksityiskohdat:
Koiran RDC4-creenin eristäminen 20 Koiran RDC4-geeni (Libert et ai. Science 244:569-572, ····’ 1989) eristettiin edellytyksenä eristää ihmisen 5-HT]D- ·' . geenien kloonit. RDC4 saatiin eristämällä kloonit koiran ·...' genomisesta kirjastosta (Stratagene) oligonukelotidi- koettimella, joka on komplementaarinen RDC4-geenin laa-: ·. 25 jalle sytoplasmiselle silmukalle. Päällekkäin menevät oligomeerit, jotka olivat komplementaarisia koiran RDC4-sekvenssin kanssa (GenBank, tallennusnumero X14049), leimattiin ,zP-dATP:llä ja ’~P-dCTP:llä synteesissä suuren DNA-polymeraasifragmentin kanssa (Maniatis et ai. Mo-30 lecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982). Kloonit, jotka osoittivat positiivista hybridisaatiota koetti-'miin, kerättiin ja insertit alakloonattiin plasmidiin pUC-18 (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Sekvenssointi San-·;· gerin didesoksi-menetelmällä vahvisti kloonin, jossa oli ' 35 koko geenin koodausalue, eristämisen.
41 110692
Kahden ihmisen 5-HT.. aenomisen kloonin eristäminen
Ihmisen istukan genominen kirjasto (Stratagene) seulottiin 1,3 kiloemäksen (kb) Hind ΙΙΙ-Sph I-fragmentilla 5 koiran RDC-4-kloonista. Koetin leimattiin 32P:llä satun naisella alukkeen käytöllä (A.P. Feinberg ja B. Vogel-stein, Anal. Biochem. 137:266 (1984)). Hybridisaatio suoritettiin 40°C:ssa liuoksessa, jossa oli 50 % formamidia, 10 % dekstraanisulfaattia, 5X SSC:tä (IX SSC on 0,15 M 10 natriumkloridi, 0,015 M natriumsitraatti), 1 X Denhardt's (0,02 % polyvinyylipyrrolidoni, 0,02 % Ficoll ja 0,02 % naudanseerumialbumiini) ja 200 μg/ml sonikoitua lohen sperma-DNA:ta. Suodattimet pestiin 50°C:ssa 0,1 X SSC: llä, jossa oli 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja 15 altistettiin -70°C:ssa Kodak XAR-filmille vahvistusvar- jostimen läsnäollessa. Lambda-faagi, joka hybridisoitui koettimeen, puhdistettiin ja DNA valmistettiin Southern Blot-analyysiä varten (Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982; E. Southern, J. Mol.
20 Biol. 98:503, 1975). Alakloonausta ja vielä lisäksi tule vaa Southern blot-analyysiä varten DNA insertoitiin pUC-18:aan.
cDNA-kloonien eristäminen •^•5
Ihmisen aivoturson cDNA-kirjasto (Stratagene) seulottiin .···. oligonukelotidikoettimella, joka oli johdettu koiran >/’·, RDC4-sekvenssistä (vastaten aminohappoasemia numero 165- V ! 188 RDC4-sekvenssissä kuviossa 6, mikä kuuluu transmem- i « · ( I · ;,30 braanialueeseen IV). Päällekkäin menevät oligoraeerit lei- ·’ mattiin 32P-dATP:llä ja 32P-dCTP:llä, kuten edellä (kokeel liset yksityiskohdat) kuvattiin ja hybridisaatiot ja pe-sut suoritettiin, kuten edellä kuvattiin genomisille 4 4* ·,· · klooneille (kokeelliset yksityiskohdat).
.•35 f * · I » 42 11069.' DNA-sekvenssointi
Nukleotidisekvenssianalyysi suoritettiin Sangerin di-desoksi nukleotidiketjuterminaatiomenetelmällä (S. San-5 ger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463-5467, 1977) denaturoituihin kaksijuosteisiin plasmidimallisäikeisiin (Chen ja Seeburg, DNA 4: 165, 1985) käyttämällä Sequena-sea (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio).
10 3H-5HT-sitomismääritvkset 3H-5HT (20,8-284 Ci/mMol; DuPont, NEN, Wilmington, DE) käytettiin radioligandina osoittamaan 5-HT-geenituottei-den ekspressiota membraanifraktioissa, jotka eristettiin 15 joko lyhytaikaisesti tai stabiilisti transfektoiduista solulinjoista (katso ekspressio). Inkubaatiopuskurissa oli: 50 mM Tris-Cl pH 7,4, 10 mM MgS04, 0,5 mM EDTA, 1% askorbiinihappoa ja 0,1 mM pargyliiniä. Inkubaatiot aloitettiin lisäämällä solumembraaneja (10-50 Mg/kaivo) 96 20 kaivon mikrotiitterilevyillä, joissa oli 3H-5HT (lopulli nen pitoisuus 10~4-10~5 M) 250 μ1:η lopullisena tilavuutena. 15 min kuluttua 37°C:ssa (pimeässä) inkubaatio lopetettiin nopealla suodatuksella käyttämällä Brandel Cell Harvester (Model 48R; Brandel, Gaithersville, MD). Spesies finen sitoutuminen oli 70-80 % kokonaissitoutumisesta käyttämällä 10‘s M 5-HT:tä kuvaamaan ei-spesifistä sitou-tumista. Kilpailututkimuksia varten lääkkeet seulottiin : aluksi pitoisuuksissa, jotka olivat 1-10 x niiden rapor- : toidut Kx-arvot 5-HT1D-reseptorisitomiselle. Radioaktiiviko suus, joka jäi GF/B-suodatinliuskille, määritettiin nes- » · · * tetuikespektroskopialla Beckman LS5000 TA tuikelaskimessa käyttämällä Ready safe nestetuikeseosta (Beckman Instru-ments, Fullerton, CA) 50-55 % tehokkuudella.
i · · 110692
Kokeelliset tulokset;
Genomisten ia cDNA-kloonien. jotka koodaavat 5HTlD-resep-toreia. eristäminen 5
Olemme seuloneet ihmisen istukan genomista kirjastoa 1,3 kb Hind ΙΙΙ-Sph I-restriktiofragmentilla, joka oli johdettu koiran RDC-4-kloonista. Eristettiin yhteensä 5 ihmisen kloonia ja karakterisoitiin restriktioendonukle-10 aasikartoituksella ja DNA-sekvenssianalyysillä. Restrik- tioanalyysissä kaikkien viiden kloonin pääteltiin olevan erilaisia. Sekvenssianalyysillä kaksi kloonia, genominen hP-8 (ihmisen istukka-8, human Placenta-8) ja genominen klooni hP-84, olivat erittäin homologisia nukleotidita-15 solia (n. 90 %) koiran RDC4:n kanssa. Sekvenssianalyysin jälkeen määritettiin, että genominen klooni hP-8 sisälsi sekvenssin, joka koodasi 5' ei-transloitua (5' UT) aluetta, aminoterrainuksen (NH2) ja reseptorin transmembraani-alueet I-III (TM I-III), mikä näyttää edustavan ihmisen 20 homologiaa koiran RDC4:stä. Genomisessa kloonissa hP-84 oli sekvenssi, joka vastasi TM V-VII:ää, samoin kuin kar-boksiterminus ja 3' UT tästä geenistä. Transmembraanisen alueen IV havaittiin olevan läsnä kolmannessa kloonissa, genominen klooni hP-30. Nämä kolme genomista kloonia yh-•^5 teisesti ulottuivat yli koko geenin koodausalueen ja e- dustavat ihmisen versiota RDC4:stä. Tämän uuden ihmisen ,···. reseptorin geeniä merkitään geeni 8-30-84. cDNA-kloonit, : jotka vastaavat geeniä 8-30-84, on eristetty ihmisen ai- ! voturso-kirjastosta (Strategene) ja niitä merkitään cDNA- ;.?0 klooni hH-13 (ihmisen aivoturso-13, human Hippocampus-13) ’·' " ja cDNA-klooni hH-46 (kuvio 1). cDNA-kloonit hH-13 ja hH- 46 yhteisesti ulottuvat yli koko tämän geenin koodausalu-•. ’ *: een.
.•35 Eristettiin ja karakterisoitiin lisäksi kaksi genomista ’ : kloonia, klooni hP-10 ja klooni hP-11. Vaikka molemmat kloonit olivat homologisia kloonin RDC4 kanssa nukleoti- 44 1106S2 ditasolla, niiden hoxnologiat eivät olleet yhtä vahvoja (n. 75 % vs. n. 90 % klooneille 8 ja 84). Vaikka genomi-sen kloonin hP-10 havaittiin edustavan ihmisen RDC4-re-septorigeenin (geenin 8-30-84) pseudogeeniä, genominen 5 klooni hP-11 osoitti genomista rakennetta, jossa ei näyt tänyt olevan introneja koodausalueella ja koodaa geeniä (geeni 11), joka on eri kuin geeni 8-30-84 (kuvio 2.).
Geenin 8-30-84 (5-HT____-geeninä nukleotidisekvenssi ia 10 johdettu aminohapposekvenssi
Geenistä 8-30-84 saatu DNA-sekvenssi-informaatio nähdään kuviossa 3. Avoin lukuraami, joka ulottuu ATG-aloitusko-donista asemassa 1 lopetuskodoniin asemassa 1131, voi 15 koodata proteiinin, joka on 376 aminohappoa pituudeltaan (peptidi 8-30-84), jonka suhteellinen molekyylimassa (M*) on 41 783. Tämän proteiinisekvenssin vertailu aikaisemmin karakterisoitujen neurotransmitterireseptorien kanssa o-soittaa, että geeni 8-30-84 koodaa reseptoria, joka on 20 molekyylien perheen, joka ulottuu lipidikaksoiskerroksen yli 7 kertaa, jäsen ja liittyy pariksi guaniininukleoti-disäätelyproteiineihin (G-proteiiniin liittynyt resepto-riperhe). Suuri määrä rakenteellisia piirteitä, jotka o-vat muuttumattomia tässä perheessä, oli peptidissä 8-30-‘25 84. Suurin löydetty homologia oli peptidin 8-30-84, koi- ran RDC-4-reseptorin ja 5-HT1A-reseptorin välillä. Pepti-.din 8-30-84 vertailu koiran RDC4-sekvenssin kanssa näh-; dään kuviossa 5, mikä esittää reseptorirakenteen mallia, ,·' J joka on järjestynyt seitsemän transmembraanin yli ulottuko vaan domeeniin. Yhteensä 87 % sekvenssin säilymistä ha- * valttiin koiran RDC4-sekvenssin ja ihmisen peptidi 8-30- 84:n välillä 378:n aminohapon pituudelta. Suurin poikkeaminen koiran RDC4- ja ihmisen geenin 8-30-84-prote-·. · iinisekvenssien välillä nähtiin solunulkoisessa amino- .’.35 päässä ja suuressa sytoplasmisessa silmukassa, joka oli TM-V:n ja TM-VI:n välillä. Näiden kahden reseptorin välillä oleva homologia transmembraanisilla alueilla yksin- 45 1 10 6 9 2 nään oli 92 %, TM-IN ollessa poikkeavin.
Geenin 11 (5-HT—-geenin) nukleotidisekvenssi ia johdettu aminohapposekvenssi 5
Geenistä 11 saatu DNA-sekvenssi-informaatio nähdään kuviossa 4. Avoin lukuraami, joka ulottuu ATG-kodonista asemassa 1 lopetuskodoniin asemassa 1198, voi koodata proteiinin, joka on 398 aminohappoa pituudeltaan (peptidi 10 11, jonka suhteellinen molekyylimassa (Mr) on 44 333. Tä än proteiinisekvenssin vertailu aikaisemmin karakterisoitujen neurotransmitterireseptorien kanssa osoittaa, että geenin 11 proteiinituote on myös G-proteiiniin liittyneen reseptoriperheen uusi jäsen. Homologiaprofiilit osoitta-15 vat, että geenin 11 koodaama reseptori (peptidi 11) on tiiviisti yhteenkuuluva, mutta selvästi erilainen kuin geenin 8-30-84 (peptidi 8-30-84) ja koiran RDC4-geenin koodaama reseptori, 5HT1A-reseptorin ollessa seuraavaksi lähin reseptori homologiältään peptidille 11 (kuvio 6).
20 Kokonaisaminohappohomologia peptidin 8-30-84 ja peptidin 11 välillä on 56 %, josta 76 % aminohappohomologiaa transmembraanialueiden kanssa yksin. Käytännöllisesti katsoen aminoterminuksessa ei ole homologiaa, pientä ho-mologiaa läydettäessä suuressa sytoplasmisessa silmukassa •$•5 TM-V:n ja TM-VI:n välillä, samoin kuin karboksyylitermi- nus. Poikkeavin transmembraanin yli ulottuvista domee-.···. neista on TM-1, joka on vain 54 % identtinen peptidin 8- .30-84 ja peptidin 11 välillä. TM-l:ssä on neljän aminoha-! pon pätkä, joka kuitenkin on identtinen peptidin 8-30-84 ;30 ja peptidin 11 välillä, samoin kuin koiran RDC4-tuote.
’·' Näiden aminohappojen sekvenssi on seriini (S), asparagii- ni (N), alaniini (A) ja fenyylialaniini (F) ja voidaan lyhentää "SNAF". Tämä sekvenssi on ainutlaatuinen tälle > I · : reseptorien alaperheelle, koska se eroaa säilyneestä sek- •35 venssistä (GNxL), joka on tässä TM-I:n asemassa lukuisis- I » » ’ sa G-proteiiniin liittyneissä reseptoreissa.
1 11 » · « 46 110 6 9 2
Reseptorin ekspressio transfektoiduissa nisäkässoluissa
Jotta vahvistetaan äskettäin eristetyn geenin toiminnallinen identtisyys, olemme ekspressoinneet klooneja RDC4 5 ja hP-ll viljellyissä solulinjoissa. DNA-fragmentti, jos sa on jokaisen kloonin koko koodausalue, alakloonattiin ekspressiovektoriin pSVL. Saadut plasmidit, pcEXV-8-30-84 ja pSVL-11 vietiin lyhytaikaisesti Cos-7-soluihin käyttämällä DEAE-dekstraaniprotokollaa (Cullen, Methods in Enz. 10 152:684-704, 1987).
Stabiilit solulinjat tuotettiin transfektoimalla samanaikaisesti plasmidilla, jossa oli bakteerigeeni aminogly-kosidifosfotransferääsi, Ltk-soluihin (American Type Cul-15 ture Collection, Rockville, MD, Cell Line CCL1,3) käyttä mällä kalsiumfosfaattitekniikkaa (protokolla ja testipakkaus saatu Specialty Medialta, Inc. Lavallette, NJ). Kloonit, jotka ekspressoivat aminoglykosiditransferaasia, valikoitiin lisäämällä 1 mg/ml G418:aa (Gibco laborato-20 ries, Grand Island, NY) viljelyalastaan. Käytettiin 3H- 5HT:tä tarkkailemaan 5-HT1D-reseptorigeenin ekspressiota näissä klooneissa. Koska 3H-5HT voi myös sitoutua 5-HT1A-, 5-HT1B- ja 5-HTlc-reseptoreihin, peittävät ligandit pindo-loli (1 μΜ) ja SCH 23390 (1 μΜ) lisättiin inkubaatioon.
.£5 » * · ·
Cos-7-solut tai Ltk-solut valetransfektoitiin vektorilla, .·*·. jossa ei ollut inserttiä, jotta arvioitaisiin ligandisi- toutumisen endogeeniset tasot. 2 nM radioliganilla ei ha-'2 ! vaittu spesifistä sitomista. Siksi Cos-7-solut ja Ltk- i · » ;,3O solut antavat hyödylliset mallit mahdollisen 5-HTXD-resep- '·’ torin transfektioon. Lyhytaikaisesti transfektoidut Cos- 7-solut sitovat 3H-5-HT:ta suurella affiniteetilla (3 nM) :.i ja arvioidulla 0,63-1,28 pmol/mg proteiini paikkatihey- ·. I * ·,'·'· dellä RDC4:lle ja 0,602-0,95 pmol/mg proteiinia peptidi ,\3f> ll:lle. Peittävien ligandien pindololin ja SCH 23390:n ti· läsnäololla ei ollut merkittävää vaikutusta havaittujen , sitomiskohtien spesifiseen sitomiseen tai farmakologiseen I M > ( I > 4v 110692 profiiliin alkututkimuksissa ja eliminoitiin siksi seu-raavista kokeista.
Ltk-solut, jotka oli transfektoitu RDC4:llä/ geeni 8-30-5 84:llä tai geeni ll:llä, sitoivat 3H-5-HT:ta suurella affiniteetilla (Kd=3,6 nM, 4,0 nM tai 2,3 nM, vastaavasti). Arvioitu Bnax on yhtä kuin 0,275 pm/mg proteiinia RDC4:lle, 5,1 pmol/mg proteiinia geenille 8-30-84 ja 2,3 pmol/mg proteiinia geenille 11. Lisäkarakterisointia to-10 teutettiin suorittamalla kilpailukokeita lääkkeiden sar jalle. Kilpailumateriaalin analyysi toteutettiin käyttämällä tietokone-avustettua ei-lineaarista regressio-ohjelmaa Accucomp (Lundon Software, Chagrin Falls, OH). Materiaali nähdään taulukossa 1 ja osoittavat, että RDC4: 15 llä, geeni 8-30-84:llä tai geeni 11:ta transfektoiduissa soluissa havaitulla sitomisella oli ominaisuudet, joita odotettiin 5-HT-reseptorille. Lisäksi kilpailijoiden sarjan erot affiniteetissa näille kahdelle reseptorille o-soittaa, että RDC4, samoin kuin ihmisen geenit, geeni 8-20 30-84 ja geeni 11, koodaavat proteiineja, joilla on 5- HT1D-reseptorin sitomisominaisuudet, ja täten paljastaa vähintään kahden 5-HT1D-reseptorin alatyypin olemassaolon.
« · » · » « · · • * • « * * * * » » * f · » » « · , « * * t · • t • » I * » » · « · · 110692 +)
H
p s C -H 2 « Q)^(Ö cOja e « w -h P S icninii a in ι oj « ι i u
•H -H Λ E-H I - I - I I I 'f ' I * C«J I I
e +J S K IOIOI I I H VO I VO H I I H
Λ (Ö I I
H C B in C <-ι n in n n in σι
V V V V V *·» K
P c ooHooHoinor^vonojoot^ (0 0)? C co S +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l +l O -H Eh O S jU (SVO^HHOt^innH^COCN^in
ι—I Xl I -*·>.·.. H •'(N *· (N CO H ι—I <—I (NJ
W -H in ι—I r-l (N ι—I (N ^
O VO VO
i-tOCOOJCOMCOVOCOVOCOHVOO C OOOOOOOOOOOHOCOfM
P
P C H +| +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
(ö 0) Q
CtOr? COOVOOCFlH^VDOV^rOOCO^rOH
O -H S VONOO
06, - - 'HNnnno^'iinhOi
H Λ ' O O O
00 W -H 10 c
H
r* VO
.^1 C O CO CM Γ'' ^ e'en P ' - r-f
p rt O O VO O H Η H ι—I
5 CC S "VT -O +1 T3 +1 T3 +1 +1 +1 +1 +1 +1 T3 T3 T3 T3 o, o -h e-· υ · · · ....
m OCKQ CNC^CinvorvOHHCCCC
m rH(0ipi cr» - ro - - - - m *·« <d « y κι - h Hiomin p o •o
'N -H
0 ? -s c ; w 6 5 ;,; 1 e (0 ·η -h 6 . . S p c -h c (0 , c 9· -h c -h p ... S -H -H -H -H O, ... g PC β -p co >1 : ; : 5 p -p ie 6 iö p
* jj o -H -P (Ö p P
5 ό > a -P Q) -H
n -HO -H 0) >1 EH & ft rH
R 6 C C Ό P S >i -H -H >, -H
.·.: ς, (öo-h ro-H+jQpcaixc , ·: rM d -h &> c to ro o> -h ι +j -h -h ω -p
,,, , <D -H ω P -H VO -P P W -H -H -H iH X -H
.·· oi x h ίί «ι -h vo a<u^icomH>ioa x □ ;(0 o o -h 6 o ·ρ·Ρθ^Λ4θ>ιωα)
:(Ö B» Λ H (j N PWPOO&iPPP
ci Pl p p >, p H P >i Ό P P P P C O
: H id. <U(C>»Olft(C>i>iQ)a)Q)(CCU-H
' ' 3 M M.iiiPO'fflPjeP.CSBPC.QP
nj n >1 I Q) P Q <d C Q) I I ΙΦΙ Id) • · En pjinSwuftWgininingHing 1 t » S I t I > « ·" in o m o H H O) 110692 μ
•H
μ ζ a u λ o G -H jjj Ο Ο Ο Ο 0) ί> η ο ο Ο λ ο Λ ο Ο Ο Ο ω -H y S I la O O O o OI I O I O I o o o o
rl -H Λ EH I I cm o h o 10 h1 I lOlt^lOOOO
6 μ B ffi I I 'f io n h Ί· n i i cm ι vo i r» H H H
Λ <0 2 I O H H
H G « m Λ ΑΛΑ G in -tf m h m en cm
μ HCOCMCMCMCOHHCMinCOOOOO
μ c 'ίΓ^οΗΗΐηοοπΜ'ΐηοιο^'ΐοΗοοο G ω S +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 o +| o O 1H £-1 H i—1 O 6 te nJot^o^ooHonjroiHrfrvcoo oo
γη jn | ^tf^tfCMOHcncMioinoioHio^tfioAt^A
X Ή m njHHinnjiDHnnjiDHoo oo H in H H CM M1 3·
O CM —ICMCMOCnHCMCOlOO
G HCMCMHinHlOHHOOCMlOCOt^cOCninO
μ e ? +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i o co O) q o
C III /2 MlOCM^^tniDO^HlDlO^inininCMH
O -H 5 I—IHCMiniDt^COCMOr-l!—It'Ti—ΙΓ'-ι—ΙΟι—I
o B v HHCMCMior-t^-cncnHA
-H A ' M1 en 1 -H 10 rtf G σι cm μ - rtf O in rH ooo μ H CM 10 H O H CM CO H OOO· td i,·-' · ·ο ·· · · o o Ό CC S rtf Ό +1 +1 Ό +1 H +1 +1 Ό Ό +1 Ό +1 Ό +1 o o
O -H En CJ · · ·· · 1HHG
OGffiQ GocMGcMAovoGGcnGcnGM·
H (β I PS - O H ttfco CM CM -tf Λ A
.·. ^ in r-r in H O O fr- ^tf
• > I
S I f t 1 f 1
• < I
f · t I S t » 1 1 < # t » 1 « ( »tl
* I
» 1 » ' E-i
U EH B
I te te in -H I -HIO)
, ·, ; ie -h m e m G
·, ; -H -H -H G C C I -Hl -H
0) iH -H G "H -H -H -H O -H -H -H -H Xi x >1 1 -H μ μ -H rH en β iH e H μ
V ' :tÖ >1 CO -H CD 0) B O >1 O COShOOG
> :(0 &H,Q<D <U(0 en >1 O rH >1 μ r—I cd
.· J O O B G (¾ G μ H μ cm O μ 0) O G
μ£·Ηΐορ<(θ&Ε-ΐια)Λΐ μ οι a o > &3χ:μ2μ>ι><!ζ;ΒαιΚΗ6β·Ηΰμ ·Ηΐοο-ΗΐμφμΛ<!ΐυυοα)ΐθι·Ηθ ·> QKhDiEiiciEiQlziöBMDIitCMttiau
I I
·' in o m o
H H CM
2 11069:, ti I -g «
Cj J I * -H S ! 3 3 2 s , ? -5 g S f
-η-ηΛη i Λ G Ο ' H
§-P«tC I (j_|iOO vo 3 Λ ιβ 2 I ο ® Ή m a) h c S m n P * ·· g p -9 in n ε <β h , ? e H . *
3 C ^ 3 ιό Q
P fl) Ο 4-1 m S G N § g “ 3 « φ (00)7 o Ufi-H . g C co s o --HO C jz as O g S H -H T* g I P 00
hS? λ JS S ° -g * S
<D t! .t! P -n
a g ° 3 · S
« § Ϊ e « Λ ω ω . . 5 P ° «Γ -Ρ w ^ h n -μ o 5 φ c o pc? ° „ ® «o n 3 (dQ)o O £· Ai P ·. Li Q) g 2 Ei H d O 4J o iJ g OP S Λ * . O OT Oi ° 5 I a+j“t1-h (0 Οθιη o 'd ϋ c 0^‘H >β“(0·>ι m u X r-ι en ω (0 +} 3 (0 • ·η -n n. >w · i +j < « -9 (0 Ό · (0 -f—n h <D -P 3 * p -p ή ω . 2 q +J OOH Q C g P H o -H -H *H M g 5 (ö 7 ~ O Ai a) h ^ g |2.
G G S -a· O (0-PO u J >1
O-HBU H >10 g M (β+J
O G K Q O -H (0 SL _ -o-P
H <β I « Λ -H Ό Ai g* . 0)
. « Ai m — -P .G -P a g .-P
...: (0 ·η . v ^ P
... -no) · p h :52 :: o ml li A ω s .·*·. 0) -H 4J - ω p ·...· 2 2 P -p ® 'rn . ',d 5 'rt ® ---1 N ® : : : V 5 2 -p ** -p ..
. . O P O Γ. V · § Ό ·. ·.: c o m ^ .»52 . : -h a; i o w “ c
(0 ^ o «Λ ^ -H
! ! ! Dj <D I o ,, H . g
• (0 rl .¾ rn rn h> P
lOrl+J UJ .¾ - . <D
(0 -H — v S N -P
-P P . g H OT 0) ·.·; ® a) +jq)k) ^ | h -j
:.. X ΌΡ-Ρ ^ L; I 3 -P
·.· :(0 -H Ό -H G 1, rj 10 ij O
‘. ‘ :(0 P -H O -H Λ. m O 3 G
• j cL O ίο Ή Xl'P^O
·; O -HOW 0)°Li,-*Ll' ·. x > -H 3 σν g .. g Ό (0 p(0® a0'iSHS· n c+j+j « h jj m o c » » * ; * ! 10 o m
" * H H
si 110692
Keskustelu
Hakijat ovat kloonanneet ja karakterisoineet kaksi DNA-molekyyliä, jotka koodaavat ihmisen 5-HT1D-reseptoreja.
5 Näiden cDNA-kloonien ekspressio Cos-7-soluissa ja Ltk- soluissa johtaa tämän tyyppisen reseptorin ilmestymiseen solun pinnalle.
Lähtöpiste tähän tutkimukseen oli koiran klooni RDC4, 10 josta Libert et ai. (Science 244:569, 1989) alunperin raportoivat yhtenä G-proteiiniin liittyneiden reseptorien kokoelmasta, jotka on kloonattu PCR-teknologialla. Meidän analyysimme nukleotidisekvenssistä seuraamalla Strader, Sigal ja Dixon mallia (FASEB J. 3:1825 (1989)) 15 osoitti, että RDC4 oli todennäköisesti 5-HT-reseptori.
Lisäksi RDC4 osoitti korkeinta sekvenssihomologiaa ihmisen aerotoniini-5-HT^-sekvenssin kanssa (Libert et ai., 1989). RDC4-sekvenssi eristettiin koiran genomi-sesta kirjastosta laboratorioissamme ja transfektoitiin 20 nisäkässolulinjaan. Mikään laboratorio ei ole aikaisem- “··' min raportoinut ekspressiotietoja tästä kloonista.
RDC4-transfektoitujen Cos-7- ja Ltk-solujen havaittiin sitovan [3H]5-HT:tä näennäisen korkealla affiniteetilla : 25 (Kc = n. 3 nM; Bmax = n. 0,25-0,4 pm/mg proteiinia) .
Tämä ominaisuus osoittaa, että RDC4 koodaa 5-ΗΤ;-reseptoria. Korkean affiniteetin 3H5-HT-sitomiseen ei vaikutettu inkuboimalla samanaikaisesti (-)-pindololilla (1 μια) . Tämä eliminoi mahdollisuuden, että sitominen on 5-30 HT1A- tai 5-HT1B-reseptoriin. Lisäksi 5-HT1B-antagonisti SCH 23390 (1 μιη) on myös tehoton vähentämään JH-5-HT:n si-t tornista. Muita yhdisteitä, jotka eivät kykene kilpaile- : ·. maan H-5HT-sitomiskohdista, ovat ketanseriini (5-HT..- reseptoreja) , ICS 205-930 (5-HT3- ja 5-HTJ ja 6-OH-.* 1 35 indalpiini (5-HTlp) . Lisäksi 5-CT:n suuri affiniteetti tähän sitomiseen eliminoi mahdollisuuden, että sitomi-s“ nen on 5-HT1B-reseptoriin. Vahva sekvenssihomologia 52 1 10692 RDC4:n ja kloonatun ihmisen geenin 8-30-84 välillä o-soittaa, että ihmisen geenin, kun transfektoitu nisäkäs-solulinjaan, pitäisi ekspressoidan hyvin samanlaisia farmakologisia ominaisuuksia. Tämä on osoitettu oikeaksi 5 (katso taulukko 1).
RDC4:ää käytettiin myös kloonaamaan toista ihmisen geeniä, geeni 11. Tämä geeni sekvenssoitiin ja ekspressoi-tiin lyhytaikaisesti Cos-7-soluissa ja stabiilina solu-10 linjana Ltk-:ssa. Kuten näytettiin olevan totta RDC4- kloonille, geeni 11-transfektoitujen solujen havaittiin sitovan 3H-5-HT:ta suurella affiniteetilla ja olevan ei-sensitiivinen yhdisteille, joilla oli affiniteettia 5-HT1Ä-, 5-HT1b-, 5-HT1C-, 5-HT2-, 5-HTb- tai 5-HT^-resep-15 toreille. Lisäksi alhaisten 5-CT-pitoisuuksien kyky kil pailla [H]5-HT:n kanssa sitoutumisesta geenillä 11 transfektoituihin soluihin tekee mahdottomaksi mahdollisuuden, että tämä geeni koodaa 5-HTlf- tai 5-HT1E-re-septoria. Farmakologinen profiili nähdään taulukossa 1.
, 20 Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä geenin 11 karakterisoinnin ;··' kanssa 5-HTir-reseptoria koodaavana.
Taulukko 1 osoittaa, että vaikka RDC4 (ja peptidi 8-30-:,i 84) ja peptidi 11 voidaan molemmat luokitella 5-HT1D- 25 reseptoreiksi, on niillä selvästi erotettavia farmako- V logisia erilaisuuksia samoin kuin selvästi erotettavat rakenteet. Nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että ihmisen 5-HT1D-sitomiskohta muodostaa, ei yksittäistä reseptoria, vaan reseptorien perheen. Mahdollisia 30 eroja sijainnissa samoin kuin farmakologiassa voidaan käyttää hyväksi tulevaisuudessa kehittämään voimakkaita ·; > uusia lääkkeitä selektiivisesti aktivoimaan tai inhiboi- : ·. maan jokaista näitä 5-HT.„-reseptorikohtaa.
‘ 35 Yhteenvetona, olemme kloonanneet kaksi ihmisen 5 HT
reseptoria, joilla on eroavat farmakologiset ominaisuu-’··. det. Tämä osoittaa, että 5-HT1E-reseptorit muodostavat 53 110 6 91 reseptoriperheen, mieluummin kuin yksittäisen proteiinin. Ihmisen aivoissa 5-HT1D-reseptoreilla on osoitettu olevan voimakkain edustus frontaalisessa aivokuoressa, aivojen linssitumakkeen tummemmassa ulkokerroksessa, 5 caudatuksessa, aivojen linssitumakkeen kalpean osan mo lemmissa osissa ja aivojen mustatumakkeessa. Alhaisempia määriä on tumasaumassa, aivotursossa ja accumbessa.
5-HT1D-reseptoreja on vedetty mukaan lukuisiin kliinisesti tärkeisiin olotiloihin, migreeni, ruokahalu, lii-10 kunnan kontrolli, tuskaisuus ja dementia mukaanluettui na. 5-HT1D-agonistit, kuten sumatriptaani, ovat nyt kliinisissä kokeissa. Meidän materiaalimme, osoittaen että ihmisen 5-HT1D-reseptoreita on lukuisia alatyyppejä, avaa uuden keinon lääkkeen keksimiselle. Farmako-15 logiset erot näissä 5-HT1D-reseptorien alatyypeissä liittyneenä meidän tutkimukseemme mahdollisista eroavuuksista niiden sijainnissa johtaa todennäköisesti selektiivisimpien terapeuttisten aineiden, joilla on tunnusmerkillinen sensitiivisyys näille alatyypeille, 20 kehittämiseen.
Lisäksi tulevaa kokeellista materiaalia koskien kloonatun rotan 5-HT,.»-reseptorin farmakologista karakterisointia: . 25 Suhde kloonattuun 5-HT.r-reseptoriin I i · : 5-HT1B- ja 5-HT1D-reseptoreilla on samankaltaisuuksia niiden farmakologiassaan, toisen lähetin kytkemisessä !,! ; ja anatomisessa jakautumisessa. Tämä läheinen saraankal- I · ‘•,‘ |30 taisuus on johtanut ehdotukseen, että nämä reseptorit : : : ovat lajihomologeja, jolloin rotta ja hiiri (ja opossu- mi) ekspressoivat 5-HT1B-reseptoria ja muut lajit, ku- : ten ihminen, koira, nauta ja marsu ekspressoivat 5- 1 · HT1D-reseptoria (Hoyer ja Middlemiss, 1989). 5-HT1D-re- t * · ’· 35 septorin äskettäinen kloonaus (Branchek et ai., 1990) on sallinut pääsyn suoraan näiden kahden reseptorin välisen suhteen arviointiin käyttämällä molekyyli- 50 110692 kloonauksen tekniikoita. Jotta eristetään mahdollinen rotan homologi 5-HT1D-geenille, seulottiin rotan kirjasto erittäin tiukasti käyttämällä ihmisen 5-HT1D-sekvenssiä koettimena. Tutkimukseen valittiin voimakkaasti hybridisoi-5 tuva signaali, alakloonattiin ja transfektoitiin lyhytai kaisesti nisäkässolulinjaan (Cos-7). Jotta tunnistettaisiin tämän ligandin farmakologinen profiili, suoritettiin radioligandisitomismääritykset membraanifraktioille, jotka olivat transfektoiduista soluista. Radioligandeina käytet-10 tiin [3H]5-HT- ja [125I] -jodisyaanipindololia ([125I]I-CYP 3 μΜ isoproterenolin läsnäollessa endogeenisen β-adrener-gisten reseptorien blokkaamiseksi) . [125I] -jodisyaanipin- dololin havaittiin sitoutuvan membraaneihin, jotka oli saatu transfektoiduista soluista subnanomolaarisella affi-15 niteetilla [Kd = 0,16 nM] . Päinvastoin tasapaino lla j oamisvakio [JH] 5-HT-sitomiselle oli 18,4 nM. Nämä arvot olivat selvä vastakohta niille arvoille, jotka mitattiin käyttämällä ihmisen 5-HT1D-kloonia ( [JH] 5-HT:Kd = 4 nM; [-125I ] I-CYP: ei havaittu spesifistä sitomista 1 nM:ssa).
; 20 Rauwolfia-alkaloidi rauwolskiini oli olennaisesti ei- ;·- aktiivinen (K_ > 10 000 nM) rotan reseptorilla, kuten oli dipropyyli-5-karboksiamidotryptamiini. Tutkittujen yhdis-teiden potenssin arvojärjestys oli 5-HT > (-)-propranoli > 1 5-metoksitryptamiini > tryptamiini > dipropyyli-5-kar- ‘ 25 boksiamidotryptamiini = rauwolskiini. Nämä tiedot osoit- tavat selvästi, että geeni, joka eristettiin homologian perusteella ihmisen 5-HT1D-reseptoriin, koodaa proteiinia, jolla on farmakologiset ominaisuudet, jotka tunnistavat sen 5-HT1B-reseptoriksi. Siksi näyttää siltä, että nämä re-30 septorit ovat lajihomologeja, joilla on merkittäviä eroja ,··· farmakologiassa. Samanlainen tilanne on kuvattu rotan ja ’’ . ihmisen 5-HT?-reseptoreille, jotka on kloonattu aikaisem- ·,1 min ja osoitettu olevan erittäin homologisia (Hartig et ai., 1990). Kuitenkin erojen 5-HT1B/5-HT_-reseptorien far-35 makologisissa ominaisuuksissa on osoitettu olevan karkeam- mat kuin rotan 5-HT2/ihmisen 5-Ml-reseptorien erot.

Claims (28)

55 110692 Patenttivaat imukset
1. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen 5-HT]_D-reseptoria, jolla reseptorilla on 5 plasmidiin pcEXV-8-30-84 (ATCC talletusnumero 40790) tai plasmidiin pSVL-11 (ATCC talletusnumero 40791) sisältyvän DNA-sekvenssin koodaama aminohapposekvenssi tai sen osa, jolla on samat sitoutumisominaisuudet kuin ihmisen 5-HTip-reseptorilla, kuten on esitetty taulukossa 1. 10
2. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 mukaisen nukleiinihappomolekyy-lin degeneraatti.
3. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että sillä on ainakin 65 % homologia patenttivaatimuksessa 1 tai 2 esitetyn nukleiinihappomolekyylin kanssa ja että se koodaa proteiinia, jolla on oleellisesti samat sitoutumisominaisuudet . : 2 0
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen nukleiinihappo-,··· molekyyli, tunnettu siitä, että nukleiinihappomolekyyli on DNA-molekyyli, cDNA-molekyyli tai RNA-molekyyli. • · < i » ' ' 25 5. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihappomolekyyli on säätelyelementtien 30 kontrollin alaisena sallien ekspression halutussa isän- täsolussa. 1
7. Plasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaa timuksen 5 tai 6 mukaisen vektorin. 35 56 1106 9 2
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi pcEXV-8-30-84 (ATCC tallennusnumero 40790) .
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, tunnettu sii tä, että se on plasmidi pSVL-11 (ATCC tallennusnumero 40791) .
10. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää minkä ta- 10 hansa patenttivaatimuksen 7-9 mukaisen plasmidin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on bakteerisolu, hiivasolu tai nisäkässolu.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Ltk-solu.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 8 mukaisen : 20 plasmidin, jota merkitään Ltk-8-30-84 (ATCC tallennusnumero CRL 10421) . '! 14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu * t siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 9 mukaisen 25 plasmidin, jota merkitään Ltk-11 (ATCC tallennusnumero CRL 10422) .
15. Menetelmä, jolla määritetään, voiko ligandi, jonka ei tiedetä kykenevän sitoutumaan patenttivaatimuksen 1 mukai- ;*·, 3 0 sen nukleiinihappomolekyylin koodaamaan ihmisen 5-HT]_p- * reseptoriin, sitoutua ihmisen 5-HT]_D-reseptoriin, tunnettu < » y · siitä, että saatetaan nisäkässolu, joka on transfektoitu t t ’· ’ ihmisen 5-HT]_D-reseptoria koodaavalla ekspressoivalla nuk- ti* , ’ leiimhapolla, tai sen solu-uutteen membraanifraktio koske- :‘.t 35 tuksiin ligandin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat ligan- dien, joiden tiedetään sitoutuvan 5-HT]_D-reseptoriin, sitoutumisen, osoitetaan kaiken ihmisen 5-HT]_£)-reseptoriin 57 110692 sitoutuneen ligandin läsnäolo ja täten määritetään, sitou-tuuko ligandi ihmisen S-HT^p-reseptoriin.
16. Menetelmä kemiallisten yhdisteiden seulomiseksi, jotta 5 tunnistetaan lääke-ehdokkaat, jotka spesifisesti sitoutuvat patenttivaatimuksen 1 mukaisen nukleiinihappomolekyylin koodaamaan ihmisen 5-HTiD-reseptoriin solun pinnalla, tunnettu siitä, että saatetaan nisäkässolu, joka on transfek-toitu ihmisen 5-HTiD-reseptoria koodaavalla ekspressoival-10 la nukleiinihapolla, tai sen solu-uutteen membraanifraktio, kosketuksiin lukuisten kemiallisten yhdisteiden kanssa, niiden kemiallisten yhdisteiden määrittämiseksi, jotka sitoutuvat nisäkässolun pinnalla ilmentyvään ihmisen 5-HT^q-reseptoriin, ja täten tunnistetaan lääke-ehdokkaat, jotka 15 spesifisesti sitoutuvat ihmisen 5-HT;LD-reseptoriin.
17. Membraanivalmiste, tunnettu siitä, että se käsittää mistä tahansa patenttivaatimuksen 10-14 mukaisesta solusta eristetyn ihmisen 5-HT]_p-reseptorin. 20
18. Patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen menetelmä, tun- : . · nettu siitä, että nisäkässolu on ei-neuronaalista alkupe- rää. : *.’25 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu :Y siitä, että ei-neuronaalista alkuperää oleva nisäkässolu on Ltk-solu.
20. Menetelmä kemiallisen yhdisteen identifioimiseksi, joka . . 30 spesifisesti sitoutuu patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukle- |t> iinihappomolekyylin koodaamaan ihmisen 5-HT]_D-reseptoriin, ; _ tunnettu siitä, että saatetaan ei-neuronaaliset solut, jot- : *. ka ekspressoivat solun pinnalla ihmisen 5-HT]_p-reseptoria, tai niiden solu-uutteen membraani fraktio, kosketuksiin ke- · 35 58 110692 miallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat sitoutumisen, ja täten tunnistetaan kemiallisen yhdisteen spesifinen sitoutuminen ihmisen 5-HTiD-reseptoriin.
21. Menetelmä, jossa käytetään kompetitiivista sitoutumista kemiallisen yhdisteen identifioimiseksi, joka spesifisesti sitoutuu patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukleiinihappomole-kyylin koodaamaan ihmisen S-HT^p-reseptoriin, tunnettu siitä, että saatetaan erikseen ei-neuronaaliset solut, jotka 10 ekspressoivat solun pinnalla ihmisen 5-HT]_p-reseptoria, tai niiden solu-uutteen membraanifraktio, kosketuksiin sekä kemiallisen yhdisteen kanssa että toisen kemiallisen yhdisteen kanssa, jonka tiedetään sitoutuvan reseptoriin, sekä ainoastaan toisen kemiallisen yhdisteen kanssa, olosuhteis-15 sa, jotka sallivat molempien yhdisteiden sitoutumisen, ja tunnistetaan kemiallisen yhdisteen spesifinen sitoutuminen ihmisen 5-HT^D-reseptoriin, jolloin toisen kemiallisen yhdisteen sitoutumisen väheneminen ihmisen 5-HT;LD-reseptoriin kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa indikoi, että kemialli-20 nen yhdiste sitoutuu ihmisen 5-HT;L£)-reseptoriin.
22. Menetelmä, jossa määritetään, sitoutuuko kemiallinen yhdiste spesifisesti patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukle-’ iinihappomolekyylin koodaamaan ihmisen 5-HT^D-reseptoriin : 25 ja aktivoiko se sen, tunnettu siitä, että saatetaan ei- :V neuronaaliset solut, jotka tuottavat toisen lähettivasteen ja ekspressoivat solun pinnalla ihmisen 5-HT^D-reseptoria, tai niiden solu-uutteen membraanifraktio, kosketuksiin kemiallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat ih-. 30 misen 5-HT^D-reseptorin aktivoitumisen, ja mitataan toinen lähettivaste kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa ja poissa '·; > ollessa, jolloin muutos toisessa lähettivasteessa kemialli- : *. sen yhdisteen läsnä ollessa indikoi, että kemiallinen yh- ·;··. diste aktivoi ihmisen 5-HT]_£)-reseptorin. ’ 35 59 1 10 6 9 2
23. Menetelmä, jossa määritetään, sitoutuuko kemiallinen yhdiste spesifisesti patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukle-iinihappomolekyylin koodaamaan ihmisen 5-HTip-reseptoriin ja inhiboiko se sen aktivoitumista, tunnettu siitä, että 5 saatetaan ei-neuronaaliset solut, jotka tuottavat toisen lähettivasteen ja ekspressoivat solun pinnalla ihmisen 5 - HT^p-reseptoria, tai niiden solu-uutteen membraanifraktio, kosketuksiin sekä kemiallisen yhdisteen kanssa ja toisen kemiallisen yhdisteen kanssa, jonka tiedetään aktivoi-10 van ihmisen 5-HTip-reseptorin, että ainoastaan toisen ke miallisen yhdisteen kanssa, olosuhteissa, jotka sallivat ihmisen 5-HT]_p-reseptorin aktivoitumisen, ja mitataan toinen lähettivaste ainoastaan toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa sekä toisen kemiallisen yhdisteen ja kemial-15 lisen yhdisteen läsnä ollessa, jolloin pienempi muutos toi sessa lähettivasteessä kummankin kemiallisen yhdisteen ja toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa kuin ainoastaan toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa indikoi, että kemiallinen yhdiste inhiboi ihmisen 5-HT]_p-reseptorin akti-20 voitumista. ·’ · 24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen lähettivaste käsittää adenylaattisyklaa-·,· siaktiivisuuden ja muutos toisessa lähettivasteessä on ade- : 25 nylaattisyklaasiaktiivisuuden lasku.
25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen lähettivaste käsittää adenylaattisyklaa-siaktiivisuuden ja muutos toisessa lähettivasteessa on pie-30 nempi aleneminen adenylaattisyklaasiaktiivisuuden tasossa kummankin toisen kemiallisen yhdisteen ja kemiallisen yh-; . disteen läsnä ollessa kuin ainoastaan toisen kemiallisen : \ yhdisteen läsnä ollessa. '35 26. Jonkin patenttivaatimuksen 20-25 mukainen menetelmä, I,, tunnettu siitä, että ei-neuronaalinen solu on nisäkässolu. 6o 110692
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkässolu on Ltk-solu.
28. Puhdistettu ihmisen 5-HT]_£)-reseptoriproteiini, jolla on patenttivaatimuksessa 1 esitetty aminohapposekvenssi.
5 Patentkrav
FI925034A 1990-05-08 1992-11-06 DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt FI110692B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52071690 1990-05-08
US07/520,716 US5155218A (en) 1990-05-08 1990-05-08 Dna encoding human 5-ht1d receptors
PCT/US1991/003200 WO1991017174A1 (en) 1990-05-08 1991-05-08 Dna encoding human 5-ht1d receptors and uses thereof
US9103200 1991-05-08

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI925034A FI925034A (fi) 1992-11-06
FI925034A0 FI925034A0 (fi) 1992-11-06
FI110692B true FI110692B (fi) 2003-03-14

Family

ID=24073787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI925034A FI110692B (fi) 1990-05-08 1992-11-06 DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5155218A (fi)
EP (2) EP0530265B1 (fi)
JP (2) JP3319596B2 (fi)
AT (1) ATE171211T1 (fi)
CA (2) CA2082390C (fi)
DE (2) DE530265T1 (fi)
DK (1) DK0530265T3 (fi)
ES (1) ES2059298T3 (fi)
FI (1) FI110692B (fi)
NO (1) NO310031B1 (fi)
WO (1) WO1991017174A1 (fi)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5661024A (en) * 1989-10-31 1997-08-26 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonic (5-HT2) receptor and uses thereof
US5935925A (en) * 1990-05-08 1999-08-10 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of treating migraine and compounds useful for such methods
US5155218A (en) 1990-05-08 1992-10-13 Neurogenetic Corporation Dna encoding human 5-ht1d receptors
ES2183806T3 (es) * 1991-03-15 2003-04-01 Applied Research Systems Receptor de la hormona estimuladora de foliculo humano.
ES2237747T3 (es) * 1991-11-14 2005-08-01 Prionics Ag Animales transgenicos no humanos que carecen de proteinas prionicas.
ATE292175T1 (de) * 1991-12-02 2005-04-15 Synaptic Pharma Corp Dna kodierend für den menschlichen 5-ht 1e- rezeptor und seine verwendungen
US5670113A (en) 1991-12-20 1997-09-23 Sibia Neurosciences, Inc. Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same
US6406859B1 (en) 1992-01-08 2002-06-18 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a 5-HT 1F receptor and uses thereof
US5360735A (en) * 1992-01-08 1994-11-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells
DE4216319A1 (de) * 1992-05-16 1993-11-18 Basf Ag Serotonin Rezeptor, Verfahren zur Herstellung und seine Verwendung
FR2693200B1 (fr) * 1992-07-01 1994-08-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations.
FR2693201B1 (fr) * 1992-07-01 1994-08-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polyptides et utilisations.
CA2145182C (en) * 1992-09-25 2001-09-18 Jonathan A. Bard Dna encoding human alpha 1 adrenergic receptors and uses thereof
ATE187773T1 (de) 1992-10-26 2000-01-15 Us Health St-b17 serotonin rezeptor
DE69333660T2 (de) * 1992-10-26 2006-02-23 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pct-65 serotonin rezeptor
JPH08506240A (ja) * 1992-11-03 1996-07-09 シナプティック・ファーマスーティカル・コーポレーション ヒトセロトニン受容体（５−ｈｔ▲４ｂ▼）をコードするｄｎａ及びその使用
US6300087B1 (en) 1992-11-03 2001-10-09 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
US5472866A (en) * 1992-12-24 1995-12-05 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors
FR2699922B1 (fr) * 1992-12-30 1995-02-10 Inst Nat Sante Rech Med Polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes vecteurs et hôtes les exprimant, et application au criblage des médicaments.
US20020115149A1 (en) * 1993-01-08 2002-08-22 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding human 5-HT1D receptors and uses thereof
CA2158727A1 (en) * 1993-03-23 1994-09-29 Hiroshi Hara Parenchymal hepatocyte growth substances
EP0871667A4 (en) * 1994-11-18 1999-05-12 Human Genome Sciences Inc G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR
US5998164A (en) * 1995-03-30 1999-12-07 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human G-protein coupled receptor GPRZ
US6090575A (en) * 1995-03-30 2000-07-18 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human G-protein coupled receptor GPR1
EP0817800A4 (en) * 1995-03-30 1999-06-16 Human Genome Sciences Inc RECEPTORS COUPLED BY HUMAN G PROTEIN
US5698766A (en) * 1995-04-05 1997-12-16 The Regents Of The University Of California Transgenic animal model for testing drugs for treating eating disorders and epilepsy
US5942414A (en) * 1995-06-06 1999-08-24 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human G-protein coupled receptor HIBEF51
CA2232235A1 (en) * 1995-10-19 1997-04-24 Smithkline Beecham Corporation A novel human b cell surface molecule
JP2000506365A (ja) * 1996-01-11 2000-05-30 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒトｇタンパク質ケモカインレセプターｈｓａｔｕ６８
WO1997025340A1 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein chemokine receptor hsatu68
US7888466B2 (en) * 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
US6673535B1 (en) 1996-05-08 2004-01-06 Cedars-Sinai Medical Center Methods of detecting spinocerebellar Ataxia-2 nucleic acids
US6844431B1 (en) * 1996-05-08 2005-01-18 Cedars-Sinai Medical Center Nucleic acid encoding spinocerebellar ataxia-2 and products related thereto
US5891885A (en) * 1996-10-09 1999-04-06 Algos Pharmaceutical Corporation Method for treating migraine
US6362009B1 (en) 1997-11-21 2002-03-26 Merck & Co., Inc. Solid phase synthesis of heterocycles
US6462188B1 (en) 1998-04-16 2002-10-08 The Institute For Genomic Research Human 5-HT3 receptor
WO2000012707A1 (en) * 1998-09-02 2000-03-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14926 receptor, a novel g-protein coupled receptor
US7449338B2 (en) * 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US6221660B1 (en) 1999-02-22 2001-04-24 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding SNORF25 receptor
US6664373B1 (en) 1999-03-01 2003-12-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TWIK-5 potassium channel polypeptides and uses therefor
US6670149B1 (en) 1999-03-01 2003-12-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TWIK-5 potassium channel nucleic acids and uses therefor
US7179886B1 (en) * 1999-06-08 2007-02-20 Merck & Co., Inc. Cloning and identification of the motilin receptor
ES2272309T3 (es) 1999-08-03 2007-05-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 15571, una nueva molecula de tipo gpcr de la familia de tipo secretina y sus usos.
UA77650C2 (en) * 1999-12-06 2007-01-15 Lundbeck & Co As H Use of serotonin reuptake inhibitor in combination with deramcyclane
ES2426915T3 (es) 2003-09-10 2013-10-25 Brentwood Equities Ltd. Diastereoisómeros de 4-ariloxi-3-hidroxipiperidinas
US20070270339A1 (en) * 2004-04-23 2007-11-22 Serono, Inc. Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility
CA2565801A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of il-17 in the treatment of fertility-related disorders

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR79215B (fi) * 1982-06-07 1984-10-22 Glaxo Group Ltd
EP0162067B1 (en) 1983-10-28 1992-07-15 Genetics Institute, Inc. Production of factor viii and related products
GB2162522B (en) * 1984-08-01 1988-02-24 Glaxo Group Ltd An indole derivative
GB8419575D0 (en) * 1984-08-01 1984-09-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
US4985352A (en) * 1988-02-29 1991-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA encoding serotonin 1C (5HT1c) receptor, isolated 5HT1c receptor, mammalian cells expressing same and uses thereof
EP0351921A3 (en) * 1988-07-22 1991-07-17 Merck & Co. Inc. Modified beta adrenergic receptor
FR2642075B1 (fr) 1989-01-25 1991-04-26 Pasteur Institut Polypeptides ayant une activite de recepteur (beta)-adrenergique chez l'homme, impliques dans la reponse lipolytique, acides nucleiques codant pour ces polypeptides et utilisation de ces polypeptides pour le criblage de substance active sur ces polypeptides
US5155218A (en) * 1990-05-08 1992-10-13 Neurogenetic Corporation Dna encoding human 5-ht1d receptors
ATE292175T1 (de) * 1991-12-02 2005-04-15 Synaptic Pharma Corp Dna kodierend für den menschlichen 5-ht 1e- rezeptor und seine verwendungen
US5360735A (en) * 1992-01-08 1994-11-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells
US5472866A (en) * 1992-12-24 1995-12-05 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors

Also Published As

Publication number Publication date
DK0530265T3 (da) 1999-06-14
FI925034A (fi) 1992-11-06
EP0530265B1 (en) 1998-09-16
EP0787797A1 (en) 1997-08-06
AU657686B2 (en) 1995-03-23
JP3319596B2 (ja) 2002-09-03
DE69130219D1 (de) 1998-10-22
CA2082390A1 (en) 1991-11-09
JPH06502297A (ja) 1994-03-17
ES2059298T3 (es) 1999-02-01
CA2374571A1 (en) 1991-11-14
EP0530265A1 (en) 1993-03-10
ATE171211T1 (de) 1998-10-15
CA2082390C (en) 2002-06-11
NO310031B1 (no) 2001-05-07
US6475746B1 (en) 2002-11-05
ES2059298T1 (es) 1994-11-16
US5786157A (en) 1998-07-28
US5155218A (en) 1992-10-13
JP2002212103A (ja) 2002-07-31
DE530265T1 (de) 1994-03-31
NO924289D0 (no) 1992-11-06
DE69130219T2 (de) 1999-05-12
WO1991017174A1 (en) 1991-11-14
AU7879891A (en) 1991-11-27
FI925034A0 (fi) 1992-11-06
EP0530265A4 (en) 1993-06-16
NO924289L (no) 1992-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI110692B (fi) DNA, joka koodaa ihmisen 5-HT1D-reseptoreita ja sen käytöt
US5360735A (en) DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells
US5472866A (en) DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors
AU672768B2 (en) DNA encoding a human 5-HT-1E receptor and uses thereof
WO1993010228A1 (en) Dna encoding a glycine transporter and uses thereof
US6432655B1 (en) Method of obtaining compositions
US6468767B1 (en) DNA encoding a human dopamine D1 receptor and uses thereof
US5935925A (en) Methods of treating migraine and compounds useful for such methods
AU657686C (en) DNA encoding human 5-HT1D receptors and uses thereof
US6300087B1 (en) DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
Weinshank et al. DNA encoding human 5-HT 1D receptors
WO1994015618A1 (en) Dna encoding a human betaine/gaba transporter and uses thereof
US20020115149A1 (en) DNA encoding human 5-HT1D receptors and uses thereof
US6406859B1 (en) DNA encoding a 5-HT 1F receptor and uses thereof
AU667510C (en) DNA encoding a human 5-HT-1F receptor and uses thereof
Gerald et al. DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: LUNDBECK RESEARCH USA, INC.

Free format text: LUNDBECK RESEARCH USA, INC.