JP2001525161A - 低電位で活性化されるカルシウムチャネル組成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 低電位で活性化されるカルシウムチャネルのサブユニットで、主要転写産物のスプライス変異体によってコードされるサブユニットを含むサブユニットをコードする、単離された核酸が提供されている。該核酸を含む細胞とベクター、および、これらのサブユニットを含むカルシウムチャネルの活性を調節する化合物を同定するための方法も提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願 １９９７年１２月３日に提出された、Ｗｉｌｌｉａｍｓらによる「カルシウム
チャネル組成物および方法」と称する米国特許出願第０８／９８４，７０９号、
および、１９９８年１１月１０日に提出された、Ｗｉｌｌｉａｍらによる「カル
シウムチャネル組成物および方法」と称する米国特許出願第０９／１８８，９３
２号に対する優先権の利益を本明細書において主張するものである。

【０００２】 本出願は、１９９５年５月２５日提出の米国特許出願第０８／４５０，２７２
号、１９９５年５月２５日提出の米国特許出願第０８／４５０，２７３号、１９
９５年５月２５日提出の米国特許出願第０８／４５０，５６２号に関連するもの
である。これらの各出願は、米国特許出願第０８／２９０，０１２号の一部継続
出願である。本出願は、米国特許出願第０８／１０５，５３６号および第０８／
１４９，０９７号に対する優先権を主張する、１９９４年８月１１日提出の国際
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号にも関連する。本出願は、１９９
２年７月１３日提出の米国特許出願第０７／９１４，２３１号、現米国特許第５
，４０７，８２０号の継続出願である、１９９５年２月１５日提出の米国特許出
願第０８／４０４，３５４号、現米国特許第５，６１８，７２０号にも関連し、
また、いずれも、米国特許出願第０７／９１４，２３１号の分割出願である、１
９９４年９月２８日提出の米国特許出願第０８／３１４，０８３号、現米国特許
第５，６８６，２４１号、１９９５年５月５日提出の米国特許出願第０８／４３
５，６７５号、現米国特許第５，７１０，２５０号にも関連する。米国特許出願
第０７／９１４，２３１号は、１９８９年４月４日に提出されたが、今は放棄さ
れている米国特許出願第０７／１７６，８９９号の一部継続出願である、１９８
９年４月４日提出の国際ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１４０８号の国内段階である、１
９９０年１１月８日に提出され、今は放棄されている米国特許出願第０７／６０
３，７５１号の継続出願である。

【０００３】 また、本出願は、米国特許出願第０８／３１４，０８３号の継続出願である、
１９９７年６月２７日提出の米国特許出願第０８／８８４，５９９号にも関連し
ている。

【０００４】 また、本出願は、１９９３年１１月５日に提出され、許可を受けた米国特許出
願第０８／１４９，０９７号の一部継続出願であり、１９９３年８月１１日提出
の米国特許出願第０８／１０５，５３６号の一部継続出願でもある国際公開公報
第９５／０４８２２号に相当する、１９９４年８月１１日に提出され、今は放棄
されている米国特許出願第０８／２９０，０１２号にも関連している。米国特許
出願第０８／１４９，０９７号は、１９９０年１１月８日提出の上記米国特許出
願第０７／６０３，７５１号の一部継続出願である。

【０００５】 また、本出願は、１９９０年１１月８日提出の上記米国特許出願第０７／６０
３，７５１号の一部継続出願であり、かつ１９９０年１１月３０日に提出された
が、今は放棄されている米国特許出願第０７／６２０，２５０号の一部継続出願
でもある、１９９１年８月１５日提出の米国特許出願第０７／７４５，２０６号
の一部継続出願である、今は放棄されている米国特許出願第０７／８６８，３５
４号の一部継続出願である、１９９４年４月４日に提出され、現米国特許５，７
９２，８４６号である、許可された米国特許出願第０８／２２３，３０５号、現
米国特許第５，８５１，８２４号にも関連する。また、本出願は、１９９２年４
月１０日提出の米国特許出願第０７／８６８，３５４号の一部継続出願である、
１９９５年５月３１日に提出され、許可された米国特許出願第０８／４５５，５
４３号にも関連する。

【０００６】 また、本出願は、１９９１年８月１５日提出の許可された米国特許出願第０７
／７４５，２０６号の一部継続出願である、１９９４年９月２３日提出の米国特
許出願第０８／３１１，３６３号にも関連する。

【０００７】 また、本出願は、１９９２年８月１４日に提出され、ＰＣＴ国際公開公報第９
３／０４０８３号として公開された国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０６９
０３号の国内段階であり、かつ１９９０年１１月３０日に提出されたが、今は放
棄されている米国特許出願第０７／８６８，３５４号、第０７／７４５，２０６
号、第０７／６０３，７５１号、第０７／１７６，８９９号、第０７／６２０，
２５０号、および、１９９０年２月２日提出の米国特許出願第０７／４８２，３
８４号、現米国特許第５，３８６，０２５号の一部継続出願でもある、１９９４
年２月７日に提出され、許可された米国特許出願第０８／１９３，０７８号、現
米国特許第５，８４６，７５６号にも関連する。

【０００８】 また、本出願は、１９９０年２月２日提出の米国特許出願第０７／４８２，３
８４号、現米国特許第５，３８６，０２５号の継続出願である、１９９４年１１
月７日に提出され、許可された米国特許出願第０８／３３６，２５７号、現米国
特許第５，７２６，０３５号にも関連する。

【０００９】 許される場合には、上記米国出願、特許、および国際ＰＣＴ出願の各内容は、
全体として、参照してここに組み込まれる。

【００１０】 技術分野 本発明は、分子生物学および薬理学に関するものである。より詳細には、本発
明は、カルシウムチャネル組成物、およびそれを作製、使用する方法に関する。

【００１１】 発明の背景 カルシウムチャネルは、細胞外液から細胞内へのＣａ^２＋イオンの取り込みを
調節する、多重サブユニットの膜貫通タンパク質である。動物界の生物すべての
細胞、および、少なくとも何種類かの細菌、菌類、および植物の細胞が、１種ま
たはそれ以上のカルシウムチャネルをもっている。もっとも普通の型のカルシウ
ムチャネルは電位依存型である。中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、末梢神経
細胞、ならびに骨格筋、心筋、および動静平滑筋細胞などの筋細胞のような、動
物の「興奮性」細胞はすべて、電位依存型カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）をも
っている。電位依存型チャネルが、Ｃａ^２＋イオンを流入させるために「開口」
するには、チャネルをもつ細胞の内部と、その細胞を取り囲んでいる外部環境と
の間の電位差を一定のレベルまで脱分極する必要がある。細胞中へのＣａ^２＋イ
オンの流入速度は、この電位差に依存する。

【００１２】 カルシウムチャネルは、多重サブユニットタンパク質で、分子量約１３０から
約２００キロダルトン（「」ＫＤ」）の間の、α_１およびα_２と命名されている
２つの大サブユニット、および、分子量約６０ｋＤよりも小さな、１個から３個
のそれぞれ異なるサブユニットを含んでいる。大サブユニットの少なくとも一方
と、おそらく、いくつかの小サブユニットがグルコシル化されている。サブユニ
ットのいくつかは、リン酸化されうる。α_１サブユニットは、哺乳動物の筋肉組
織から単離して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析すると、分子量約１５０から１７０ｋＤであ
り、さまざまな１，４−ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）とフェニルアルキルアミン
に対する特異的結合部位をもっている。非還元的条件（Ｎ−エチルマレイミドの
存在下）で、α_２サブユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約１６０から１９０ｋ
Ｄに相当するバンドとして移動する。還元すると、大きな断片一つと小断片とが
解離する。ウサギ骨格筋のカルシウムチャネルβサブユニットは、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析によって５２−６５ｋＤの分子量をもつと決定されているリン酸化され
たタンパク質である。このサブユニットは、還元条件に対して非感受性である。
カルシウムチャネルのγサブユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、見かけ分
子量３０−３３ｋＤの糖タンパク質と考えられている。

【００１３】 カルシウムチャネルの構造と機能を調べるためには、大量の純粋なチャネルタ
ンパク質が必要である。これらの多サブユニットタンパク質は複合的な性質をも
つこと、タンパク質の供給源となる組織内でのカルシウムチャネル濃度が多様で
あること、組織内では、カルシウムチャネルは混合集団で存在すること、調べた
いと思う組織を入手するのが困難なこと、および、単離処理の過程で、自然のタ
ンパク質が修飾される可能性があることから、高度に精製された、完全に自然の
ままのカルシウムチャネルタンパク質を大量に得ることは至難の技である。

【００１４】 カルシウムチャネルは、さまざまな組織に存在し、細胞内のカルシウムイオン
濃度を調節する上で中心的な役割を果たしているため、神経伝達物質の放出、筋
肉の収縮、ペースメーカー活性、ならびに、ホルモンおよびその他の物質の分泌
など、多くの生命過程に関与している。これらの過程は、中枢神経系疾患、およ
び心臓血管疾患など、人間の数多くの疾患に関係していると考えられている。す
なわち、カルシウムチャネルは、多くの疾患にも関係している。人間を含む動物
における、さまざまな心臓血管疾患を治療するのに役立つ化合物の多くは、心筋
および／または血管平滑筋に存在する電位依存型カルシウムチャネルの機能を調
節することによって、有益な効果を及ぼすものと考えられている。これらの化合
物の多くは、カルシウムチャネルに結合して、細胞膜の脱分極に対する反応とし
てＣａ^２＋イオンが細胞内に流入するのを阻止するか、流入速度を低下させる。

【００１５】 ウサギカルシウムチャネルα_１サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの
組換え発現、およびこのｃＤＮＡクローンの転写産物についての実験結果は、α _１ サブユニットが、カルシウムが細胞の中に入るときに通過するポアを形成する
ことを示している。これらの組換え細胞の中で発生するバリウムイオン流と、構
成成分の一つとして、それぞれのα_１サブユニットを含むカルシウムチャネルに
よって生じる実際のイオン流とのインビボでの関連性については明らかでない。
しかし、異なったカルシウムチャネル型を完全かつ正確に特徴づけて評価するた
めには、インビボで見られるサブユニットのすべてを含む組換えチャネルの機能
的性質を調べることが不可欠である。

【００１６】 この試験を行なって、カルシウムチャネルの構造と機能を十分に理解するため
には、できるだけたくさんのカルシウムチャネルのサブユニットを同定し、特徴
づけることが重要である。また、カルシウムチャネルと相互作用する化合物を同
定するときに用いる組換え細胞を調製するためには、明確になったサブユニット
を含む、均一なカルシウムチャネル集団を発現する細胞を作出できることが必要
である。

【００１７】 ＣＮＳなど、他の器官系のカルシウムチャネルと相互作用する化合物の薬理学
が解れば、神経変性疾患や心血管疾患の治療など、所望の治療効果を生じるよう
に、ヒトカルシウムチャネルのサブタイプと特異的に相互作用する化合物を合理
的に設計するのに役立つかもしれない。しかし、ヒトカルシウムチャネルの型、
特に、ＣＮＳ中における各サブタイプの分子的性質を独立に評価するために決定
することが出来ず、また、カルシウムチャネル効果を持つ化合物の特異性を評価
するために使用できる特異的カルシウムチャネルサブタイプの純粋な調製物が得
られないため、このような理解と、治療上有効な化合物を合理的に設計する可能
性が妨げられている。このように、ヒトカルシウムチャネルのサブユニットをコ
ードするＤＮＡを同定し、このＤＮＡを、カルシウムチャネルサブユニットや機
能的なカルシウムチャネルを発現させるために使用することは、治療上有効な化
合物をスクリーニングしたり設計したりするのに役立つ。

【００１８】 骨格筋、心筋、平滑筋、および脳など、哺乳動物のさまざまな組織から、多く
の型のカルシウムチャネルが同定されている（例えば、Ｂｅａｎ， Ｂ．Ｐ．
（１９８９） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１：３６７−３８４
、およびＨｅｓｓ， Ｐ． （１９９０） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ． ５６：３３７を参照のこと）。さまざまな型のカルシウムチャネルは、
イオン流の速動性、保持電圧感受性、およびカルシウムチャネルアゴニストとア
ンタゴニスト感受性によって、Ｌ型、Ｔ型、Ｎ型、Ｐ型、Ｑ型およびＲ型と、大
きく４つのグループに分類されている。カルシウムチャネルにおける多様性の主
要な決定因子は、ポアを形成するα_１サブユニットの性質である。多くのα_１サ
ブユニットをコードする核酸がクローニングされており、それらにコードされて
いるサブユニットも発現させられている。α_１サブユニットと、操作上定義され
たＣａ^２＋イオン流との間に相関関係があることが確認されている。６種類の遺
伝子産物であるα_１Ａ−_１−Ｅとα_１Ｓが、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ型チャネルを含
む高電位活性型チャネルの形成に関与している。

【００１９】 α_１Ａサブユニット、α_１Ｂサブユニット、α_１Ｃサブユニット、α_１Ｄサブ
ユニット、およびα_１Ｅサブユニットを含むヒトα_１サブユニットと、そのスプ
ライス変異体とをコードするＤＮＡについては既に記載がある（例えば、米国特
許第５，４２９，９２１号、第５，８４６，７５６号、第５，８５１，８２４号
、ＰＣＴ国際公開公報第ＵＳ９２／０６９０３号、およびＰＣＴ国際公開公報第
ＵＳ９４／０９２３０号参照）。これらのサブユニットは、高電圧カルシウム（
ＨＶＡ）チャネルの形成に関与していると思われるが、これらのα_１サブユニッ
ト一つの他に、βサブユニットと、ジスルフィド架橋によってα_２に結合してお
り、同じ前駆体から生じるδを含むα_２サブユニットを含んでいる。各チャネル
の異なる生物物理学的および薬理学的性質は、主として、α_１サブユニットから
派生するが、補助サブユニット、主には、チャネルに結合しているβサブユニッ
トによる調節を受ける。βサブユニットは、ピークイオン流の振幅を増加させて
、活性化／非活性化曲線をより過分極化された電位の方向に移動させ、また、活
性化と非活性化の動力学特性を変えることが分かっている（例えば、Ｌａｍｂｅ
ｒｔら、（１９９７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：６６２１−６６２５
参照）。α_２サブユニットは組織特異的であるが、いずれかのα_１サブユニット
によって生じたイオン流を増加させ、βサブユニットの刺激性応答を増強する。

【００２０】 Ｔ型ないしＬＶＡチャネル ＴチャネルまたはＬＶＡ（低電位活性化）チャネルと命名されているチャネル
については、ほとんど知られていない。低電位で活性化される（ＬＶＡ）、すな
わちＴ型のカルシウムチャネルは、多様な細胞型で見られるとのことである。ま
た、低電位で活性化（ＬＶＡ）ないしＴ型カルシウムチャネルは、中枢神経系お
よび末梢神経系に広く分布していて、異なる神経突起を拡張的に配列してゆくの
に関与すると考えられている。

【００２１】 一般的には、Ｔ型のイオン流は、基本的には、他のＣａ^２＋イオン流と変わら
ないと考えられている。ＨＶＡチャネル同様、Ｔ型チャネルは、外部の培地に最
低限濃度の２価陽イオンが存在する限り、２価陽イオンを選択的に透過させるこ
とができる。ＬＶＡ（またはＴ型）のイオン流について、この最低限度のＣａ^{２ ＋} 濃度は、約２５μｍであり、ＨＶＡのイオン流は、約１μｍである。Ｔ型イオ
ン流は、約１０ｍＭのＣａ^２＋というＫ_ｄ値で飽和することが報告されているが
、これは、ＨＶＡイオン流について報告されている値と同じである。しかし、こ
れらのチャネルには、一定の差違があると思われる。それらは、２価陽イオンの
透過性に関して違いがある。一般的には、ＨＶＡチャネルは、Ｃａ^２＋よりもＢ
ａ^２＋に対して透過性があるが、Ｔ型は、Ｃａ^２＋よりもＢａ^２＋に対して同程
度または僅かに低い透過性をもつ。Ｔ型チャネルは、より遅い活性化／不活性化
、および非活性化の動力学特性を示すとも考えられていて、Ｎｉ^２＋に対して相
対的に高い感受性を示すことが報告されている。この型のチャネルは、膜の休止
電圧に近いところで活性化され、反復的な着火活性または固有のニューロン振動
の発生、およびスパイク活性を伴うＣａ^２＋流入に関与すると考えられている（
例えば、Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ （１９９６） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ． ５８：３２９−３４８を参照）。最近のデータによれば、今までに
同定されたβサブユニットは、Ｔ型チャネルの構成的なサブユニットではないと
示唆されている（Ｌａｍｂｅｒｔら（１９９７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
１７：６６２１−６６２５）。さまざまなＬＶＡイオン流を発生させるカルシウ
ムチャネル構造は未知である。これまでにクローニングされたα_１サブユニット
はいずれも、低電位活性化Ｔ型（ないしＬＶＡ）チャネルがもつとされるすべて
の性質をもっていないようである。

【００２２】 したがって、本明細書においては、ＨＶＡ型チャネルとは異なる構造的および
機能的性質をもつ特異的カルシウムチャネルサブユニットをコードする核酸を提
供することを目的とする。また、Ｔ型チャネルによるとされる活性をもつチャネ
ルをコードする核酸を提供し、組織特異的またはサブタイプ特異的な組換えカル
シウムチャネルをもつ真核細胞を提供することも本明細書の目的である。また、
カルシウムチャネル活性の調節因子、特に、ヒトＴ型チャネル、およびその他の
型のチャネルの性質を示すチャネルに特異的な因子として働き、治療薬となる可
能性をもつ化合物を同定するアッセイを提供することも目的としている。

【００２３】 発明の概要 カルシウムチャネルのサブユニットをコードする、単離精製された核酸断片が
提供されている。これらのサブユニットは、低電位活性化（ＬＶＡ）チャネル、
特に、Ｔ型チャネルに伴う性質をもつチャネルを形成する。本明細書で提供され
るサブユニットと結果によって、ＬＶＡないしＴ型チャネルに相当するα_１サブ
ユニットファミリーが提供されている。これらのサブユニットを含むチャネルは
、低い電位差で開口することができるが、あまり長くない時間開口したままにな
るだけである。これらのチャネルは、視床、視床下部、および脳幹のニューロン
など、生理学的に重要な位置に存在しており、その結果、自律神経機能、たぶん
、心拍数、動静脈平滑筋の神経支配および緊張、肺拍数、その他重要な生理活性
などの心筋活性の調節に関係している可能性がある。

【００２４】 動物のチャネルのこれらα_１サブユニットをコードするＤＮＡ、および、この
ようなＤＮＡを転写して作られる、それらのサブユニットをコードするＲＮＡが
提供されている。特に、カルシウムチャネル、特に、動物のカルシウムチャネル
、より詳しくは、哺乳動物のカルシウムチャネルのＴ型カルシウムチャネルで、
α_１Ｈサブユニットと命名されているサブユニット（優先権書類である米国特許
出願第０８／９８４，７０９号では、α_１Ｆサブユニットと命名）をコードする
核酸が提供されている。

【００２５】 本明細書で特に関心をもっているのは、カルシウムチャネル、特に、哺乳動物
カルシウムチャネルのα_１Ｈサブユニットをコードする核酸である。例示的なα _１Ｈ サブユニットをコードする核酸が提供されている。ヒトカルシウムチャネル
の、α_１Ｈ−１サブユニット、α_１Ｈ−２サブユニットという名の２種類のスプ
ライス変異体をコードする核酸が提供されている。例示したサブユニットの核酸
配列と、そのコードするアミノ酸配列を、配列番号１２（α_１Ｈ−１）、１５（
α_１Ｈ−１）および１６（α_１Ｈ−２）に示した。配列番号１２と１５は、２２
３０番目のアミノ酸（６９８３−６９８５番目の塩基）が、配列番号１５ではＡ
ｓｐ（ＧＡＣ）であるのに、配列番号１２ではＧｌｕ（ＧＡＡ）であるところが
異なるだけである。

【００２６】 この核酸を用いて、α_１Ｈ−１サブユニットをコードする核酸の別のスプライ
ス変異体、対立遺伝子変異体、および、別の動物、特に、哺乳動物由来のα_{１Ｈ −１} サブユニットなどの変異体を単離することができる。このような核酸には、
配列番号１２および１５に示されているＤＮＡによってコードされているアミノ
酸配列と実質的に同一の配列をもつα_１Ｈ−１サブユニットをコードするＤＮＡ
などがある。この核酸を用いて、別の生物種、特に別の動物に由来するα_{１Ｈ− １} サブユニットをコードするＤＮＡを単離することができる。

【００２７】 α_１Ｈ−２と名付けられた別のスプライス変異体をコードする核酸も提供され
ている。この変異体の核酸配列は、９５７ヌクレオチドの欠失を有し、そのため
に３１９アミノ酸（α_１Ｈ−１の４７０−７８８番目のアミノ酸に対応）の欠損
を有する点で、α_１Ｈ−１と異なっている。

【００２８】 配列番号１２または１５の１５０６番目から２６２７番目のヌクレオチドを含
む核酸によってコードされるサブユニット、または、この領域から作製したプロ
ーブに、好ましくは、高いストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する核
酸によってコードされるサブユニットで、本明細書の方法を用いて同定すること
のできるＴ−チャネルをコードするサブユニットも含まれる。

【００２９】 α_１Ｈ−１サブユニットは、多くの側面で、α_１Ａ−α_１Ｅカルシウムチャネ
ルとは異なる。まず、膜通過ドメインＩとＩＩの間に位置する細胞内ループは、
ＨＶＡカルシウムチャネルよりもかなり長い。例えば、配列番号１２および１５
に例示され、後述されているように、ドメインＩとＩＩの間の細胞内ループは、
１，１００ヌクレオチドよりも長い（１，１２２ヌクレオチド）が、ＨＶＡカル
シウムチャネルにおける相当領域は、３５１から３８１ヌクレオチド長の範囲に
ある。すなわち、α_１Ｈの細胞内ループは、ＨＶＡカルシウムチャネルのα_１サ
ブユニットには見られない、約３７０個の余分なアミノ酸残基（配列番号１２の
４２０番目から７９４番目のアミノ酸）をもっている。なお、このループ領域を
コードするアミノ酸配列は、非常にプロリンに富み、ヒスチジン残基が９個連続
したポリＨＩＳ領域を含んでいる。

【００３０】 α_１Ｈサブユニットのその他の顕著な特徴には、膜通過ドメインＩとＩＩの間
にある細胞内ループ中に、α_１サブユニットとβサブユニットの間の相互作用に
とって重要なアミノ酸残基（例えば、Ｄｅ Ｗａａｒｄら、（１９９６） ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８０：２７２−２７６； Ｐｒａｇｎｅｌｌら、（１
９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６７−７０参照）がないことが含まれる。ま
た、α_１Ｈ−１サブユニットは、ドメインＩのＩＳ５とＩＳ６の間に、顕著に大
きな細胞外ループを含んでいる。本明細書において提供されているＨＶＡα_１カ
ルシウムチャネルサブユニットは、このループの中に２４９−２７０ヌクレオチ
ド残基を含んでいる。これに対して、ヒトα_１Ｈサブユニットは、このループの
中に４２６ヌクレオチド残基を含んでいる。膜通過ドメインＩＩＩとＩＶの間の
細胞内ループも、ＨＶＡα_１サブユニットよりも僅かに大きい（１５９−１６５
ヌクレオチドに対して１８６ヌクレオチド）。

【００３１】 少なくとも約１４個、好ましくは１６個、あるいは所望する場合には２０又は
３０個又はそれ以上の、α_１Ｈをコードする核酸の隣接したヌクレオチドを含む
、検出用に標識することができる核酸プローブを提供する。また、組織内のスプ
ライシング変異体及び組織間変異体を含めて、カルシウムチャネルサブユニット
をコードするＤＮＡの単離とクローニングのためにプローブを使用する方法も提
供する。ヒトα_１ＨサブユニットをコードするＤＮＡの単離用プローブを構築す
るための特に好ましい領域は、膜内外ドメインＩとＩＩの間に位置する、著しく
長い細胞内ループをコードする核酸配列（例えば、配列番号１２及び１５のｎｔ
１５０６からｎｔ ２６２７）を含む。ヒトα_１Ｈサブユニットをコードする
ＤＮＡを単離するためのプローブは、好ましくは１４又は１６個の長さの隣接ヌ
クレオチドである。時には３０又は５０ヌクレオチドのプローブを使用し、また
５０から１００ヌクレオチドのプローブを使用する場合もある。

【００３２】 １又はそれ以上のカルシウムチャネルサブユニット、特にヒトカルシウムチャ
ネルサブユニットをコードする異種ＤＮＡを含む真核細胞、あるいは１又はそれ
以上の当該サブユニットをコードするＤＮＡクローンのＲＮＡ転写産物を含む真
核細胞を提供する。１個のα_１Ｈサブユニットが１つのチャネルを形成しうる。
しかし、選択した細胞において活性なチャネルを形成するために必要なサブユニ
ットの組合せは、本文中の方法を用いて経験的に決定することができる。例えば
、選択したα_１サブタイプ又は変異体が選択した細胞系で活性チャネルを形成し
ない場合には、活性チャネルが形成されるまで単数又は複数の追加サブユニット
を付加することができる。そのような付加の影響を評価するために他のサブユニ
ットを加えることもできる。

【００３３】 好ましい実施態様では、細胞は、動物、好ましくは哺乳類のカルシウムチャネ
ルのα_１サブユニット、好ましくはα_１ＨサブユニットをコードするＤＮＡある
いはＲＮＡを含む。細胞がα_１Ｈをコードする核酸を含む実施態様がここでは特
に興味深い。他の実施態様では、細胞は、α_２δを含めた追加異種サブユニット
をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡを含む。細胞はまた、βサブユニット及び／
あるいはγサブユニットをコードする核酸も含みうる。そのような実施態様にお
いては、α_１、α_１＋β、α_１＋β＋α_２のいずれかをコードするＤＮＡのよう
な、サブユニットをコードするＤＮＡクローンの１、２、３、又は４個の組合せ
を安定にあるいは一過性に移入した真核細胞を提供する。本文中で提供する真核
細胞は、α_１サブユニット及び任意に異種α_２サブユニット及び／あるいはβサ
ブユニット及び／あるいはγサブユニットをコードする異種核酸を含む。

【００３４】 好ましい実施態様では、細胞はそのような異種カルシウムチャネルサブユニッ
トを発現し、膜を貫通して存在する異種カルシウムチャネル中に１又はそれ以上
のサブユニットを含む。より好ましい実施態様では、真核細胞は、生理的濃度で
異種カルシウムチャネルの活性を変化させるカルシウムチャネル選択性イオン及
び／あるいは結合化合物の通過を制御することができる、機能性の異種カルシウ
ムチャネルを発現する。一部の実施態様では、異種カルシウムチャネルは少なく
とも１個の異種カルシウムチャネルサブユニットを含む。最も好ましい実施態様
では、真核細胞の表面で発現されるカルシウムチャネルは、実質的にあるいは全
面的に、異種ＤＮＡあるいはＲＮＡによってコードされるサブユニットで構成さ
れる。好ましい実施態様では、そのような細胞の異種カルシウムチャネルは、宿
主細胞の内因性カルシウムチャネルとは識別されうる。そのような細胞は、相同
なカルシウムチャネル群を得るための手段を提供する。典型的には、細胞は、選
択したカルシウムチャネルをその細胞によって発現される唯一の異種イオンチャ
ネルとして含む。

【００３５】 一部の実施態様では、カルシウムチャネルサブユニットをコードする異種ＤＮ
Ａを含む組換え真核細胞は、１又はそれ以上のサブユニットをコードするＤＮＡ
でトランスフェクションすることによって作製するか、あるいは１又はそれ以上
のカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡのＲＮＡ転写産物を注入
する。ＤＮＡは、線形ＤＮＡ断片として導入するか、あるいはサブユニットをコ
ードするＤＮＡの安定又は一過性発現のための発現ベクターに含めることができ
る。ヒトカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを含むベクターも
提供する。

【００３６】 異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞は、カルシウムチャネルの機能に
関するアッセイにおいて使用でき、あるいは機能性組換えヒトカルシウムチャネ
ルを構築するために必要とされるよりも少ないサブユニットコード核酸で形質転
換した細胞の場合には、そのような細胞を使用してカルシウムチャネル活性への
追加サブユニットの影響を評価することができる。その後、ヒトカルシウムチャ
ネルサブユニットをコードする１又はそれ以上のＤＮＡクローンあるいはＲＮＡ
転写産物でそのような細胞をトランスフェクトすることによって追加サブユニッ
トが提供できる。

【００３７】 膜を貫通する異種カルシウムチャネルを発現する組換え真核細胞は、カルシウ
ムチャネル活性を調節する化合物を同定するための方法において使用しうる。特
に、当該細胞は、ヒトにおけるカルシウムチャネル活性の作用物質と拮抗物質を
同定するアッセイにおいて、及び／あるいはカルシウムイオンの輸送及び輸送調
節への種々のカルシウムチャネルサブユニットの関与を評価するアッセイにおい
て使用される。細胞は均質なカルシウムチャネル群を構成するので、そのような
各々の群に特異的な、カルシウムチャネル活性の作用物質又は拮抗物質を同定す
るための手段を提供する。

【００３８】 本文中で提供する細胞は、Ｔ型チャネルの機能と組織分布を評価し、Ｔ型チャ
ネルの活性を調節する化合物を同定するために使用しうる。Ｔ型チャネルは視床
、視床下部及び脳幹のニューロンで作動し、心拍数、動脈及び静脈平滑筋の神経
支配と緊張、肺動脈拍及び他の基本的プロセスのような心筋活性の調節において
自律神経機能に関与すると考えられるので、そのような活性を評価するためにデ
ザインされたアッセイ及びこれらの活性の調節因子を同定するためのアッセイは
、基本的な生理的プロセスを理解するための手段、そしてまた障害を矯正するた
めの新規薬剤候補物質を同定するための手段も提供する。

【００３９】 カルシウムチャネル活性を調節する化合物を同定するために真核細胞を使用す
るアッセイも提供する。これらのアッセイを実施する際には、本文中で提供する
ＤＮＡによってコードされる少なくとも１個のサブユニットを含む、異種カルシ
ウムチャネルを発現する真核細胞を、試験化合物とカルシウムチャネル選択性イ
オンを含む溶液に入れ、細胞膜を脱分極し、細胞に流れ込むイオン流を検出する
。試験化合物がカルシウムチャネル活性を調節するものであれば、検出されるイ
オン流は、同じカルシウムチャネル選択性イオンは存在するが化合物の不在下で
、同じ又は実質的に同じ細胞を脱分極することによって生じるものとは異なる。
好ましい実施態様では、脱分極段階の前に、細胞の内因性カルシウムチャネルを
実質的に不活性化する保持電位に細胞を維持する。また好ましい実施態様では、
細胞は哺乳類細胞、最も好ましくはＨＥＫ細胞あるいは両生類卵母細胞である。

【００４０】 ＴチャネルあるいはＬＶＡチャネルを発現する細胞は、これらのチャネルの活
性の調節因子、特に拮抗物質としての活性を持つ化合物をスクリーニングするア
ッセイにおいて使用しうる。

【００４１】 カルシウムチャネル、特にα_１Ｈサブユニットを含むカルシウムチャネルの活
性を調節する化合物（米国特許第５，４３６，１２８号及び同第５，４０１，６
２９号参照）を同定するための転写ベースのアッセイを提供する。これらのアッ
セイは、カルシウムチャネル、特にα_１Ｈサブユニットを含むカルシウムチャネ
ル、より好ましくは異種ＤＮＡによってコードされるα_１Ｈサブユニットを含む
カルシウムチャネルを発現し、同時にカルシウムチャネルによって調節される１
又はそれ以上の転写制御要素と機能的に結合したリポーター遺伝子を含むリポー
ター遺伝子構築物をコードする核酸を含む細胞を使用する。アッセイは、化合物
が存在するときの本文中で提供する細胞におけるリポーター遺伝子の転写量と化
合物の不在下での転写量の差を比較することによって実施し、それにより、細胞
において異種カルシウムチャネルの活性を調節する化合物を同定する。リポータ
ー遺伝子は、細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコード
する遺伝子、ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子、細菌ルシフェラーゼを
コードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子あるいはアルカリ
ホスファターゼをコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない当業者に既知
の遺伝子であり、転写制御要素は、血清応答要素、環状アデノシン一リン酸応答
要素、ｃ−ｆｏｓ遺伝子プロモーター、血管作用性小腸ペプチド遺伝子プロモー
ター、ソマトスタチン遺伝子プロモーター、プロエンケファリンプロモーター、
ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ遺伝子プロモーターあるいは神経
成長因子−１ Ａ遺伝子プロモーター、ならびに細胞内カルシウムイオンレベル
に応答する要素を含むがこれらに限定されない当業者に既知の要素である。

【００４２】 試験化合物に対する受容体活性を測定するその他のアッセイも、本文中で提供
する細胞に関して実施しうる（例えば、米国特許第５，６７０，１１３号参照）
。

【００４３】 Ｔ型チャネルは様々な鍵となる機能に関連すると思われるので、Ｔチャネルを
発現する細胞及びそのような細胞を用いるアッセイ、様々な障害、疾患及び状態
の治療のための化合物を同定する上で有用であろう。同定された化合物は、Ｔチ
ャネル活性に関連した疾患及び状態の治療において使用するための候補物質とな
る。そのような活性は、収縮期高血圧において動脈のコンプライアンスを改善す
るため、あるいは末梢循環障害その他において血管のウエリング（ｗｅｌｌｉｎ
ｇ）を低下させることなどによって血管緊張を改善するための、筋の興奮性、分
泌及びペースメーカー作用、Ｃａ^２＋依存性バースト発射、ニューロンの振動、
及びシナプスシグナルの増強作用における役割に関与するもの含むがこれらに限
定されない。その他の疾患は、高血圧、次のものを含むがそれらに限定されない
心臓血管障害：心筋梗塞、不整脈、心不全及び狭心症、精神分裂病、てんかん及
びうつ病などの神経障害、末梢筋障害、呼吸障害、ならびに内分泌障害を含むが
これらに限定されない。

【００４４】 特に、α_１ＨサブユニットのようなＬＶＡチャネルを発現する細胞は、心房ペ
ースメーカー細胞、プルキンエ線維、そして冠状動脈平滑筋のような伝導組織に
関連する疾患の治療のための候補物質となる化合物を同定する上で有用である。
そのような化合物は、狭心症のような心臓血管治療、高血圧のような血管治療、
ならびに外傷や心臓発作、その他の心臓損傷後に正常な心拍数と心拍出量を再建
するための泌尿器、肝、生殖器の補助療法、心筋梗塞（ＭＩ）後及び急性期にお
けるＭＩの治療のために有用な化合物を含むがこれらに限定されない。ＬＶＡ、
特にＴ型カルシウムチャネルと相互作用する他の化合物は、血圧あるいは心拍数
を変化させずに、左心室拡張終期血圧によって測定されるような心収縮力を高め
るのに有効であると考えられる。急性期には他の化合物は、心臓抑制作用を伴わ
ずに、コラーゲンの沈着あるいは中隔の肥厚によって測定されるような瘢痕組織
の形成を低下させるために有効であると考えられる。アッセイは、（ａ）例えば
外傷、手術又は心肺バイパス後に血圧制御を再建するための治療及び麻酔薬の心
臓血管作用を最小限に抑えるためにデザインされた予防的治療；（ｂ）自律神経
系による血管反射と血圧制御を改善するための治療において、血管平滑筋の緊張
を調節する上で、すなわち血管拡張あるいは血管収縮において有用な化合物を同
定し、また（ａ）手術、外傷、尿毒症及び薬剤副作用に続く腎不全の治療と回復
；（ｂ）膀胱機能不全の治療；及び（ｃ）尿毒症性神経毒性及び血液透析下の患
者における低血圧の治療のような泌尿器障害の治療のために有用な化合物を同定
し、さらに（ａ）不能症を含めた性機能障害；（ｂ）アルコール性不能症（Ｔチ
ャネル制御に従うと考えられる自律神経制御下の）のような生殖器障害を治療す
る上で有用な化合物を同定し、アルコールの急激な過剰消費から生じる神経毒性
と自律神経系損傷のような肝障害を治療し、軽減する上で有用な化合物を同定し
、（ａ）てんかん及び間脳性てんかん；（ｂ）パーキンソン病；（ｃ）振せんや
発汗分泌及び末梢血供給の異常のような温度制御異常；（ｄ）ノルアデナリン、
ドーパミンその他のホルモンの分泌異常を含めた下垂体及び視床下部機能の異常
のような神経障害を治療する上で有用な化合物を同定し、また例えば麻酔の術後
合併症のような呼吸器異常の治療のような呼吸器障害を治療する上で有用な化合
物を同定し、さらに例えばインスリン、サイロキシン、アドレナリンの過剰産生
や他のホルモン平衡失調のための可能な治療を含めて、ホルモンの分泌異常のよ
うな内分泌障害を治療する上で有用な化合物を同定する。

【００４５】 精製ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニット及びかかるサブユニットを含
む精製ヒトカルシウムチャネルを提供する。サブユニットとチャネルは、当該サ
ブユニットをコードする核酸でトランスフェクトした真核細胞から単離すること
ができる。

【００４６】 もうひとつの実施態様では、ヒトカルシウムチャネル、ヒトカルシウムチャネ
ルサブユニットあるいはヒトカルシウムサブユニットのエピトープを含む断片の
実質的に純粋な製剤で免疫した動物の血清から得られる免疫グロブリンあるいは
抗体を提供する。ヒトカルシウムチャネル、ヒトカルシウムチャネルサブユニッ
トあるいはそのエピトープを含む断片を免疫原として用いて生成されるモノクロ
ーナル抗体を提供する。ヒトカルシウムチャネルサブユニットの断片を含む大腸
菌融合タンパク質も免疫原として使用しうる。そのような融合タンパク質は、カ
ルシウムチャネルサブユニットペプチドに融合した、大腸菌ＴｒｐＥタンパク質
のような細菌タンパク質又はその一部を含みうる。カルシウムチャネルサブユニ
ットあるいは精製カルシウムチャネルを免疫原として用いて生成される免疫グロ
ブリンは、種々の特性の中でも特に、生物サンプルあるいはかかる生物サンプル
から誘導される溶液中に存在しうるヒトカルシウムチャネルあるいはそのサブユ
ニットに特異的且つ選択的に結合し、及び／あるいは免疫沈降を生じさせる能力
を持つ。そのような抗体はまた、当該抗体がそれに対して特異的であるサブユニ
ットを含むカルシウムチャネルを発現する細胞を選択的に単離するためにも使用
しうる。

【００４７】 カルシウムチャネルを上述した抗体の有効量に接触させることによってイオン
チャネルの活性を変調させる方法も提供する。

【００４８】 そして、ＬＶＡカルシウムチャネル、特にＴ型チャネルの活性を変化させる化
合物を同定するためのアッセイ、ならびに当該方法によって同定される化合物を
提供する。

【００４９】 ＬＶＡカルシウムチャネルが媒介する、特にＴ型チャネルが媒介する疾患を診
断するための方法も提供する。診断方法は、正常なあるいは野生型チャネルと比
較して、アミノ酸配列の変化、薬理学的プロフィールの変化及び電気生理学的プ
ロフィールの変化のようなチャネル発現の異常あるいは機能の異常を検出するこ
とを含む。そのような方法は、典型的には変化したチャネルあるいは核酸プロー
ブに特異的な抗体を使用して、変化した遺伝子又は転写産物を検出することがで
きる。

【００５０】 発明の詳細な説明 定義： 特に異なる定義が為されていない限り、本文中で使用するすべての技術・学術
用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと
同じ意味を持つ。本文中で引用するすべての特許及び公表文献は参照してここに
組み込まれる。

【００５１】 各々のカルシウムチャネルサブユニットについての言及は、本文中で特定して
開示されるサブユニット、ならびにプローブとして開示される核酸を使用して、
少なくとも低ストリンジェンシー下で、好ましくは高ストリンジェンシー下で適
当なヒトｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単
離しうる核酸によってコードされるヒトカルシウムチャネルサブユニットを含む
。そのようなＤＮＡはまた、ギャップを考慮に入れて本文中で述べるサブユニッ
トタンパク質のいずれかと約４０％の相同性、典型的には少なくとも約９０％の
配列同一性を持つタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは少なくとも低ストリ
ンジェンシー条件下で本文中で提供するＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡ又
はＲＮＡを含み、かかるＤＮＡによってコードされるタンパク質は、機能あるい
は分子量のような付加的な同定特性を示す。特に、α_１Ｈサブユニットについて
の言及は、本文中でプローブとして開示する核酸を使用して、所望するソースか
らの核酸ライブラリーから単離することができるサブユニットをさす。コードさ
れるサブユニットは、膜内外ドメインＩとＩＩの間の著しく長い細胞内ループの
存在、及び／あるいはＴ型又はＬＶＡ型チャネルに帰せられる特性を特徴とする
。

【００５２】 開示されているサブユニットあるいは他のそのようなサブユニットのスプライ
シング変異体である転写産物によってコードされるサブユニットは、いずれかひ
とつのサブユニットと４０％未満の全体的相同性を示すが、１又はそれ以上のか
かるサブユニットとそのような相同性を持つ領域を含むことは明白である。また
、４０％の相同性とは、アミノ酸の約４０％を共有するか、若しくはそれよりい
くぶん低いが、それによってタンパク質の活性が実質的に変化しない保存的アミ
ノ酸置換を含むタンパク質をさすことは明白である。

【００５３】 当該サブユニット及びそのようなサブユニットをコードするＤＮＡ断片は、本
文中で提供されるか若しくは当業者に既知であり（公開国際ＰＣＴ特許願第ＷＯ
８９／０９８３４号、同第９５／０４８２２号、米国特許第５，７９２，８４６
号、同第５，７２６，０３５号、同第５，４０７，８２０号、同第５，６８６，
２４１号、同第５，６１８，７２０号、同第５，７１０，２５０号、同第５，４
２９，９２１５号、同第，４２９，９２１号及び同第５，３８６，０２５号参照
）、ヒトカルシウムチャネルのα_１、α_２、βあるいはγサブユニットを含む。

【００５４】 ＬＶＡサブユニット、特にヒト及び他の動物のカルシウムチャネルのα_１Ｈサ
ブユニットをコードする核酸を本文中で提供する。特に、そのようなＤＮＡ断片
は、（１）当該サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、（２）次の
中から選択される、ヒトカルシウムチャネルのサブユニットをコードする単離Ｄ
ＮＡ断片を含む： （ａ）ヒトカルシウムα_１Ｈチャネルサブユニットをコードし、かかるサブユ
ニットをコードする本文中の配列表のいずれか（すなわち配列番号１２、１５及
び１６）に示されているヌクレオチドの配列を含む、ヌクレオチドの配列； （ｂ）当該サブユニットをコードし、ＬＶＡサブユニット、特にα_１Ｈサブユ
ニットをコードする、ヒト細胞中に存在するｍＲＮＡ転写産物に相補的なＤＮＡ
に高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列； （ｃ）配列番号１２から１６のいずれかによってコードされるアミノ酸の配列
を含むサブユニットをコードする、ヌクレオチドの配列；ならびに （ｄ）当該サブユニットをコードするヌクレオチドの配列によってコードされ
るアミノ酸の配列を含み、配列番号１２−１６のいずれかに示されているヌクレ
オチドの配列を含むサブユニットをコードする、ヒト細胞中に存在するｍＲＮＡ
転写産物に相補的なＤＮＡに高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成す
る、ヌクレオチドの配列。

【００５５】 本文中で使用するとき、種々の遺伝子によってコードされるα_１サブユニット
型は、α_１Ａ、α_１Ｂ、α_１Ｃ、α_１Ｄ、α_１Ｅ及びα_１Ｈ型とも称される。こ
れらの型はまた、α_１ＢについてはＶＤＣＣ ＩＶ、α_１ＣについてはＶＤＣＣ
ＩＩ及びα_１ＤについてはＶＤＣＣ ＩＩＩとも称されてきた。スプライシン
グ変異体であるサブユニットサブタイプは、例えばα_１Ｈ−１、α_１Ｈ−２、α _１Ｂ−１ 、α_１Ｂ−２、α_１Ｃ−１等々と称される。

【００５６】 従って、本文中で使用するとき、α_１サブユニットをコードする核酸（ＤＮＡ
又はＲＮＡ）は、少なくとも低ストリンジェンシー条件下、典型的には高ストリ
ンジェンシー条件下で本文中で提供するＤＮＡにハイブリッド形成する核酸、あ
るいはヒトカルシウムチャネルの特定α_１サブユニットをコードする、本文中で
開示するＤＮＡによってコードされるタンパク質と少なくとも４０％の相同性を
持つサブユニットをコードする核酸をさす。ＬＶＡチャネルの場合には、核酸は
、少なくとも低ストリンジェンシー条件下、典型的には高ストリンジェンシー条
件下でα_１Ｈサブユニットをコードする核酸にハイブリッド形成するサブユニッ
トをコードし、また本文中で述べるもののような、当該活性に関するアッセイに
おいて必要なＬＶＡ特性を持つサブユニットをコードする。スプライシング変異
体は様々なパーセンテージの全体的相同性（又は同一性）を有するが、同じ遺伝
子から誘導され、１００％同一性の領域を含む。

【００５７】 特に、α_１サブユニットのいずれか（あるいは本文中で特に開示するサブユニ
ットのいずれか）のスプライシング変異体は、相違する領域（少なくとも１個の
エクソン）と、本文中で提供するα_１サブユニットサブタイプの１又はそれ以上
と１００％の相同性を持つ１又はそれ以上の領域（少なくとも１個のエクソン、
典型的には約１６以上のヌクレオチド、また一般には実質的にそれ以上）を含み
、さらにまた、異なるエクソンから誘導されるので、実質的により低い相同性を
持つ領域も含む。エクソン及びスプライシング変異体を同定することは十分に当
該技術の範囲内である。それ故、例えばα_１Ｈサブユニットは、本文中で開示す
るα_１Ｈサブユニットの１個と少なくとも約４０％のタンパク質相同性を共有す
るので、容易に同定可能であり、１００％相同な少なくとも１つの領域（１個の
エクソン）を含む。それはまた、以下で論じるように、ＬＶＡα_１サブユニット
であることを示す活性も有している。

【００５８】 本文中では、同一性及び相同性は、タンパク質を比較するときには共有される
アミノ酸のパーセンテージをさし、核酸を比較するときには共有されるヌクレオ
チドのパーセンテージをさすことに留意しなければならない。同一性を決定する
ための数多くのコンピュータプログラムが入手可能である。いずれの場合も、意
図するギャップペナルティーやその他のパラメータは、製造者によって定められ
たデフォルトである。配列間に高度の（９０％以上）同一性があるときには実際
上必要ないが、そのようなプログラムは、配列同一性のパーセンテージを決定す
るためのＤＮＡＳｔａｒ“ＭｅｇＡｌｉｇｎ”プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）“Ｇａｐ”プログラム（Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ）などの市販の配列アラインメントプログラムを含むがこれらに限定
されない（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、「分子生物学における配列分析：平凡な研究
の貴重な発見物」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）付録２（７つの市
販のソフトウエアプログラムの中でＵＷＧとＤＮＡＳｔａｒを引用している））
。

【００５９】 α_１サブユニットは、カルシウムチャネルを形成する能力によって同定しうる
。典型的には、α_１サブユニットは少なくとも約１２０ｋＤ以上の分子量を持つ
。また、推定α_１サブユニットアミノ酸配列のヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔ
ｈｙ）プロットは、α_１サブユニットが４個の内部リピートを含み、各々が６個
の膜内外ドメインを含むことを示唆している。α_１Ｈサブユニットは、そのポア
形成能力と生じるチャネルの低電圧活性化によって同定される。

【００６０】 カルシウムチャネルの活性は、電気生理学的方法や本文中で述べる他の方法を
含めて、当業者に既知の方法によってインビトロで評価することができる。典型
的には、α_１サブユニットは、１，４−ＤＨＰあるいはω−ＣｇＴｘのようなカ
ルシウムチャネル活性の１又はそれ以上の調節因子と直接又は間接的に相互作用
する領域を含む。α_１サブユニットの型は、結合特異性に基づくものを含めて、
当業者に既知の方法によって識別しうる。例えば、α_１Ｂサブユニットはこれま
でＮ型チャネルと称されてきたチャネルの形成に関与し、α_１Ｄサブユニットは
これまでＬ型チャネルと称されてきたチャネルの形成に関与すること、α_１Ａサ
ブユニットは、これまでＰ型チャネル称されてきたチャネルの典型的な特徴を示
すチャネルの形成に関与すると思われ、α_１ＨサブユニットはＴ型チャネルに関
連した活性を示すチャネルに関与すると思われることが認められた。従って、例
えばα_１Ｂサブユニットを含むチャネルの活性は１，４−ＤＨＰに対して感受性
がないが、α_１Ｄサブユニットを含むチャネルの活性は１，４−ＤＨＰによって
調節される又は変化する。現在のところ、薬理学的特徴とイオン流動態に基づい
てカルシウムチャネルに言及し、歴史的な名称は避けることが好ましい。α_１サ
ブユニットのタイプ及びサブタイプは、そのような調節因子の当該サブユニット
又は当該サブユニットを含むチャネルへの作用、ならびに当該サブユニットを含
むカルシウムチャネルによって生じるイオン流の差及びイオン流動態によって特
徴づけられる。α_１Ｈサブユニットはさらに、膜内外ドメインＩとＩＩの間（例
えば配列番号１２のｎｔ １５０６からｎｔ ２６２７）のような著しく長い細
胞内ループ領域の存在によって同定されうる。

【００６１】 特に、本文中で使用するとき、α_１Ｈサブユニットをコードする核酸は、配列
番号１２、１５及び１６として本文中で開示する核酸に高ストリンジェンシー条
件下でハイブリッド形成し、ＬＶＡあるいはＴチャネルの電気生理学的及び／あ
るいは薬理学的特性を示す、ＨＥＫ細胞のような哺乳類細胞においてチャネルを
形成する。電気生理学的特性は、次の電気生理学的特性の１又はそれ以上を含む
：約５ｐＳ（ピコ秒）から約９ｐＳのＢａ^２＋の相対コンダクタンス、約２から
約８ミリ秒の活性化時間、約−６０ミリボルトから約２６ミリボルトの活性化Ｖ _１／２ 値の動力学値、約１０から約３０ミリ秒の不活性化時間、約−１００ミリ
ボルトから約−５００ミリボルトの不活性化Ｖ_１／２値の動力学値、及び約２か
ら約１２ミリ秒のテール非活性化時間。

【００６２】 さらに、生じるチャネルは、ＨＶＡカルシウムチャネルと比較して、ｍｉｂｅ
ｆｒａｄｉｌ、（１Ｓ，２Ｓ）−２−［２−［［３−（１Ｈ−ベンズイミダゾー
ル−２−イル）プロピル］メチル−アミノ］エチル］−６−フルオロ−１−イソ
プロピル−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−イルメトキシアセテ
ート（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）に対する比較的高い度合の
感受性、及び／あるいはＣｏｎｕｓマキガイ毒素ＧＶＩＡ及びＭＶＩＩＣならび
にクモ毒素ＡｇａＩＩＩＡ及びＡｇａｌＶＡに対する比較的高い度合の抵抗性の
ような薬理学的特性を持つと考えられる。

【００６３】 本文中で使用するとき、α_２サブユニットは、哺乳類カルシウムチャネルのα _２ サブユニットをコードする、あるいは低ストリンジェンシー条件下、好ましく
は高ストリンジェンシー条件下でＤＮＡにハイブリッド形成する、あるいはギャ
ップを考慮に入れて、開示されているものと少なくとも約４０％の相同性、典型
的には少なくとも約９０％の同一性を持つタンパク質をコードする、例えば米国
特許第５，４０７，８２０号、同第５，７９２，８４６号及び国際ＰＣＴ特許願
第ＷＯ９５／０４８２２号に開示されている核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）によって
コードされる。そのようなＤＮＡは、典型的には約１２０ｋＤより大きい分子量
を持つが、α_１サブユニットが存在しなければカルシウムチャネルを形成せず、
α_１サブユニットを含むカルシウムチャネルの活性を変化させうるタンパク質を
コードする。スプライシング変異体として生じるα_２サブユニットのサブタイプ
は、α_２ａ、…α_２ｅのように小文字で表される。さらに、α_２サブユニット及
びタンパク質を還元条件に供するときに生じる大きな断片は、少なくともＮ結合
糖類でグリコシル化されると思われ、α_１サブユニットに特異的に結合する１，
４−ＤＨＰやフェニルアルキルアミンとは特異結合しない。より小さな断片であ
るＣ末端断片はδサブユニットと称され、約９４６から（国際ＰＣＴ特許願第Ｗ
Ｏ９５／０４８２２号においてナンバリングされているような、例えばその中の
配列番号１１）ほぼＣ末端までのアミノ酸を含む。この断片は、α_２サブユニッ
トを還元条件に接触させたときα_２の残りの部分から解離しうる。本文中での目
的のために、α_２はα_２δとも称する。従ってα_２δについての言及は、Ｃ末端
δ部分を含む、α_２サブユニットを意味する。

【００６４】 本文中で使用するとき、βサブユニットは、例えば米国特許第５，４０７，８
２０号、同第５，７９２，８４６号及び国際ＰＣＴ特許願第ＷＯ９５／０４８２
２号に開示されている、あるいはその中で提供されるＤＮＡに低ストリンジェン
シー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、
あるいはその中で開示されているものと少なくとも約４０％の相同性、典型的に
は少なくとも約９０％の相同性を有しており、典型的にはαサブユニットよりも
小さい、約５０−８０ｋＤの分子量を持ち、α_１サブユニットが存在しなければ
検出可能なカルシウムチャネルを形成しないが、α_１サブユニットを含むカルシ
ウムチャネルあるいはα_１とα_２サブユニットを含むカルシウムチャネルの活性
を変化させうるタンパク質をコードするＤＮＡによってコードされる。

【００６５】 種々の遺伝子によってコードされるβサブユニットの型は、β_１、β_２、β_３ 及びβ_４のように下付き文字で表される。特定の型のスプライシング変異体とし
て生じるβサブユニットのサブタイプは、型と変異体を表す下付き数字で表され
る。そのようなサブタイプは、β_１−１−β_１−５を含むβ_１スプライシング変
異体及びβ_２Ｃ−β_２Ｅを含むβ_２変異体を含むがこれらに限定されない。

【００６６】 本文中で使用するとき、γサブユニットは、例えば米国特許第５，７２６，０
３５号及び同第５，３８６，０２５号に開示されており（Ｊａｙら（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４９０−４９２及びＬｅｔｔら（^＊１９８８）Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３４０−３４７も参照のこと）、その中で開
示されている核酸をプローブとして用いてハイブリダイゼーションあるいは当業
者に既知の他の方法によって単離・同定でき、それによってγサブユニットをコ
ードする完全長のクローンが単離又は構築できるＤＮＡによってコードされるカ
ルシウムチャネルのサブユニットである。γサブユニットは上記の中で提供され
るＤＮＡに低ストリンジェンシー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件
下でハイブリッド形成し、本文中で述べるγサブユニットと少なくとも約４０％
の相同性を持つタンパク質をコードするのに十分な配列相同性を示す核酸によっ
てコードされる。

【００６７】 それ故、本文中の開示に照らして当業者は、種々の遺伝子によってコードされ
るタイプ及びスプライシング変異体を表すサブタイプを含めて、α_１、α_２、β
、δ及びγカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを同定すること
ができる。例えば、本文中で開示するＤＮＡに基づくＤＮＡ又はＲＮＡプローブ
を使用して、当該プローブへのハイブリダイゼーションに関してゲノム又はｃＤ
ＮＡライブラリーを含めた適切なライブラリーをスクリーニングし、タンパク質
全体をコードするオープンリーディングフレームを含む１又はそれ以上のクロー
ン中のＤＮＡを得ることができる。本文中で開示するＤＮＡで適切なライブラリ
ーをスクリーニングしたあと、コードされているタンパク質の配列が推定できる
オープンリーディングフレームが存在するかどうかについて、単離したＤＮＡを
検討することができる。分子量の決定及び本文中の配列との比較により、当該サ
ブユニットの同一性がα_１、α_２等のサブユニットとして明らかにされるはずで
ある。必要に応じて、機能性アッセイを使用して、当該サブユニットがα_１、α _２ サブユニットあるいはβサブユニットであるかどうかを調べることができる。

【００６８】 例えば、α_１ＡサブユニットをコードするＤＮＡは、ヒトα_１Ａサブユニット
の全部又は一部をコードするＤＮＡで適切なライブラリーをスクリーニングする
ことによって単離しうる。そのようなＤＮＡは、α_１サブユニットの一部をコー
ドする、ＡＴＣＣアクセス番号７５２９３として登録されているファージ中のＤ
ＮＡを含む。α_１ＡサブユニットをコードするＤＮＡは、α_１Ａサブユニットの
配列の全部又は一部を有するオリゴヌクレオチドでスクリーニングすることによ
り、適切なライブラリーから入手しうる（例えば公開国際ＰＣＴ特許願第ＷＯ９
５／０４８２２号、特に配列番号２１、２２及び／あるいは２３、あるいはその
中の登録ファージ中のＤＮＡ参照）。その代わりに、そのようなＤＮＡは、α_{１ Ａ} サブユニットをコードするコード配列を持つこともできる。本文中で例示する
方法を含めて、ＤＮＡの単離と同定及び完全長のゲノム又はｃＤＮＡクローンの
作製のための当業者に既知のいずれの方法も使用しうる。

【００６９】 α_１ＨをコードするＤＮＡは、ヒト髄質甲状腺癌細胞系（ＴＴ細胞）あるいは
他の適当なヒトｃＤＮＡライブラリーを、本文中で提供する核酸から作製したＤ
ＮＡプローブでスクリーニングすることによって単離できる。本文中で説明し、
例示するように完全長のクローンを構築し、発現して、生じたチャネルを試験し
てコード核酸がＬＶＡチャネルをコードしていることを確認する。

【００７０】 単離ＤＮＡによってコードされるサブユニットは、本文中で提供するＤＮＡ及
びサブユニットのアミノ酸配列と比較することによって同定しうる。スプライシ
ング変異体は広汎な相同領域を共有するが、非相同領域を含み、種々の遺伝子に
よってコードされるサブユニットは、非相同配列の均一な分布を共有する。

【００７１】 本文中で使用するとき、スプライシング変異体は、１以上の型のｍＲＮＡをも
たらすゲノムＤＮＡの転写一次産物のディファレンシャルプロセッシングによっ
て生じる変異体をさす。スプライシング変異体は、単一組織型内であるいは組織
の中で（組織特異的変異体）起こりうる。それ故、同一アミノ酸の領域と異なる
アミノ酸配列の領域を有するカルシウムチャネルサブユニットサブタイプをコー
ドするｃＤＮＡクローンを、本文中で「スプライシング変異体」と称する。

【００７２】 本文中で使用するとき、「カルシウムチャネル選択性イオン」は、Ｃａ^２＋の
流れを実質的に同じように許容する又は遮断する条件下で、細胞膜を貫通して存
在するカルシウムチャネルを通過して流れることができる又は流れることを遮断
されうるイオンである。Ｂａ^２＋はカルシウムチャネル選択性イオンの一例であ
る。

【００７３】 本文中で使用するとき、カルシウムチャネル活性を調節する化合物は、カルシ
ウムチャネルがカルシウムチャネル選択性イオンを通過させる能力に影響を及ぼ
す、あるいはイオン流動力学のように他の検出可能なカルシウムチャネル特性に
影響を及ぼすものである。そのような化合物は、カルシウムチャネル拮抗物質及
び作用物質、ならびに直接又は間接にカルシウムチャネルの活性に影響を及ぼす
化合物を含む。

【００７４】 本文中で使用するとき、「実質的に純粋な」サブユニット又はタンパク質は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同質と思われる、あるいは明白に配列決定されている
他のポリペプチド夾雑物を十分に免れているサブユニット又はタンパク質である
。

【００７５】 ここで使用するとき、選択的ハイブリド形成は、ＤＮＡ断片が複数の断片中か
ら第二の断片を特定しまたは単離できるために充分な特異性を以って第二の断片
にハイブリド形成することを意味する。

【００７６】 本文中で使用するとき、異種あるいは外来ＤＮＡとＲＮＡは相互交換的に使用
され、それが存在するゲノムの一部として天然に生じることはない、あるいは天
然に生じるのとは異なるゲノム内の位置（単数又は複数の）で認められるＤＮＡ
又はＲＮＡをさす。細胞に内因性ではなく、人為的に細胞に導入されたＤＮＡ又
はＲＮＡである。異種ＤＮＡの例は、カルシウムチャネルサブユニットをコード
するＤＮＡ、ならびに転写、翻訳あるいは他の調節可能な生化学的プロセスに影
響を及ぼすことによって内因性ＤＮＡの発現を媒介する又は変化させるＲＮＡ又
はタンパク質をコードするＤＮＡを含むがこれらに限定されない。カルシウムチ
ャネルサブユニットをコードするＤＮＡのような異種ＤＮＡを発現する細胞は、
同じか又は異なるカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを含みう
る。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノムに組み込まれるか又は
エピソームに保持されるように導入できる。

【００７７】 本文中で使用するとき、プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳停止部位
、並びに他のシグナル配列のようなヌクレオクチドの調節及びエフェクター配列
への異種ＤＮＡの機能的結合は、かかるＤＮＡとかかるヌクレオチド配列の機能
的関係をさす。例えば、プロモーターへの異種ＤＮＡの機能的結合は、リーディ
ングフレーム内のＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラー
ゼによって当該プロモーターから当該ＤＮＡの転写が開始されるような、ＤＮＡ
とプロモーター間の物理的及び機能的関係をさす。

【００７８】 本文中で使用するとき、単離された実質的に純粋なＤＮＡは、当業者によって
用いられる標準手法に従って（例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）精製されたＤＮＡ断片をさす。

【００７９】 本文中で使用するとき、発現とは、核酸をｍＲＮＡに転写し、ペプチド、ポリ
ペプチドあるいはタンパク質に翻訳するプロセスをさす。核酸をゲノムＤＮＡか
ら誘導する場合には、発現は、適切な真核宿主細胞あるいは生物を選択すれば、
ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。

【００８０】 本文中で使用するとき、ベクターあるいはプラスミドは、異種ＤＮＡの発現の
ためあるいはクローニングした異種ＤＮＡの複製のために、細胞に異種ＤＮＡを
導入するのに使用する単離した要素をさす。そのようなベクター及びプラスミド
の選択と使用は、十分に当該技術のレベルの範囲内である。

【００８１】 本文中で使用するとき、発現ベクターは、当該ＤＮＡ断片の発現をもたらすこ
とができる、プロモーター領域のような調節配列と機能的結合しているＤＮＡ断
片を発現することができるベクターを含む。従って、発現ベクターは、適切な宿
主細胞に導入したときクローニングしたＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、
ファージ、組換えウイルスあるいは他のベクターのような組換えＤＮＡ又はＲＮ
Ａ構築物をさす。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／あ
るいは原核細胞において複製可能なもの、ならびにエピソームにとどまるか又は
宿主細胞ゲノムに組み込まれうるものを含む。

【００８２】 本文中で使用するとき、プロモーター領域は、機能的に結合されているＤＮＡ
の転写を制御する、遺伝子のＤＮＡの部分をさす。プロモーター領域は、ＲＮＡ
ポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分なＤＮＡの特異的配列を含む。プ
ロモーター領域のこの部分をプロモーターと称する。さらに、プロモーター領域
は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含
む。これらの配列は、シス作用性あるいはトランス作用性因子に応答性であって
もよい。調節の性質に依存して、プロモーターは構成的であってもよく、あるい
は調節されてもよい。

【００８３】 本文中で使用するとき、組換えあるいは異種カルシウムチャネルは、組換えカ
ルシウムチャネルを発現する真核細胞に導入されて発現された異種ＤＮＡによっ
てコードされる１又はそれ以上のサブユニットを含むカルシウムチャネルをさす
。組換えカルシウムチャネルはまた、細胞に内因性のＤＮＡによって産生される
サブユニットも含みうる。一部の実施態様では、組換えあるいは異種カルシウム
チャネルは、異種ＤＮＡによってコードされるサブユニットだけを含みうる。

【００８４】 本文中で使用するとき、組換えあるいは異種カルシウムチャネルに関して「機
能性」であるとは、当該チャネルが、刺激及び／あるいは当該チャネルに親和性
のある結合リガンドに応答して、Ｃａ^２＋又はＢａ^２＋を含むがこれらに限定さ
れないカルシウムチャネル選択性イオンの流入を提供し、調節することができる
ことを意味する。好ましくは、そのようなカルシウムチャネル活性は、電気生理
学的、薬理学的及び当業者に既知の他の手段などによって、宿主細胞中に存在す
る内因性カルシウムチャネル活性と識別することができる。

【００８５】 本文中で使用するとき、Ｔ型チャネルあるいはＬＶＡ型チャネルは、典型的に
は、高電圧活性化（ＨＶＡ）チャネルと称されるカルシウムチャネル（α_１Ｄサ
ブユニットを含むもののような）と比較して、低電圧で活性化及び不活性化され
る低閾値カルシウムイオン流を示すカルシウムチャネルをさす。さらにあるいは
その代わりに、Ｔ型チャネルは、緩徐な失活速度、非常に低いコンダクタンス（
５−９ｐＳ）及び電圧依存性不活性化のような明白な生物物理的特性によって特
徴づけることもできる。Ｔチャネルは、ＨＶＡカルシウムチャネルと比較して、
ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）に対して
比較的高い度合の感受性、及び／あるいはＣｏｎｕｓマキガイ毒素ＧＶＩＡ及び
ＭＶＩＩＣならびにクモ毒素ＡｇａＩＩＩＡ及びＡｇａｌＶＡに対して比較的高
い度合の抵抗性を示す。これらのチャネルはまた、典型的にはカドミウムに対し
て低い親和性を示す。Ｔ型チャネルあるいはＬＶＡ型チャネルはまた、膜内外ド
メインＩとＩＩの間のように膜内外ドメインの間の１又はそれ以上の長い細胞内
ループ（例えば配列番号１２、１５及び１６参照）の存在により、核酸レベルで
特徴づけることもできる。

【００８６】 本文中で使用するとき、実際に個々の配列番号で示すようなアミノ酸配列を有
するポリペプチドは、同じ機能を持つが、保存的アミノ酸変化あるいはタンパク
質の活性を変化させない小さな欠失又は挿入のような配列の小さな変異を含みう
るタンパク質を包含する。カルシウムチャネル受容体サブユニットタンパク質、
特にＬＶＡあるいはＴ型チャネルの活性は、単独であるいは他のサブユニットと
共に機能性カルシウムチャネルを形成する能力をさす。Ｔ型チャネルは本文中で
定義する識別可能な特性を有する。

【００８７】 本文中で使用するとき、化合物の生理的濃度は、生物学的プロセスが起こるた
めに必要且つ十分な濃度である。例えば、カルシウムチャネル選択性イオンの生
理的濃度は、チャネルが開いたときに内向きイオン流を生じさせるために必要且
つ十分なカルシウムチャネル選択性イオンの濃度である。

【００８８】 本文中で使用するとき、カルシウムチャネルの活性とは、カルシウムチャネル
を通過するカルシウムチャネル選択性イオンの移動をさす。そのような活性は、
刺激に応答して組換えチャネルを通って流れるイオン流の量の測定を含むがこれ
に限定されない、当業者に既知のいずれかの方法によって測定しうる。

【００８９】 本文中で使用するとき、「機能性アッセイ」は、機能性カルシウムチャネルを
同定するアッセイをさす。従って機能性アッセイとは機能を評価するためのアッ
セイである。

【００９０】 当業者には理解されるように、拮抗物質や作用物質のようなカルシウムチャネ
ル活性を調節する化合物を同定するための検定方法は、一般に対照との比較を必
要とする。「対照」細胞あるいは「対照」培養物のひとつの種類は、対照培養物
が試験化合物に接触しないことを除いて、試験化合物に接触する細胞あるいは培
養物と実質的に同じように処理される細胞あるいは培養物である。もうひとつの
種類の「対照」細胞あるいは「対照」培養物は、対照培養に用いる細胞が機能性
カルシウムチャネルを発現しないことを除いて、トランスフェクションされた細
胞と同じ細胞あるいは細胞培養物であると考えられる。この状況では、細胞ある
いは各々の種類の細胞培養物を検定する化合物の存在下で実質的に同じ反応条件
に接触させたとき、試験化合物に対する被験細胞の応答を試験化合物に対するカ
ルシウムチャネル陰性細胞の応答（あるいは応答の欠如）と比較する。例えば、
電気生理学的なパッチクランプを用いる方法では、当該技術で知られているよう
に、細胞を浸す外部溶液を変えることによって同じ細胞を試験化合物の存在下と
不在下で試験することができる。

【００９１】 また本文中で開示される各々のサブユニットは、保存的アミノ酸置換を行うこ
とによって改変できることは明白であり、生じる改変サブユニットは本文中で想
定されている。適当なアミノ酸の保存的置換は当業者には既知であり、一般に生
じる分子の生物活性を変化させずに実施しうる。当業者は、一般に、ポリペプチ
ドの可欠領域における１個のアミノ酸置換は実質的に生物活性を変化させないこ
とを認識している（例えばＷａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／
Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃ．，ｐ．２２４参照）。そのような置換は好まし
くは、排他的ではないが、次のような表１に示すものに従って行われる：

【００９２】

【表１】 他の置換も許容され、経験的にあるいは既知の保存的置換に従って決定されう
る。そのようなポリペプチドの改変は、当業者に既知のいずれかの手段によって
実施されうる。突然変異は、当該タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的あ
るいは位置指定突然変異誘発、ならびにプライマーを用いてＤＮＡ鋳型に変化を
導入し、増幅するＤＮＡ増幅法の使用を含めて、当業者に既知のいずれかの方法
によって実施しうる。

【００９３】 本文中で使用するとき、治療とは、状態、障害あるいは疾患の症状を改善する
、あるいはさもなければ有益に変化させる方法を意味する。治療はまた、避妊薬
の使用のような本文中の組成物の製薬学的使用も包含する。

【００９４】 本文中で使用するとき、ＬＶＡ活性化カルシウムチャネル媒介の疾患とは、Ｌ
ＶＡチャネルの活性に関連する疾患をさす。Ｔ型カルシウムチャネル媒介の疾患
とは、Ｔ型チャネルに関連する、ＬＶＡ活性化チャネル媒介の疾患をさす。その
ような疾患は次のものを含むがこれらに限定されない：ＬＶＡチャネル、特にＴ
型チャネルが、疾患に寄与する何らかの形で疾患の媒介に役割を果たす、心臓血
管、肝、内分泌、泌尿器、生殖器、筋、神経及びその他の疾患。

【００９５】 本文中で使用するとき、特定製薬組成物の投与による特定疾患の症状の改善は
、組成物の投与に帰する又は投与に結びつけることができる、永続的又は一時的
な、持続性又は一過性の何らかの軽減をさす。

【００９６】 本文中で使用するとき、実質的に純粋とは、当業者が純度を評価するために使
用する、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動及び高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）のような標準的分析方法によって測定される、容易に
検出可能な不純物を含まないと思われるほど十分に均質であること、あるいはさ
らに精製を行っても物質の酵素及び生物活性のような物理・化学特性が検出可能
に変化しないであろうほど十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に
純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法は当業者に既知である。しかし
、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体の混合物である場合もある。その
ような場合には、さらなる精製は化合物の比活性を高めると考えられる。 本文
中で使用するとき、生物活性とは、化合物、組成物あるいは他の混合物をインビ
ボで投与したときに生じる、化合物のインビボでの活性あるいは生理的応答をさ
す。従って生物活性は、そのような化合物、組成物及び混合物の治療効果及び製
薬学的活性を包含する。

【００９７】 ヒトカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定と単離 α_１、α_２、β及びγをコードする核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、特にヒトカル
シウムチャネルのＬＶＡα_１サブユニットをコードする核酸を同定し、単離する
ための方法を提供する。

【００９８】 そのような核酸の同定と単離は、少なくとも低ストリンジェンシー、好ましく
は高ストリンジェンシーの適切な条件下で、少なくとも１４、好ましくは１６又
はそれ以上のヌクレオチド（２５、３０又はそれより長い）を持ち、配列番号に
よって本文中に示すヌクレオチドの配列を有するＤＮＡの隣接部分から誘導した
標識プローブを持つ、制限酵素で消化したヒトＤＮＡにハイブリッド形成するこ
とによって実現しうる。ひとたびハイブリダイゼーション反応においてハイブリ
ッド形成した断片が同定されれば、当業者に既知の標準クローニング手法を用い
てクローン化することができる。完全なオープンリーディングフレームが存在し
、本文中で提供するサブユニットとの配列比較によってコードタンパク質の同一
性が確認されれば、カルシウムチャネル形成能力あるいは他の機能を評価する機
能性アッセイによって完全長のクローンが同定できる。この方法を使用して、ゲ
ノムサブユニットＤＮＡの転写一次産物の代替的スプライシングによって生じる
ヒトカルシウムチャネルサブユニットのスプライシング変異体をコードするサブ
ユニットあるいはｃＤＮＡをコードするゲノムＤＮＡを同定することができる。
例えば、カルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡあるい
はゲノムＤＮＡは、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって同定し
、制限酵素地図やＤＮＡ塩基配列決定のような当業者に既知の方法によって特徴
づけて、ＤＮＡの配列の異質性あるいは相違を同定するために本文中で提供する
ＤＮＡと比較することができる。そのような配列の相違は、非相同領域と相同領
域が集塊していれば、ｃＤＮＡを作製した転写産物が転写一次産物の代替的スプ
ライシングから生じたものであること、あるいは非相同領域がクローン化したＤ
ＮＡ全体に分布していれば異なる遺伝子から生じたものであることを示唆すると
考えられる。スプライシング変異体は１００％相同な領域を共有する。本文中で
述べたように、生じた核酸を細胞において発現し、生じた細胞を試験して、発現
されたカルシウムチャネルがＬＶＡあるいはＴチャネルの薬理学的及び／あるい
は電気生理学的特性を示すことを証明あるいは確認することができる。

【００９９】 本文中で提供するＤＮＡを用いて遺伝子を単離するいかなる適当な方法も使用
しうる。例えば、配列相違領域に対応するオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイ
ゼーションによって完全長のスプライシング変異体をコードするＤＮＡを単離す
るのに使用されており、これはゲノムクローンを単離するためにも使用できる。
組織特異的エクソンのようなヒトカルシウムチャネルサブユニットの少なくとも
一部をコードする、本文中で開示するヌクレオチド配列に基づくプローブは、関
連ＤＮＡをクローン化するため、あるいはヒトカルシウムチャネルサブユニット
をコードする完全長のｃＤＮＡクローンあるいはゲノムクローンを得るためのプ
ローブとして使用できる。

【０１００】 ヒトカルシウムチャネルサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸の少
なくとも１４の実質的に隣接する塩基、好ましくは１６又はそれ以上、一般には
少なくとも３０の隣接塩基から成り、核酸の配列が配列番号で参照して本文中で
開示する核酸配列のセグメントに対応する、放射性同位元素標識あるいは酵素標
識を含むがこれらに限定されない標識ＲＮＡあるいは一本鎖ＤＮＡを提供する。
そのような核酸セグメントは、カルシウムチャネルサブユニットをコードするＤ
ＮＡをクローニングするための本文中で提供する方法においてプローブとして使
用できる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照。

【０１０１】 さらに、当業者には周知である核酸増幅手法が、相違配列の周囲のＤＮＡ配列
に基づくオリゴヌクレオチドをヒトＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを増幅するため
のプライマーとして用いることにより、カルシウムチャネルサブユニットのスプ
ライシング変異体を検出するために使用できる。増幅産物の大きさと配列決定に
よってスプライシング変異体を明らかにすることができる。さらに、ハイブリダ
イゼーションによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離は、ヒトカルシウムチャネルサ
ブユニットをコードする転写産物の様々なスプライシング変異体に対応する、イ
ントロンによって分離された多数のエクソンを含むＤＮＡを生成することができ
る。

【０１０２】 電圧依存性ヒトカルシウムチャネルのα_１、α_２、β及びγサブユニットの各
々のタイプ及びサブタイプをコードするＤＮＡは、選択組織からのｃＤＮＡの核
酸増幅によって、あるいはそのようなカルシウムチャネルを有するヒト由来の細
胞系あるいは組織から単離したポリＡ＋ｍＲＮＡから作製したヒトｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることによってクローン化された。ｍＲＮＡを得る
ためのそのような細胞あるいは組織のソースは、特にヒト脳組織あるいは神経芽
細胞腫細胞系のような神経由来のヒト細胞系、ヒト骨格筋あるいは平滑筋細胞等
である。ｃＤＮＡライブラリーを作製する方法は当該技術において周知である（
一般にＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＤａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。

【０１０３】 プローブを構築するための好ましい領域は、５’及び／あるいは３’コード配
列、膜内外ドメインをコードすると予想される配列、細胞質ループをコードする
と予想される配列、シグナル配列、リガンド結合部位、及び他の機能的に重要な
配列（例えば、下記の表参照）を含む。完全長のサブユニットをコードするＤＮ
Ａあるいはその断片は、好ましくは検出を容易にするために適当な標識手段で標
識されたプローブとして使用できる。断片をプローブとして使用するとき、好ま
しくはＤＮＡ配列は、典型的には当該ＤＮＡのカルボキシル末端をコードする部
分からのものであり、最も好ましくは推定アミノ酸配列のヒドロパシー分析に基
づいて予想される膜内外ドメインコード部分を含む（例えばＫｙｔｅとＤｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７：１０５参照）。

【０１０４】 ヒトカルシウムチャネルサブユニットのタイプあるいはサブタイプに特異的な
リボプローブを作製した。これらのプローブは選択組織及び細胞における特定サ
ブユニットの発現を同定するのに有用である。プローブを作製した領域は、既知
のすべてのα又はβサブユニットサブタイプのＤＮＡとアミノ酸配列を比較して
同定した。最も相同性の低い領域、好ましくはヒト由来の配列と一般に約２５０
から約６００個のヌクレオチドを選択した。α及びβサブユニットについての数
多くのリボプローブが作製されており（例えば国際ＰＣＴ特許願第ＷＯ９５／０
４８２２号の表２参照）、その一部を下記の表に示す。

【０１０５】

【表２】 α_１Ｈ特異的プローブ（そして同様に抗体）に関しては、これらのチャネルに
存在する長い細胞内ループのようなα_１Ｈサブユニットにユニークな領域が使用
できる。α_１Ｈ−１特異的抗体に関しては、α_１Ｈ−１には存在してα_１Ｈ−２ には存在しない領域がサブユニット特異的プローブの作製に有用と考えられる。

【０１０６】 従って本文中で提供するＤＮＡクローン及びその断片は、各サブユニットをコ
ードするゲノムクローンを単離するため、ならびに種々のヒト組織から作製した
ライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによってスプライシング
変異体を単離するために使用できる。当業者に周知の核酸増幅手法も、ヒトカル
シウムチャネルサブユニットのスプライシング変異体をコードするＤＮＡを検出
するために使用できる。これは、相違配列の周囲のＤＮＡ配列に基づくオリゴヌ
クレオチドをヒトＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとし
て用いることによって実現される。増幅産物の大きさと配列決定によってスプラ
イシング変異体の存在を明らかにすることができる。さらに、ハイブリダイゼー
ションによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離は、ヒトカルシウムチャネルサブユニ
ットをコードする転写産物の様々なスプライシング変異体に対応する、イントロ
ンによって単離された多数のエクソンを含むＤＮＡを生成することができる。

【０１０７】 カルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡが単離された後は、リボ
ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）保護アッセイを使用して、特定のカルシウムチャネ
ルサブユニット又は変異体をコードするｍＲＮＡを発現する組織を決定すること
が可能である。これらのアッセイは、全細胞ＲＮＡの複雑な混合物の中のＲＮＡ
種を検出し定量するための高感度の手段を提供する。サブユニットＤＮＡを標識
し、細胞ＲＮＡとハイブリッド形成させる。相補的ｍＲＮＡが細胞ＲＮＡの中に
存在する場合には、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが生じる。次に、ＲＮＡ試料を
、一本鎖ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅで処理する。すべてのＲＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッドがＲＮａｓｅ分解から保護され、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフ
ィーにより可視化されうる。インサイチューハイブリダイゼーション技術を用い
て、特定のカルシウムチャネルサブユニットをコードするｍＲＮＡを発現する組
織を決定することも可能である。標識されたサブユニットコーディングＤＮＡク
ローンを異なる組織切片にハイブリッド形成させ、サブユニットｍＲＮＡ発現を
可視化する。

【０１０８】 ヒトカルシウムチャネルの各サブユニット（α_１、α_２、β、又はγ）のそれ
ぞれに関して、チャネルサブユニットをコードするＤＮＡを、核酸スクリーニン
グ法により同定した後、オーバーラップクローンを同定するためのさらなるスク
リーニングに、単離されたクローンを用いた。クローニングされたＤＮＡ断片の
いくつかを、ｐＩＢＩ２４／２５（ＩＢＩ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴ）、Ｍ１３
ｍｐ１８／１９、ｐＧＥＭ４、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ７Ｚ、ｐＳＰ７２、及びそ
の他の当業者に既知のそのようなベクターのような適当なベクターにサブクロー
ニングし、ＤＮＡ配列決定及び制限酵素マッピングにより特徴付けすることが可
能であり、そしてそれが行われた。このように、翻訳開始（スタート）コドン及
び翻訳終止（ストップ）コドンの同定を含む当業者に既知の方法により、全長ク
ローンが調製されるまで、連続する一連のオーバーラップクローンを各サブユニ
ットについて作製することができる。クローニングされたＤＮＡの発現のため、
そのようなクローンの５’非コーディング領域及びその他の転写翻訳調節領域を
、効率のよいリボソーム結合部位及び当技術分野において既知のその他の制御領
域と交換することができる。翻訳及び／又は転写の効率を最適化するために必要
となりうる、当業者に既知のその他の５’末端の修飾も、必要に応じて行うこと
ができる。

【０１０９】 下記の実施例１〜３は、α_１Ｈスプライス変異体をコードするクローニングＤ
ＮＡ、並びにその電気生理学的及び薬理学的特性を詳細に記載している。注記さ
れた場合を除き、発現の方法及びその他のデータは、α_１Ｈ−１コーディング核
酸に関して記載されている。例示された方法が、ヒト及びその他の哺乳動物から
さらなるスプライス変異体及び関連したサブユニットを単離するために用いられ
うること、そしてＬＶＡ活性化チャネル、特にＴ型チャネルの活性を調節する化
合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いるための細胞を作製
するため、そのような核酸を発現させるためにも用いられうることが理解される
。核酸は、変異を同定するための診断アッセイにおいても用いられることができ
、タンパク質を作製するため、そして次にＴ型カルシウムチャネル活性に関連し
た障害の診断アッセイにおける試薬として用いるための抗体を作製するためにも
用いられうる。

【０１１０】 ＬＶＡチャネルのα_１サブユニット ＬＶＡチャネルを形成するα_１サブユニットをコードする核酸が、本明細書に
おいて提供される。本明細書において提供される核酸は、その他の組織並びにそ
の他の哺乳動物及び動物から、関連するチャネルを単離するためにも用いられう
る。

【０１１１】 α_１ＨヒトカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単
離 α_１Ｈを含むカルシウムチャネルは、α_１Ａ〜α_１Ｅカルシウムチャネルサブ
ユニットから形成される既知のＨＶＡチャネルとは異なる特性を示すはずである
。そのような差異には、低電位活性化、電位依存性不活性化、ミベフラジル（ｍ
ｉｂｅｆｒａｄｉｌ）に対する比較的高い感受性、並びにほとんどのＨＶＡチャ
ネルを阻害するヘビ及び蜘形類の毒素（ｓｐｉｄｅｒ ｖｅｎｏｍ ｔｏｘｉｎ
ｓ）（例えば、ヘビ毒ω−ＡｇａｌＩＩＡ及びω−ＡｇａｌＶＡ及びコーヌスヘ
ビ毒（Ｃｏｎｕｓ ｓｎａｉｌ ｔｏｘｉｎ）ＧＶＩＡ）に対する比較的高い抵
抗性が含まれうる。さらに、α_１Ｈ−サブユニットは、その他のα_１−サブユニ
ットとの相同性により、そしてさらに、膜貫通ドメインＩとＩＩとの間に位置す
るコードされたサブユニット内に拡張された細胞内ループ（例えば、配列番号４
９、ヌクレオチド１５０６〜２６２７を参照）が存在することにより、同定され
うる。α_１Ｈ内のこの領域は、α_１Ａ〜α_１Ｅのようなその他のカルシウムチャ
ネルα_１サブユニットと比較して拡張されている。

【０１１２】 α_１Ｈ−サブユニットをコードするＤＮＡは、本明細書において提供されるＤ
ＮＡを用いて単離されうる。特に、少なくとも約１６ヌクレオチド又は３０ヌク
レオチド又はその他の適当な長さ、例えば１４塩基、３０塩基、１００塩基など
のプローブを用いて、哺乳動物ＤＮＡライブラリーを含む選択されたライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。選択されたライブラリーは、好ましくは
、Ｔ型チャネルを発現することが既知の哺乳動物組織又は細胞起源から調製され
る。プローブの配列は、好ましくは、膜貫通ドメインＩとＩＩとの間に位置する
細胞内ループの配列に基づく（例えば、配列番号１２及び１５を参照）。

【０１１３】 α_１ＨサブユニットをコードするＤＮＡは、縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、ヒト甲状腺癌細胞系（ＴＴ細胞）において発現されたα_１サブユニ
ットをコードする遺伝子の領域を増幅することにより単離された。ＴＴ細胞系は
、ヒト髄様甲状腺癌に由来し、カルシトニン分泌及び遺伝子発現を研究するため
に用いられている（ｄｅＢｕｓｔｒｏｓら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６１：８０３６−８０４１；ｄｅＢｕｓｔｒｏｓら１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１７７３−１７７８）。これらの細胞からの全細胞記録
（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ）により、これらの細胞により
発現される電位ゲーティッドカルシウムチャネルのみが、Ｔ型チャネルと一致す
る生物物理学的特性である、低電位活性化、急速な不活性化、遅い脱活性化を受
けることが明らかとなった。

【０１１４】 陽性クローンのうちの一つの一部を用いて、ヒトα_１Ｈサブユニットをコード
するヌクレオチド配列の全長にわたるオーバーラップクローンを同定するため、
ヒト甲状腺癌ｃＤＮＡライブラリーをさらにスクリーニングした。全長α_１ＨＤ
ＮＡクローンは、実施例１に記載の部分的ｃＤＮＡクローンの一部の連結により
構築されうる。配列番号１５は、α_１Ｈ−１サブユニットをコードするクローン
のヌクレオチド配列、及び推定アミノ酸配列を示している。

【０１１５】 ２つのスプライス変異体α_１Ｈ−１及びα_１Ｈ−２は、複数の組織由来のＲＮ
Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素増幅）により検出された。α_１Ｈ−２アイ
ソフォーム（配列番号１６）は、Ｉ−ＩＩ細胞内ループ（例えば、配列番号１２
のｎｔ１５０６からｎｔ２６２７まで）内に、α_１Ｈ−１（配列番号１２及び１
５）と比較して９５７ヌクレオチドの欠失を含む。

【０１１６】 α_１Ｈ−１サブユニットは、以前にクローニングされたα_１サブユニットとあ
る構造的類似性を示すのみならず、顕著な配列の差異を示す。特に、α_１Ｈ−１ の推定アミノ酸配列の、高電位活性化カルシウムチャネルをコードするヒトα_{１ Ａ} 〜α_１Ｅコーディング核酸との全体配列同一性は、３０％未満である。ノーザ
ンブロット解析は、α_１ＨのｍＲＮＡ転写物が、脳、主に扁桃、尾状核、及び被
殻において、そして末梢組織、主に肝臓、腎臓、及び心臓において発現している
ことを示している。

【０１１７】 特に、このα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの核酸配列及び推定アミノ
酸配列の、その他のヒトα_１サブユニットとの比較により、いくつかの異なる特
徴が明らかとなる。α_１Ｈ配列とＨＶＡα_１配列との間には著しい差異が存在す
る。第一に、膜貫通ドメインＩとＩＩとの間の細胞内ループが著しく長い。配列
番号４９に例示されているように、ヒトα_１Ｈサブユニットの細胞内ループは、
１，１２２ｎｔ長であるが、本明細書に記載されたその他のヒトα_１サブユニッ
トの対応する細胞内ループは、３５１ｎｔ長から３８１ｎｔ長の範囲である。こ
のように、ヒトα_１Ｈの細胞内ループは、ＨＶＡカルシウムチャネルに見出され
るヒトα_１サブユニットよりも２５０アミノ酸近く長い。この領域の推定アミノ
酸配列（配列番号１２のａａ４２０からａａ７９４まで）は、多数のプロリン残
基を含み、かつ９個の連続ヒスチジン残基からなるポリＨＩＳ領域（配列番号１
２のａａ５２からａａ５２８まで）、及び１０残基のうちの８残基がアラニンで
ある領域を含む。膜貫通ドメインＩとＩＩとの間に位置する大きな細胞内ループ
は、ナトリウムチャネルαサブユニット内の対応する位置に見出される大きな細
胞内ループと類似している。ナトリウムチャネルαサブユニットのいくつかは、
ホモマー（ｈｏｍｏｍｅｒ）として機能する可能性がある。Ｔ型チャネルは、Ｈ
ＶＡカルシウムチャネルとナトリウムチャネルとのハイブリッドである活性を有
することが提唱されている。本明細書に提供されたα_１Ｈサブユニットは、ナト
リウムチャネルとしても機能する可能性がある。

【０１１８】 第二に、単離されたヒトα_１Ｈサブユニットは、α_１サブユニットとβサブユ
ニットとの相互作用にとって重要であることが一般的に知られている（例えば、
Ｄｅ Ｗａａｒｄら（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８０：２７２−
２７６；Ｐｒａｇｎｅｌｌら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６７−７０を
参照）アミノ酸残基を欠如している。本明細書に記載されたα_１Ａ〜α_１Ｅのよ
うなα_１間で高度に保存されているモチーフを形成する少なくとも１３個の残基
が、膜貫通ドメインＩとＩＩとの間のこの細胞内ループ内に位置する（Ｐｒａｇ
ｎｅｌｌら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６７−７０も参照）。特に、こ
のループは、βサブユニットとの結合に関与しているα_１相互作用ドメイン（Ａ
ＩＤ）を欠如している。また、この領域には、アデニリルシクラーゼ２において
最初に同定され、非Ｌ型ＨＶＡα_１サブユニットに見出されるＧβγ結合モチー
フ、ＧｌｎＸＸＧｌｕＡｒｇも存在しない。しかし、同一の配列が、α_１Ｈ配列
のＩＩ−ＩＩＩ細胞内ループ内に出現しており、このことは、この領域でＧβγ
の相互作用が可能であることを示唆している。α_１Ｈサブユニットは、ＨＶＡチ
ャネルのＳ５−Ｓ６リンカーに見出されるイオン選択性の決定基にも差異を含む
。ドメインＩＩＩ及びＩＶのＳ５−Ｓ６ポアループ（ｐｏｒｅ ｌｏｏｐ）にお
いて、Ｃａ^２＋選択性及びイオン透過性において重要な役割を果たすグルタミン
酸残基が、アスパラギン酸残基に置換されている。

【０１１９】 第三に、ヒトα_１Ｈサブユニットは、ＩＳ５とＩＳ６との間に位置するドメイ
ンＩ内に、もう一つの著しく長い細胞外ループを有する。この細胞外ループは、
他のヒトα_１サブユニットにおいては２４９から２７０ヌクレオチド残基の範囲
であるが、ヒトα_１Ｈサブユニットは４２６ヌクレオチド残基を有する。その他
の際立って特徴的な特徴は、本明細書に記載された細胞においてサブユニットを
発現させることにより確認することができ、そして確認されている。

【０１２０】 α_１Ｈサブユニットをコードする核酸は、適当なライブラリー、特に哺乳動物
ライブラリー、特にＴ型チャネル活性を示す組織又は細胞由来の哺乳動物ライブ
ラリーをスクリーニングするために用いられうる。コードされたサブユニットは
、前記の際立って特徴的な特性により同定されうる。α_１Ｈ−１コーディングク
ローン由来の核酸プローブが、α_１Ｈ−１と比較して９５７ｂｐ欠失を有する、
α_１Ｈ−２と命名された第二の変異体をコードするクローンを同定し単離するた
めに用いられた。

【０１２１】 α_１Ｈサブユニットは、外因性α_２δサブユニット及びβサブユニットを添加
しない２つの異なる発現系において、機能的なチャネルを形成する。α_１Ｈ配列
のＩ−ＩＩループ内にβサブユニット相互作用部位が存在しないことは、下神経
節（ｎｏｄｏｓｕｓ ｇａｎｇｌｉａ）におけるアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドによるβサブユニット枯渇が、この領域におけるＴ型イオン流に影響を与えな
かったという報告と一致している。さらに、ＨＥＫ２９３細胞には、βサブユニ
ット特異的抗血清を用いたウェスタン解析により、既知のβサブユニットが全く
検出されず、このことは、以前にクローニングされたβサブユニットが、α_１Ｈ
を含むＬＶＡ Ｃａ^２＋チャネルの形成において役割を果たしていない可能性を
示している。卵母細胞及びＨＥＫ２９３細胞は、内因性α_２δサブユニットを発
現しており、本明細書に記載されたα_１Ｈサブユニットの起源であるＴＴ細胞は
比較的多量のα_２δサブユニットを発現している。従って、発現したα_１Ｈ含有
チャネルはα_２δサブユニットを含み、α_２δサブユニットは天然α_１Ｈ含有チ
ャネルの成分である可能性がある。

【０１２２】 α_１Ｈ転写物の分布 いくつかのニューロン組織及び非ニューロン組織に由来するヒトｍＲＮＡを含
むノーザンブロットを、全長α_１ＨｃＤＮＡから作製された標識された断片をプ
ローブとして検索した。約８．５ｋｂの単一の転写物が、心臓、脳、胎盤、肺、
肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓を含む、調査された全ての組織に存在する。ニューロ
ン組織には、小脳、大脳皮質、髄質、脊髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、扁
桃、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床下核、及び視床が含まれた。非ニューロン
組織においては、腎臓、肝臓、及び心臓において最も高い発現レベルが見出され
る。脳においては、扁桃、尾状核、及び被殻に最も豊富である。

【０１２３】 その他のα_１ヒトカルシウムチャネルサブユニットのタイプ及びサブタイプを
コードするＤＮＡの同定及び単離 さらなるα_１サブユニットをコードするＤＮＡは、α_１Ａ、α_１Ｂ、α_１Ｃ、
α_１Ｄ、α_１Ｅ、及びα_１Ｈサブユニットに関する記載と同様にして本明細書に
提供されたＤＮＡを用いて、又は当業者に既知のその他の方法を用いて、単離及
び同定されうる。特に、本明細書に提供されたＤＮＡを用いて、適当なライブラ
リーをスクリーニングし、関連するＤＮＡを単離することが可能である。全長ク
ローンを、本明細書に記載された方法のような方法を用いて構築することができ
、得られたサブユニットは、その配列並びに電気生理学的及び薬理学的特性を本
明細書に例示されたサブユニットと比較することにより特徴付けされうる。

【０１２４】 ＣＮＳ及びその他の組織において発現している多数の電位依存性カルシウムチ
ャネルα_１サブユニット遺伝子が同定され、α_１Ａ、α_１Ｂ（又はＶＤＣＣ Ｉ
Ｖ）、α_１Ｃ（又はＶＤＣＣ ＩＩ）、α_１Ｄ（又はＶＤＣＣ ＩＩＩ）、α_{１ Ｅ} 、及びα_１Ｈと命名されている。各サブユニットタイプをコードするヒトＤＮ
Ａライブラリーから単離されたＤＮＡが単離されている。スプライス変異体とし
て生じる、各タイプのサブタイプをコードするＤＮＡも提供される。サブタイプ
は、本明細書において、例えばα_１Ｂ−１、α_１Ｂ−２と命名されている。本明
細書においては、α_１Ｈサブユニットに特に注目する。

【０１２５】 電位依存性カルシウムチャネルのα_１サブユニットタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、及びＦ、並びにそれらのサブタイプは、ＤＨＰ、フェニルアルキルアミン、オ
メガコノトキシン（ω−ＣｇＴｘ）、ジョウゴクモ毒素（ｆｕｎｎｅｌ ｗｅｂ
ｓｐｉｄｅｒ ｔｏｘｉｎ）ω−Ａｇａ−ＩＶ、ピラゾノイルグアニジンのよ
うなカルシウムチャネルのアゴニスト及びアンタゴニストの既知のクラスと、感
受性に関して、及び又はその他の物理学的及び構造的特性に関して異なっている
。これらのサブユニットタイプは、ホールディング電位（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏ
ｔｅｎｔｉａｌ）、及び異なるα_１サブユニットタイプを含むカルシウムチャネ
ルを含む細胞膜の脱分極時に生じるイオン流の動力学に関しても異なっているよ
うである。

【０１２６】 ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ω−ＣｇＴｘ、ジョウゴクモ毒
素の成分、及びピラゾノイルグアニジンから選択される少なくとも一つの化合物
に結合するα_１サブユニットをコードするＤＮＡが提供される。例えば、本明細
書において提供されるα_１Ｂサブユニットは、Ｎ型チャネルにおいてω−ＣｇＴ
ｘと特異的に相互作用するようであり、本明細書において提供されるα_１Ｄサブ
ユニットは、Ｌ型チャネルにおいてＤＨＰと特異的に相互作用するようである。

【０１２７】 抗体 カルシウムチャネルサブユニットサブタイプ又はカルシウムチャネルタイプに
対して特異的なモノクローナル又はポリクローナルの抗体は、サブユニットタン
パク質又はそれらの一部を抗原として用いる、当業者に既知の標準的な技術を使
用して調製されうる。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体が用いられうる
（例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら（１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
．Ｓｃｉ．１２：３３８−３４３；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照）。免
疫原として（合成ペプチド又は組み換え作製された細菌融合タンパク質のいずれ
かとして）用いるためのカルシウムチャネルサブユニットの部分を選択する際に
考慮すべき要因には、抗原性接近可能性（即ち、細胞外ドメイン及び細胞質ドメ
イン）、特定のサブユニットに対する独自性、及び当業者に既知のその他の要因
が含まれる。抗体は、治療的用途を有し、そして診断アッセイにおける用途も有
する。

【０１２８】 サブユニット特異的抗体の利用可能性は、（例えば、正常脳組織と疾患のある
脳組織とを比較して）様々なサブユニットの分布及び発現密度をモニターするた
めの免疫組織化学技術の適用を可能にする。そのような抗体は、ＬＥＳ診断のよ
うな診断的適用において、そして例えばカルシウムチャネルの活性を調節する抗
体を用いる治療的適用においても使用されうる。

【０１２９】 抗体は、例えば腹腔内注射、筋肉内注射、静脈注射、もしくは皮下注射、埋め
込み、又は経皮投与様式による、標準的な方法を使用して対象に投与されうる。
当業者であれば、使用される投与様式に応じて、用量形態、治療計画、及びその
他のパラメータを経験的に決定することができる。

【０１３０】 サブユニット特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清が調製さ
れている。抗原が由来する領域は、全ての既知のα又はβサブユニットサブタイ
プのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を比較することにより同定された。最も相同性
が低い領域、好ましくはヒト由来の配列が選択された。選択された領域又は選択
された領域を含む融合タンパク質が免疫原として用いられる。選択されたタンパ
ク質領域及び融合タンパク質における残基の疎水性解析も行われ、疎水性の高い
領域は回避される。また、より重要なこととして、細菌宿主において融合タンパ
ク質を調製する場合には、低頻度のコドンは回避される。特に、選択された宿主
において３個又はそれ以上の連続する低頻度コドンを含めることは回避される。
α又はβサブユニットのタイプ又はサブタイプに特異的な多数のポリクローナル
及びモノクローナルの抗体が調製されている。これらのうちのいくつかを以下の
表に列挙する。例示的な抗体、及び抗体を調製するために用いられたペプチド抗
原を表３に示す。

【０１３１】

【表３】 ＧＳＴ融合タンパク質は、それぞれ、類似の融合体及び抗血清を調製すること
ができる、α_１Ｃ及びα_１Ｄを含む全てのサブタイプについてサブタイプ相同性
の低い領域である、細胞質ループ領域ＩＩＳ６−ＩＩＳ１に対して特異的である
。

【０１３２】 類似の方法を用いて、例えば拡張された細胞内ループを用いて、ＬＶＡサブユ
ニット、特に本明細書において提供されるα_１Ｈサブユニットに特異的な抗体が
調製されうる。そのような抗体は、ＬＶＡカルシウムチャネルが関与する障害の
診断アッセイにおける用途を有する。

【０１３３】 異種カルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを含む組換え真核細
胞の調製 一つ又は複数のカルシウムチャネルサブユニット又はカルシウムチャネルサブ
ユニットの一部をコードするＤＮＡは、ＤＮＡの発現又は複製のため宿主細胞に
導入されうる。そのようなＤＮＡは、下記の実施例に記載された方法を用いて、
又は当業者に周知のその他の過程を用いて導入されうる。クローニングされたＤ
ＮＡの適当な発現ベクターへの取り込み、それぞれが一つもしくは複数の異なる
遺伝子をコードするプラスミドベクターもしくはプラスミドベクターの組み合わ
せによる、又は直鎖状ＤＮＡによる真核細胞の形質転換、並びに形質転換された
細胞の選択も、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。

【０１３４】 カルシウムチャネルのサブユニットのいずれかをコードするクローニングされ
た全長核酸は、真核細胞における発現のため、プラスミドベクターに導入されう
る。そのような核酸は、ゲノミックＤＮＡ、又はｃＤＮＡ、又はＲＮＡでありう
る。現在のところ好ましい細胞は、α_１Ｈサブユニットをコードする異種ＤＮＡ
を含む細胞である。宿主細胞は、それぞれが少なくとも一つのカルシウムチャネ
ルサブユニットをコードするプラスミド又はプラスミドの組み合わせにより形質
転換されうる。又は、宿主細胞は、当業者に周知の方法を用いて、直鎖状ＤＮＡ
により形質転換されてもよい。

【０１３５】 本明細書に提供されたＤＮＡは、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）（
例えば、Ｃｒｅｇｇら，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：４７
９）のような酵母細胞を含む、任意の真核細胞において発現されうるが、本明細
書に提供されたヒトカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡの発現
のためには哺乳動物発現系が好ましい。

【０１３６】 異種ＤＮＡは、異種ＤＮＡをコードするベクターによる形質転換のような、当
業者に既知の任意の方法により導入されうる。哺乳動物細胞の形質転換にとって
特に好ましいベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスｄｈｆｒ遺伝子、
ＳＶ４０ポリアデニル化部位及びスプライス部位、並びに細菌においてベクター
を維持するために必要な配列を含む、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ発現ベクター、ｐＣＤＮ
Ａ１のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに基づくベクター、
又はｐｃＤＮＡ−ａｍｐ及びＭＭＴＶプロモーターに基づくベクターである。ベ
クターｐｃＤＮＡ１は、哺乳動物宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより認識さ
れる構成性のプロモーターであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター
を含む真核発現ベクターである。ヒトカルシウムチャネルサブユニットをコード
するＤＮＡは、ベクターｐＣＤＮＡ１のＣＭＶプロモーターの直後の位置に挿入
されている。ベクターｐＣＤＮＡ１が、現在のところ好ましく、哺乳動物細胞に
おいてα_１Ｈサブユニットを発現させるために用いられている。

【０１３７】 安定的又は一過性に形質転換された哺乳動物細胞は、チミジンキナーゼ、ジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ、ネオマイシン耐性などの遺伝子のような選択可能なマー
カー遺伝子を有する発現ベクターにより細胞を形質転換すること、そして一過性
形質転換の場合には、マーカー遺伝子を発現する細胞にとって選択的な条件下で
形質転換された細胞を増殖させることにより、当技術分野で既知の方法により調
製されうる。機能的な電位依存性カルシウムチャネルは、ヒトカルシウムチャネ
ルサブユニットをコードするＤＮＡを含むベクターｐＣＤＮＡ１の誘導体により
形質転換されたＨＥＫ２９３細胞において作製されている。

【０１３８】 異種ＤＮＡは、細胞内でエピソーム因子として維持されるか、又は細胞の染色
体ＤＮＡへと組み込まれうる。得られた組換え細胞は、次に、そのような培養物
又はそれらの継代培養物から培養又は継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ）され
うる（又は、哺乳動物細胞の場合には継代（ｐａｓｓａｇｅｄ）されうる）。組
換え細胞の形質転換、注入、及び培養のための方法は熟練した当業者に既知であ
る。ＤＮＡ又はＲＮＡが導入されうる真核細胞には、そのようなＤＮＡ又はＲＮ
Ａにより形質転換可能であるか、又はそのようなＤＮＡが注入されうる任意の細
胞が含まれる。事実上任意の真核細胞が、異種ＤＮＡのための媒体として機能し
うる。好ましい細胞は、ＤＮＡ及びＲＮＡを発現することもできる細胞であり、
最も好ましい細胞は、異種ＤＮＡによりコードされる一つ又は複数のサブユニッ
トを含む組換え又は異種カルシウムチャネルを形成することができる細胞である
。そのような細胞は、経験的に同定されうるか、又は容易に形質転換又は注入さ
れることが既知の細胞の中から選択されうる。ＤＮＡを導入するための好ましい
細胞には、一過性又は安定的に形質転換されうる細胞が含まれ、ＣＯＳ細胞、マ
ウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト胎児腎細胞、アフリカングリーンモンキー（Ａｆ
ｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）細胞、及びその他の当業者に既知の細
胞のような哺乳動物由来の細胞、アフリカツメガエル卵母細胞のような両生類細
胞、又はサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）又はピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のよう
な酵母細胞が含まれるが、これらに限定されない。注入されたＲＮＡ転写物又は
ｃＤＮＡの発現にとって好ましい細胞には、アフリカツメガエル卵母細胞が含ま
れる。ＤＮＡの形質転換にとって好ましい細胞は、容易に効率よく形質転換され
うる細胞である。そのような細胞は、当業者に既知であるか、又は経験的に同定
されうる。好ましい細胞には、ＤＧ４４細胞及びＨＥＫ２９３細胞が含まれ、特
に、液体窒素中で凍結させ、次に解凍し、再増殖させることが可能なＨＥＫ２９
３細胞が含まれる。そのようなＨＥＫ２９３細胞は、例えばゴーマン（Ｇｏｒｍ
ａｎ）の米国特許第５，０２４，９３９号に記載されている（Ｓｔｉｌｌｍａｎ
ら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２０５１−２０６０も参照）
。

【０１３９】 細胞は、細胞内に導入された異種ＤＮＡを複製するため、又は細胞内に導入さ
れた異種ＤＮＡを発現させるための媒体として用いられうる。いくつかの実施態
様において、細胞は、実質的に純粋なヒトカルシウムチャネルサブユニット又は
異種カルシウムチャネルを作製するための手段として、異種ＤＮＡを発現させる
ための媒体として用いられる。異種ＤＮＡを含む宿主細胞は、カルシウムチャネ
ルが発現する条件下で培養されうる。カルシウムチャネルサブユニットは、当業
者に既知のタンパク質精製法を用いて精製されうる。例えば、サブユニットのう
ちの一つ又は複数に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体のよう
な抗体は、サブユニット又はサブユニットを含むカルシウムチャネルのアフィニ
ティ精製に使用されうる。

【０１４０】 実質的に純粋なヒトカルシウムチャネルのサブユニット、ヒトカルシウムチャ
ネルのα_１サブユニット、ヒトカルシウムチャネルのα_２サブユニット、ヒトカ
ルシウムチャネルのβサブユニット、及びヒトカルシウムチャネルのγサブユニ
ットが提供される。ヒトカルシウムチャネルサブユニットのうちの少なくとも一
つを含む実質的に純粋な単離されたカルシウムチャネルも、提供される。宿主細
胞によりコードされる一つ又は複数のサブユニットの混合物、及び細胞内に導入
された異種ＤＮＡもしくはＲＮＡによりコードされる一つ又は複数のサブユニッ
トを含む実質的に純粋なカルシウムチャネルも提供される。実質的に純粋なサブ
タイプ又は組織型に特異的なカルシウムチャネルも提供される。

【０１４１】 一つの実施態様において、α_１Ｈサブユニットを発現し、機能的なホモマーヒ
トα_１Ｈ含有カルシウムチャネルを形成する、カルシウムチャネルのα_１サブユ
ニットのうちの少なくとも一つ、好ましくはα_１Ｈサブユニットをコードする異
種ＤＮＡを含む真核細胞が提供される。これらの細胞は、Ｔ型チャネル及びＬＶ
Ａ型カルシウムチャネルの活性を調節する化合物をスクリーニングするために用
いられうる。

【０１４２】 その他の実施態様において、ヒトカルシウムチャネルのα_１サブユニット、ヒ
トカルシウムチャネルのα_２サブユニット、ヒトカルシウムチャネルのβサブユ
ニット、及びヒトカルシウムチャネルのγサブユニットのうちの少なくとも一つ
をコードする異種ＤＮＡを含む真核細胞が提供される。一つの好ましい実施態様
によれば、異種ＤＮＡは真核細胞において発現し、好ましくはヒトカルシウムチ
ャネルα_１サブユニットをコードする。

【０１４３】 異種カルシウムチャネルの発現：電気生理学及び薬理学 α_１ＨサブユニットコーディングＤＮＡを、ＨＥＫ２０３細胞において一過性
発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット解析により同定された、約２
６０ｋＤａのα_１Ｈ−１のα_１Ｈ−１タンパク質の発現と関連づけた。

【０１４４】 Ｂａ^２＋又はＣａ２^＋イオン流を、α_１Ｈ−１チャネルを一過性発現するＨＥ
Ｋ２９３細胞から記録し、低電位活性化を特徴とする生物物理学的及び薬理学的
特性、即ちＴ型カルシウムチャネルイオン流を示すことが見出された。α_{１Ｈ− １} を発現するアフリカツメガエル卵母細胞においても類似の結果が得られた。

【０１４５】 カルシウムチャネル活性を測定するための電気生理学的方法は、当業者に既知
であり、本明細書に例示されている。任意のそのような方法が、機能的カルシウ
ムチャネルの形成を検出するため、並びに得られたイオン流の動力学及びその他
の特徴を特徴付けするために用いられうる。カルシウムチャネルをさらに特徴付
けするためには、薬理学的研究を電気生理学的測定と組み合わせることができる
。

【０１４６】 機能的異種カルシウムチャネルの活性の測定に関しては、好ましくは宿主細胞
の内因性イオンチャネル活性、そして所望により所望のサブユニットを含まない
チャネルの異種チャネル活性を、差別的なホールディング電位の使用を含む、化
学的手段、薬理学的手段、及び電気生理学的手段により大きく阻害し、測定され
た異種カルシウムチャネル活性のＳ／Ｎ比を増加させることができる。

【０１４７】 従って、本明細書において提供されるＤＮＡによりコードされるサブユニット
の様々な組み合わせが、真核細胞に導入される。得られた細胞は、機能的チャネ
ルが発現しているか否かを確認するため、そしてチャネルの特性を決定するため
、調査されうる。特に好ましい局面において、異種ＤＮＡを含む真核細胞はそれ
を発現し、組換え機能的カルシウムチャネル活性を形成する。より好ましい局面
において、組換えカルシウムチャネル活性は、形質転換されていない宿主細胞に
は存在しない型であるため、又は大きさ及び／もしくは薬理学的特性を有するた
め、又は形質転換されていない細胞においては示されない生物物理学的特性を示
すため、容易に検出可能である。

【０１４８】 真核細胞は、本明細書に提供されたサブユニットサブタイプの様々な組み合わ
せにより形質転換されうる。得られた細胞は、カルシウムチャネル活性の研究の
ため、及び本明細書に提供された薬物スクリーニングアッセイにおける使用のた
めの、カルシウムチャネルの均一な集団を提供するであろう。実施された実験は
、従来の分類スキームの不適切さを証明した。

【０１４９】 形質転換された細胞の中で好ましいのは、機能的異種カルシウムチャネルを有
する組換え真核細胞である。組換え細胞は、ヒトカルシウムチャネルのα_１サブ
ユニットをホモマーとしてコードし、より好ましくは発現もする異種ＤＮＡ又は
ＲＮＡ転写物、ヒトカルシウムチャネルのβサブユニットをコードする異種ＤＮ
Ａ、及び／又はヒトカルシウムチャネルのα_２サブユニットをコードする異種Ｄ
ＮＡの導入及び発現により作製されうる。特に好ましいのは、そのような異種Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡ転写物によりコードされるα_１、β、及びα_２サブユニットの各
々のそのような組換え細胞における発現、そして場合によりヒトカルシウムチャ
ネルのγサブユニットをコードする異種ＤＮＡ又はＲＮＡ転写物の発現である。
機能的カルシウムチャネルは、好ましくはヒトカルシウムチャネルのα_１サブユ
ニット及びβサブユニットを少なくとも含みうる。これらの２つのサブユニット
を発現する真核細胞が、そしてさらなるサブユニットを発現する細胞も、ＤＮＡ
の形質転換及びＲＮＡ転写物の注入により調製されている。そのような細胞は、
ヒトカルシウムチャネルサブユニットのうちの一つ又は複数を含むカルシウムチ
ャネルに帰属させることができる電位依存性カルシウムチャネル活性を示した。
例えば、α_１サブユニット及びβサブユニットに加えα_２サブユニットを含む異
種カルシウムチャネルを発現する真核細胞は、脱分極に反応して細胞膜を介した
増加したカルシウム選択イオン流を示すことが示されており、このことは、α_２ サブユニットがカルシウムチャネル機能を強化するかもしれないことを示してい
る。α_２対α_１の比率を増加させながら細胞を共形質転換し、得られたカルシウ
ムチャネルの活性を測定した。その結果は、他の形質転換されたサブユニットと
比較したα_２コーディングＤＮＡの量を増加させると、カルシウムチャネル活性
が増加することを示している。

【０１５０】 ヒトα_１サブユニット、特にα_１Ｈサブユニットをホモマーとして含むか、又
はヒトα_１サブユニットを少なくとも含み、場合によりα_２δサブユニット及び
／又はヒトβサブユニットを含む異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞が
好ましい。α_１サブユニットを単独で、又はβ及び／もしくはα_２サブユニット
と組み合わせてコードするＤＮＡ又はＲＮＡ転写物を含む組成物でトランスフォ
ームされた真核細胞は、機能的カルシウムチャネルを発現する細胞を作製するた
めに用いられうる。異種ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされるヒトサブユニット
の全部を含むヒトカルシウムチャネルを発現する組換え細胞が特に好ましいため
、異種ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされるヒトサブユニットを含むカルシウム
チャネルを形成するために十分な濃度のサブユニットコーディング核酸を、その
ような宿主細胞に注入するか、又はそれらで形質転換することが望ましい。サブ
ユニットをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの正確な量及び比率は、特定のサブユニ
ットの組み合わせ、細胞、及びアッセイ条件のため経験的に決定され最適化され
うる。

【０１５１】 特に、哺乳動物細胞が、一つ又は複数のヒトカルシウムチャネルサブユニット
をコードするＤＮＡで一過性及び安定的に形質転換されている。そのような細胞
は、ヒトカルシウムチャネルに帰因しうる薬理学的特徴及び電気生理学的特徴を
示す異種カルシウムチャネルを発現する。しかし、そのような細胞は、均質な集
団を表し、薬理学的データ及び電気生理学的データは、これまで達成不可能であ
ったヒトカルシウムチャネル活性に対する洞察を提供する。例えば、α_１Ｅ−１ 、α_２ｂ、及びβ_１−３サブユニットをコードするＤＮＡで一過性形質転換され
たＨＥＫ細胞。得られた細胞は、Ｌ型、Ｎ型、Ｔ型、及びＰ型のチャネルのクラ
スとは区別される、薬理学的に区別されるクラスの電位活性化カルシウムチャネ
ルであると考えられる特性を有するカルシウムチャネルを形成する、これらのサ
ブユニットを一過性発現する。観察されたα_１Ｅイオン流は、他のクラスの電位
活性化カルシウムチャネルを定義するために以前に用いられていた薬物及び毒素
に対して感受性でなかった。

【０１５２】 α_１Ｂ−１、α_２ｂ、及びβ_１−２をコードするＤＮＡで一過性形質転換され
たＨＥＫ細胞は、ω−コノトキシンに対する感受性及びＮ型チャネルに典型的な
イオン流を示す異種カルシウムチャネルを発現する。同等のｍＲＮＡレベルを達
成するため細胞内に導入されたα_１Ｂ−１、α_２ｂ、及びβ_１−２のモル比を変
化させると、１細胞当たりの受容体の数、イオン流の密度が有意に増加し、ω−
コノトキシンに対するＫ_ｄが影響を受けることが見出されている。

【０１５３】 α_１Ｂ−１、α_２ｂ、及びβ_１−２から作製されたこれらのチャネルの電気生
理学的特性を、α_１Ｂ−１、α_２ｂ、及びβ_１−３をコードするＤＮＡでＨＥＫ
細胞を一過性形質転換することにより作製されたチャネルの特性と比較した。チ
ャネルは、類似の活性化の電位依存性、実質的に同一の電位依存性、類似の活性
化の動力学、及び単一の指数関数に適合しうるテールイオン流（ｔａｉｌ ｃｕ
ｒｒｅｎｔｓ）を示した。活性化の動力学の電位依存性は、調査された全ての電
位において有意に異なっていた。

【０１５４】 いくつかの実施態様において、異種カルシウムチャネルを有する真核細胞は、
細胞内でヒトカルシウムチャネルのサブユニットに翻訳される少なくとも一つの
ＲＮＡ転写物を含む第一の組成物を、細胞に導入することにより作製される。好
ましい実施態様において、翻訳されるサブユニットは、ヒトカルシウムチャネル
のα_１サブユニットを含む。より好ましくは、導入される組成物は、ヒトカルシ
ウムチャネルのα_１サブユニットをコードするＲＮＡ転写物を含み、（１）ヒト
カルシウムチャネルのβサブユニットをコードするＲＮＡ転写物及び／又は（２
）ヒトカルシウムチャネルのα_２サブユニットをコードするＲＮＡ転写物も含む
。特に好ましいのは、α_１、αβ、及びα_２ヒトカルシウムチャネルサブユニッ
トをコードし、場合によりヒトカルシウムチャネルのγサブユニットをコードす
るＲＮＡの導入である。クローニングされたＤＮＡのインビトロ転写及び得られ
たＲＮＡの真核細胞への注入の方法は、当技術分野において周知である。ヒトカ
ルシウムチャネルのサブユニットのいずれかをコードする全長ＤＮＡのいずれか
の転写物は、単独で、又はその他の転写物と組み合わされて、細胞内での発現の
ため真核細胞へ注入されうる。両生類卵母細胞は、本明細書に提供されたヒトカ
ルシウムチャネルサブユニットｃＤＮＡクローンのインビトロ転写物の発現にと
って特に好ましい。機能的異種カルシウムチャネルを発現する両生類卵母細胞が
、この方法により作製されている。

【０１５５】 薬理学的及び電気生理学的特性 実施例に記載されているように、α_１Ｈ−１をコードする核酸及びα_１Ｈ−２ をコードする核酸が、哺乳動物細胞及び両生類卵母細胞において発現されている
。電気生理学的及び薬理学的特性が研究されている。

【０１５６】 ＨＥＫ２９３細胞及びアフリカツメガエル卵母細胞において発現した組換えヒ
トα_１Ｈ ^２＋チャネルの生物理学的特性は、良好に合致しており、このことは、
組換えヒトα_１Ｈチャネルの生物理学的特性が発現系と無関係であることを示し
ている。いくつかの生物理学的特徴は、ヒトα_１ＨサブユニットがＴ型チャネル
のポアー形成α_１サブユニットであるという結論を支持している。α_１Ｈ含有チ
ャネルの活性化、不活性化、及び脱活性化の速度、並びに単一チャネルコンダク
タンスは、Ｔ型チャネルに関して記載された範囲に含まれている。この研究にお
いて測定された９ｐＳというコンダクタンス値は、ラットα_１Ｇ含有チャネルに
関して決定された値に近く、組換えＨＶＡチャネルに関して決定された値より有
意に低かった。さらに、α_１Ｈ含有チャネルはＢａ２＋及びＣａ^２＋を同程度に
伝導し、このことは、Ｂａ２＋及びＣａ^２＋のためのＴ型チャネルのコンダクタ
ンスが大部分の細胞系でほぼ等価であるという知見と一致している。

【０１５７】 α_１Ｈ含有Ｃａ^２＋チャネルは、ＨＶＡチャネルとは異なる薬理学的プロフィ
ールを示す。α_１Ｈにより媒介されるイオン流は、多数の細胞型においてＬＶＡ
イオン流を減少させることが示されている薬剤、Ｎｉ^２＋、アミロライド、及び
ミベフラジル（Ｒｏ４０−５９６７）により阻害される。対照的に、いくつかの
細胞型においてＬＶＡイオン流を阻害する抗痙攣剤、エトスクシミドは、α_１Ｈ により媒介されるイオン流に影響を与えない。Ｌ型Ｃａ^２＋チャネルのモデュレ
ーター、ニモジピン及び（−）−ＢａｙＫ８６４４は１μＭの濃度ではα_１Ｈ含
有チャネルにほとんど影響を与えないが、両化合物は１０μＭの濃度では顕著な
阻害を生じ、このことは、ラット視床下部ニューロンにおけるＴ型チャネルに対
するそれらの影響（Ａｒａｉｋｅら，１９８９）と一致している。要約すると、
本明細書に記載されたα_１Ｈ含有チャネルの薬理学的プロフィールは、様々な細
胞系において研究された天然Ｔ型チャネルと多くの類似性を有している。Ｔ型チ
ャネルの薬理学的特性は、細胞系の間でかなりばらつきがあり、Ｔ型チャネルを
特徴付ける薬理学的特徴は同定されていない。これらの結果は、複数のα_１サブ
ユニットが、ＬＶＡ又はＴ型チャネルのファミリーの薬理学的プロフィールを担
っているという、本明細書における知見と一致している。

【０１５８】 細胞のアッセイ及び臨床的使用並びにカルシウムチャネルアッセイ カルシウムチャネル活性を調節する化合物を同定するためのアッセイ 一つ又は複数のサブユニットを組み換え発現する真核細胞の用途には、試験化
合物がカルシウムチャネルのアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するか否か
を決定するためのアッセイが含まれる。これらの真核細胞は、既知のカルシウム
チャネルのアゴニスト及びアンタゴニストの中から、特定のカルシウムチャネル
サブタイプ特異性を示すものを選択し、それにより疾患又は組織に特異的な治療
剤としての可能性を有する化合物を選択するためにも用いられうる。

【０１５９】 異種ヒトカルシウムチャネルを発現する真核細胞を用いて、カルシウムチャネ
ル活性を調節するカルシウムチャネルのアゴニスト及びアンタゴニストのような
化合物を同定するためのインビトロ法が提供される。

【０１６０】 特に、アッセイは、ヒトカルシウムチャネルに特異的なカルシウムチャネルの
アゴニスト及びアンタゴニストの候補をスクリーニングするため、そして特に特
定のヒトカルシウムチャネルサブタイプに特異的な化合物をスクリーニングする
ため、本明細書に記載された異種ＤＮＡによりコードされるホモマー又はヘテロ
マーのヒトカルシウムチャネルサブユニットを発現する真核細胞を用いる。その
ようなアッセイは、構造がわずかに異なるアゴニスト及びアンタゴニストの中か
ら、ヒトカルシウムチャネルの活性を調節するために特に有用なものを選択する
ため、そしてサブタイプ又は組織に特異的なカルシウムチャネルのアゴニスト及
びアンタゴニスト活性を示す化合物を設計又は選択するための合理的薬物設計の
方法と共に用いられうる。これらのアッセイは、ヒトにおけるある種の障害の治
療のための、化合物の相対的な治療効力を正確に予測するべきである。さらに、
サブタイプ及び組織に特異的なカルシウムチャネルサブユニットが提供されてい
るため、組織特異的又はサブタイプ特異的な組換えカルシウムチャネルを有する
細胞を調製し、ヒトカルシウムチャネルの組織又はサブタイプに特異的な薬物の
同定のためのアッセイにおいて用いることができる。

【０１６１】 望ましくは、カルシウムチャネルサブユニットの発現のための宿主細胞は、そ
のタイプの内因性カルシウムチャネルサブユニットを産生しないか、又はリガン
ド結合アッセイにおける異種カルシウムチャネルサブユニットの検出、もしくは
機能アッセイにおけるカルシウムイオン流の生成のような異種カルシウムチャネ
ル機能の検出を実質的に妨害する量で産生しない。また、宿主細胞は、好ましく
は、生理学的濃度（一般的に、ナノモル又はピコモル単位の濃度）で、本明細書
において提供されるヒトカルシウムチャネルサブユニットのうちの一つ又は全部
を含むカルシウムチャネルと親和性を有する化合物と検出可能に相互作用する内
因性カルシウムチャネルを産生すべきでない。

【０１６２】 カルシウムチャネルに対する親和性を有する化合物を同定するためのリガンド
結合アッセイに関しては、好ましくは異種α_１サブユニットを少なくとも発現す
る細胞が使用される。異種α_１サブユニットを少なくとも発現する形質転換され
た真核細胞は、例えば、カルシウムチャネルと特異的に相互作用することが既知
である標識された化合物の相互作用を阻害する、試験化合物の能力を評価するこ
とにより、異種カルシウムチャネルに特異的に結合する試験化合物の能力を決定
するために用いられうる。そのようなリガンド結合アッセイは、完全な形質転換
された細胞又はそれらから調製された膜に対して実施されうる。

【０１６３】 異種カルシウムチャネル又はそれらのサブユニット、好ましくはα_１Ｈサブユ
ニット含有カルシウムチャネルを含む膜と結合する、又はさもなければ相互作用
する、試験化合物の能力は、カルシウムチャネルに対する既知の親和性を有する
一つ又は複数の濃度の化合物の存在下及び非存在下で、そのような膜の結合能を
決定する、スカッチャードプロットのような、競合的結合解析のような、任意の
適当な方法を用いることにより決定されうる。必要に応じて、当業者に既知の方
法に従い設計された対照実験と、結果が比較されうる。例えば、陰性対照として
、一つ又は複数のサブユニットコーディング核酸で形質転換されていない宿主細
胞由来の、同一の処理を受けた膜調製物のアッセイと、結果が比較されうる。

【０１６４】 アッセイは、少なくとも一つのヒトカルシウムチャネルのサブユニット、好ま
しくはヒトカルシウムチャネルのα_１サブユニットを少なくとも発現する組換え
真核細胞の細胞膜を、試験化合物と接触させること、膜に特異的に結合し、膜上
の異種カルシウムチャネルの活性を変化させるか又は調節する、試験化合物の能
力を測定することを含む。

【０１６５】 好ましい実施態様において、アッセイは、ヒトカルシウムチャネルのα_１サブ
ユニットを含むカルシウムチャネルを有する組換え細胞を用いる。その他の好ま
しい実施態様において、アッセイは、ヒトカルシウムチャネルのβサブユニット
及び／又はヒトカルシウムチャネルのα_２サブユニットと組み合わされたヒトカ
ルシウムチャネルのα_１サブユニットを含むカルシウムチャネルを有する組換え
細胞を用いる。α_１、そして場合によりβ及び／又はα_２ヒトサブユニットを含
み、場合によりヒトカルシウムチャネルのγサブユニットを含む異種カルシウム
チャネルを発現する組換え細胞は、そのようなアッセイにおける使用にとって特
に好ましい。

【０１６６】 いくつかの態様において、カルシウムチャネル活性を調節する化合物を同定す
るためのアッセイは、細胞を試験化合物及びカルシウムチャネル選択イオンを含
む溶液に曝した際の、異種機能的カルシウムチャネルを有する真核細胞のカルシ
ウムチャネル活性を測定すること、並びに測定されたカルシウムチャネル活性を
、試験化合物を含まない溶液中の同細胞又は実質的に同一の対照細胞のカルシウ
ムチャネル活性と比較することにより実施される。細胞は、チャネルが開口した
とき内向きイオン流を供給するために十分な濃度のカルシウムチャネル選択イオ
ンを有する溶液中に維持される。α_１、β、及びα_２ヒトサブユニットのそれぞ
れを含み、場合によりヒトカルシウムチャネルのγサブユニットを含むカルシウ
ムチャネルを発現する組換え細胞は、そのようなアッセイにおける使用にとって
特に好ましい。そのようなアッセイを実施するための方法は、当業者に既知であ
る。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞及びアセチルコリン受容体を用いて適
用される類似の方法については、Ｍｉｓｈｉｎａら（（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１３：３６４）を参照のこと。そのような卵母細胞及びナトリウムチャネル
を用いて適用される類似の方法については、Ｎｏｄａら（１９８６）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２２：８２６−８２８を参照。アセチルコリン受容体を用いて実施された
類似の研究については、例えば、Ｃｌａｕｄｉｏら（（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３８：１６８８−１６９４）を参照のこと。転写に基づくアッセイも本明
細書において考慮される。

【０１６７】 機能的な組換え又は異種カルシウムチャネルは、当業者に既知の任意の方法に
より同定されうる。例えば、周知である、細胞のイオン選択膜を介したイオン流
を測定するための電気生理学的過程が用いられうる。本明細書において提供され
るサブユニットのうちの一つ又は複数をコードするＤＮＡを含む組換え細胞の、
異種カルシウムチャネルを介したカルシウム選択イオンの流れの量及び持続時間
が、２つの電極及び全細胞パッチクランプ技術を用いた電気生理学的記録を用い
て測定されている。アッセイの感度を改善するため、組換えチャネルを介したカ
ルシウムイオン流を測定する際、非カルシウムイオン流及び内因性カルシウムチ
ャネルから生じるカルシウムイオン流を除去するか、又は減少させるため、既知
の方法が用いられうる。例えば、ＤＨＰＢａｙＫ８６４４は、チャネルの開口状
態の持続時間を増加させることにより、Ｌ型カルシウムチャネル機能を特異的に
増強する（例えば、Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ
３１１：５３８−５４４を参照）。チャネルの開口の延長は、カルシウムイオ
ン流の大きさ及び持続時間の増加をもたらす。脱分極電位コマンドによるイオン
チャネルの活性化の後、細胞膜の再分極時にテールイオン流が観察されうる。開
口したチャネルは、再分極時に閉口又は「脱活性化」するための明確な時間を必
要とし、この持続時間中にチャネルを通る流れがテールイオン流と呼ばれる。Ｂ
ａｙＫ８６４４は、カルシウムチャネルの開口イベントを延長させるため、これ
らのテールイオン流を延長させ、より明白にする傾向がある。

【０１６８】 これらのアッセイの実施においては、ヒトカルシウムチャネルのサブユニット
のうちの一つ又は複数を含む電位依存性ヒトカルシウムチャネルを発現する、安
定的もしくは一過性に形質転換された細胞又は注入された細胞が、望ましくは、
カルシウムチャネル活性を調節するカルシウムチャネルのアゴニスト及びアンタ
ゴニストのような薬剤を同定するためのアッセイにおいて用いられうる。試験化
合物がヒトカルシウムチャネルを介したカルシウムイオン又はその他のイオンの
流れを強化する、阻害する、又は変化させるか否かを決定するための、未知の活
性を有する化合物を含む、試験化合物のカルシウムチャネルアゴニスト又はアン
タゴニスト活性の機能的試験は、（ａ）細胞内へのカルシウムチャネル選択イオ
ンの流れを制御することができる異種機能的カルシウムチャネルを発現するよう
形質転換又は注入された真核細胞を、試験化合物の（ｉ）存在下及び（ｉｉ）非
存在下で、カルシウムチャネル選択イオンを含む培地中で維持すること、（ｂ）
異種カルシウムチャネルが実質的に閉口しており、細胞の内因性カルシウムチャ
ネルが実質的に阻害されている条件下で細胞を維持すること、（ｃ）異種カルシ
ウムチャネル（好ましくは、実質的に異種カルシウムチャネルのみ）をカルシウ
ムチャネル選択イオンに対して透過性にさせる程度に、そしてそれに十分な時間
量で、工程（ｂ）において維持された細胞の膜を脱分極させること、並びに（ｄ
）試験化合物の存在下での細胞内へのイオン流の量及び持続時間を、試験化合物
の非存在下での細胞、又は実質的に類似の細胞内へのイオン流と比較することに
より、達成されうる。

【０１６９】 従って、アッセイは、異種機能的カルシウムチャネルを発現する本明細書にお
いて提供される細胞を用い、試験化合物が異種機能的チャネルを介したＣａ^２＋ 又はＢａ^２＋のようなカルシウムチャネル選択イオンの流れの大きさ及び持続時
間を強化する、拮抗する、又は調節する能力を、機能的、例えば電気生理学的に
測定する。細胞の組換えカルシウムチャネルを介して流れるイオン流の量は、電
気生理学的に直接決定することもできるし、又は細胞内で起こる、カルシウム（
又はその他の）イオンに依存して直接影響を受ける無関係の反応をモニターする
ことにより決定することもできる。カルシウムチャネルの活性を調べるための任
意の方法が、本明細書において提供される細胞及びアッセイと共に用いられうる
。例えば、カルシウムチャネル活性を調節する能力に関して化合物を試験するた
めの方法の一つの実施態様においては、カルシウムチャネル選択イオンに対して
感受性があり、かつ異種カルシウムチャネルを発現し、発現のため指示タンパク
質をコードする構造遺伝子と機能的に連結した転写調節因子をも含む真核細胞を
用いる反応の調節により、イオン流の量が測定される。指示遺伝子の転写のため
に用いられる転写調節因子は、細胞内において、Ｃａ^２＋又はＢａ^２＋のような
カルシウムチャネル選択イオンに応答する。そのような転写に基づくアッセイの
詳細は、１９９０年８月７日に出願された同時係属中の同じ所有者の米国特許出
願第０７／５６３，７５１号に基づく優先権を主張している１９９１年８月７日
に出願された同じ所有者のされているＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／
５６２５号に記載されている。同時係属中の米国特許出願第０８／２２９，１５
０号及び第０８／２４４，９８５号に対応する同じ所有者の公開されたＰＣＴ国
際特許出願第ＰＣＴＵＳ９２／１１０９０号も参照のこと。これらの出願の内容
は参照として本明細書に組み込まれる。

【０１７０】 α_１Ｈサブユニットの生物物理学的及び電気生理学的特性 ＨＥＫ細胞をＤＮＡでトランスフェクトし、本明細書に提供された核酸を卵母
細胞に注入した。細胞はカルシウムチャネルを発現し、次にそれを電気生理学的
及び薬理学的に特徴付けした。これらの結果は実施例に記載されている。いずれ
のスプライス変異体も、Ｔ型チャネルに関連した特性を示すカルシウムチャネル
を形成した。変異体特異的な特性が観察された。

【０１７１】 特に、観察された多様性配列の領域がドメインＩとＩＩとの間のサイトゾルリ
ンカー領域内に存在し、また高電位活性化カルシウムチャネルの類似配列領域は
、サイトゾル制御タンパク質の結合に関与していることから、α_１Ｈー１及びα _１Ｈー２ に観察されたこれらのアミノ酸配列の差異は、これらの受容体の細胞制
御に対する感受性に顕著な差異をもたらすであろう。α_１Ｈー１及びα_１Ｈー２ に観察された生物物理学的特性の差異も、これらの２つの異なるチャネルサブユ
ニットの薬理学的化合物に対する感受性の差異の指標となる可能性が高い。従っ
て、α_１Ｈー１又はα_１Ｈー２サブユニットのいずれかを含む低電位活性化カル
シウムチャネルは、異なる制御調節を受け、薬学的化合物に対する異なる感受性
プロフィールを有する可能性が高い。例えば、アミロライドは神経芽細胞におけ
るＴ型イオン流を約５０μＭのＩＣ_５０で遮断するが、海馬ニューロンにおいて
は３００μＭのアミロライドはＴ型イオン流を４０％しか減少させない。

【０１７２】 これに関し、それぞれの異なるα_１Ｈチャネルは、薬学的薬物化合物の開発の
ための別々のスクリーニング標的である。異なる神経細胞に対する、異なる神経
組織における薬物の差別的な効果は、インビボにおけるα_１Ｈー１及び／又はα _１Ｈー２ の異なる発現パターンに基づき理解することができ、それは各サブタイ
プ及び関連する障害又は状態に特異的な薬物を同定するための手段を提供するで
あろう。観察されたα_１Ｈサブユニットの配列の変化により、観察された異なる
天然組織におけるＴ型カルシウムチャネルの薬理学的多様性が説明され、標的と
なる治療薬候補を同定するためのスクリーニングアッセイを用いて、それぞれの
α_１Ｈー１及びα_１Ｈー２サブユニットが発現している場所を同定するための有
用な手段が提供される。

【０１７３】 異なる組織におけるα_１Ｈー１及びα_１Ｈー２の機能及び発現の差異は、α_{１ Ｈー１} 又はα_１Ｈー２サブユニットのいずれかを有するカルシウムチャネルを発
現する組換え細胞を用いるための基礎を提供する。これらの２つの異なるサブユ
ニットを含むカルシウムチャネルに差別的な影響を与えることができるアゴニス
ト及びアンタゴニストは、選択された神経部位、例えばα_１Ｈー２を発現する心
血管系ニューロン及び心臓ペースメーカーニューロンに治療的介入を指向させる
ために有用であるはずである。α_１Ｈサブユニットから形成されるカルシウムチ
ャネルは、膜電位の小さな変化で開口するが、閉口前に中程度のＣａ^２＋流のみ
を可能にする。二価イオンの中程度の流入を可能にすることにより、α_１Ｈ含有
チャネルは、 （ｉ）ニューロン細胞型及び非ニューロン細胞型における、膜電位差の微妙な変
化に応答して（例えば、Ｔ細胞のような免疫細胞の活性化において、代謝変化に
応答した腎細胞及び肝細胞の活性化において）、遺伝子発現の変化を誘発する経
路に関与し、 （ｉｉ）末梢ニューロン及び神経節などにおいて、いずれのニューロンが、そし
てどの程度、刺激に対して応答するかの決定などにおいて、シナプス伝達に対す
るニューロンの全体的な興奮可能性又は接近可能性の微妙な調節を行い、 （ｉｉｉ）慢性的疼痛のような刺激に対する神経応答の程度を決定し、 （ｉｖ）神経中枢におけるニューロン細胞が、（例えば、心臓ペースメーカーに
おける）過剰な発火突発に関連した有害な効果から保護されるよう、重要な神経
中枢におけるニューロンの感受性を制御し、 （ｖ）（例えば、睡眠、性交、感情、抑うつ、疲労、及びその他の刺激又は状態
に応答する）脳の異なる領域におけるニューロンの不活性化の定常状態パターン
を設定するよう機能する、可能性が高い。

【０１７４】 α_１Ｈ−１サブユニットを含むチャネルを発現する細胞の電気生理学 組換えα_１Ｈ−１チャネルの発現 α_１ＨサブユニットをコードするＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞の一過性形質
転換の後、急速に活性化され不活性化されるＢａ^２＋イオン流が観察された。−
９０ｍＶというホールディング電位から様々な試験電位への段階的脱分極（ｓｔ
ｅｐ ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｓ）により誘導されるＢａ^２＋イオン流（
１５ｍＭ）を測定した。イオン流は、−５０ｍＶという試験電位で活性化され、
−２０と−１０ｍＶの間でピークに達し、より正の＋６０ｍＶの膜電位に戻った
。電荷担体としてＣａ^２＋（１５ｍＭ）を用いても類似の結果が得られた。

【０１７５】 ＬＶＡチャネルを特徴付ける一つの特徴は、テールイオン流の遅い減少に反映
される、遅い脱活性化速度である。この減少の時間定数は、＜３００μｓである
ＨＶＡチャネルよりもＬＶＡチャネル（２〜１２ｍｓ）では約１０倍遅い。約１
５ｍｓにわたる、α_１Ｈ−１により媒介されるテールイオン流の遅い減少が観察
された。多くの天然Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルに関して報告されているテールイオン
流の一成分指数関数的（ｍｏｎｏｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）減少と対照的に、α _１Ｈ−１ チャネルからのテールイオン流は、二成分指数関数的（ｂｉｅｘｐｏｎ
ｅｎｔｉａｌ）減少を示した。−２０ｍＶの試験電位で、全イオン流の８８．１
±３３．８％を構成する遅い成分の減少速度は、天然Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルにお
いて観察されたのと類似の、２．１±１．０６ｍｓであった（ｎ＝６）。速い成
分の減少速度は０．６４±０．２１ｍｓであった（ｎ＝６）。

【０１７６】 ヒトα_１Ｈ−１サブユニットを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に対して、全
細胞パッチクランプ記録を実施した。段階的脱分極は、ゆっくりと活性化し急速
に不活性化する内側Ｂａ^２＋イオン流を誘導した（−２０ｍＶにおいて２．８±
０．６及び１６．９±５．３ｍｓ）。α_１Ｈ−１の活性化曲線は、ＨＶＡｃａ^{２ ＋} チャネルと比較して、左方向へシフトしている（Ｖ１／２：−２９．５ｍＶ）
。α_１Ｈ−１含有チャネルのテールイオン流は、ゆっくりと減少する（τ１、τ
２±１．０、０．６、±０．２ｍｓ）。Ｂａ^２＋及びＣａ^２＋に対する透過性は
、事実上同一であった。電荷担体として１１０ｍＭのｂａ^２＋を用いて決定され
た単一チャネルコンダクタンスは９ｐＳである。

【０１７７】 α_１Ｈ−１含有Ｃａ^２＋チャネルの活性化の電位依存性を、テールイオン流解
析から決定した。標準化されたテールイオン流の大きさを試験電位の関数として
プロットし、２つのボルツマン関数の計に良好に適合する二相性活性化曲線が明
らかとなった（図１）。個々のボルツマン項の最大の半分の活性化の電位は、以
下の通りであった。Ｖ_{１／２，Ａ}：−２５．１±３３．０ｍＶ；及びＶ_{１／２， Ｂ} ：＋２５．５±３９．９ｍＶ（ｎ＝１１）。Ｖ_{１／２，Ａ}に類似の値が、ヒト
ＴＴ細胞系におけるＴ型ＣＡ^２＋チャネルの活性化の電位依存性に関して以前に
報告されている（−２７ｍＶ）。第二のボルツマン項Ｖ_{１／２，Ｂ}の値は、ＨＶ
Ａ Ｃａ^２＋チャネルに関して報告されたものと幾分類似している。類似のプロ
トコルを用い、ＨＶＡ Ｃａ^２＋チャネルのテールイオン流は、＜３００μｓの
時間定数で減少したが、α_１Ｈでは、Ｖ_{１／２，Ｂ}に近い試験電位において最も
突出していた。α_１Ｈ含有Ｃａ^２＋チャネルの開口のための利用可能性は、図１
に示されたように電位に関して膜に依存していた。最大の半分の定常状態不活性
化の電位（Ｖ_１／２）は、−６３．２±２．０ｍＶ（ｎ＝９）であった。

【０１７８】 α_１ＨＣａ^２＋チャネルの急速な不活性化は、強く電位依存性であった。イオ
ン流の減少は、−５０と＋３０ｍＶの間の膜電位で、４２．２±７．８から８．
８±３．８ｍｓまでの範囲の時間定数を含む指数関数で最も良好に記載された（
ｎ＝６；データは示されていない）。α_１ＨＣａ^２＋チャネルの活性化動力学も
、電位依存性であり、時間定数は、−５０と＋３０ｍＶの間の膜電位で、９．９
±４．７から０．９±０．３ｍｓまでの範囲であった（ｎ＝８；データは示され
ていない）。α_１ＨＣａ^２＋チャネルは、１５０ｍｓの脱分極の間に完全に不活
性化した。不活性化からの回復は、速い成分（τ＝３７±９ｍｓ；全チャネルの
１６．５±４．６％）及び遅い成分（τ＝３７±６１ｍｓ；全チャネルの７８±
８．５％；ｎ＝３；データは示されていない）で約３ｓ以内に起こった。ＨＥＫ
２９３細胞からの全細胞記録において観察された組換えα_１Ｈチャネルの生物物
理学的特性を確認するため、アフリカツメガエル卵母細胞におけるα_１Ｈの機能
的発現を試験した。α_１Ｈ転写物単独の注入後に実質的なイオン流（＜１μＡ）
が観察された。活性化及び不活性化の動力学、並びに定常状態不活性化特性は、
ＨＥＫ２９３細胞において得られたものと類似していた（実施例参照）。

【０１７９】 ＨＥＫ２９３細胞におけるα_１ＨＣａ^２＋チャネルの単一チャネル特性を、電
荷担体として１１０ｍＭのＢａ^２＋を用いた細胞接着観察（ｃｅｌｌ−ａｔｔａ
ｃｈｅｄ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ）において決定した。少なくとも３つのα_１Ｈ を含むパッチからの−３０ｍＶの試験電位における単一チャネル記録は、チャネ
ルの開口が突然起こり、特に比較的強い脱分極では、１００ｍｓの脱分極パルス
の最初の３分の１に主に集中していることを示した。時として、チャネル活性は
全範囲に拡散した。１１０ｍＭのＢａ^２＋で−３０ｍＶで記録された全体平均イ
オン流の時間経過は、１５ｍＭのＢａ^２＋で−４０ｍＶで記録されたα_１Ｈの全
細胞Ｂａ^２＋イオン流と類似していた。二価濃度の増加による活性化曲線のより
正の電位へのシフトを補正するため、異なる電位におけるイオン流を比較した。
単一のイオン流電位関係により、９．０６±０．２２ｐＳという単一の勾配コン
ダクタンス（ｓｌｏｐｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）が得られた（ｎ＝４）。

【０１８０】 電気生理学的特徴の要約 ヒトα_１Ｈサブユニットを含有するカルシウムチャネルの生物物理学的特性を
評価した。一過性形質転換されたＨＥＫ２９３細胞からの全細胞観察は、α_１Ｈ サブユニットを含有するカルシウムチャネルのイオン流電位関係、Ｃａ^２＋及び
Ｂａ^２＋に対する透過性、活性化の動力学、及び単一チャネルコンダクタンスが
、組織における天然Ｔ型カルシウムチャネルのそれらと類似していたことを示し
ている。Ａ_１Ｈチャネルからのテールイオン流は、二成分指数関数的減少を示し
、速い成分及び遅い成分を示した。極めて負の膜電位（−１５０から−１００ｍ
Ｖ）においては速い成分（τ：２００〜４５０μｓ）が不活性化プロセスを支配
し、＞５０ｍＶの脱分極電位においては遅い成分（２〜３ｍｓ）が支配した。静
止膜電位、即ち≦−８０ｍＶにおいては、両成分が同等に寄与している。

【０１８１】 薬理学的性質 α_１Ｈ含有カルシウムチャネルの薬理学的性質はまた、天然Ｔ型カルシウムチ
ャネルについて観察されたものと一致した。興味深いことに、Ｃｄ^２＋あるいは
アミロライドに対するα_１Ｈ−１含有カルシウムチャネルの感受性はＨＥＫ２９
３細胞において発現した場合、アフリカツメガエル卵母細胞において発現した場
合に比べて約１０倍低かった。

【０１８２】 データはヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットが天然Ｔ型カルシウムチ
ャネルと一致する性質を有することを示し、α_１Ｈは、このように急速にぞうか
している低電圧活性化カルシウムチャネルのファミリーのメンバーを代表してい
る。

【０１８３】 ＬＶＡ−カルシウムチャネル媒介障害の診断および臨床応用のための評価 臨床応用 様々な疾病状態の治療処置に関して、ヒトカルシウムチャネルサブユニットを
コードするＤＮＡを利用できることにより、ある疾病状態の発生に関連する可能
性があるいくつかの遺伝子の変化（たとえば変異）の同定を可能にする。加えて
、実験室動物内に導入できうる合成ＤＮＡ断片内へこれらの変異の特異的導入に
よって、あるいはそれらの効果を決定するためのインビトロアッセイ系によって
、このような疾病状態の動物モデルの創生が可能となる。

【０１８４】 また、遺伝的スクリーニングが、プローブとしてヌクレオチド配列を用いて実
施できる。したがって、適当なプローブによってスクリーニングして、１つある
いはそれ以上のカルシウムチャネルサブユニットの変性／修飾が含まれることが
疑われる病理状態である対象者からの核酸標本を内因性カルシウムチャネルのい
くつかに関して異常が存在するかどうかを決定できる。同様に、カルシウムチャ
ネル機能不全に関する疾病状態の家族病歴を持つ対象者を、その者もそのような
疾病状態にかかりやすくなるかどうかを決定するためにスクリーニングできる。

【０１８５】 スクリーニングアッセイが発揮でき、および疾病の処置の候補化合物が適用で
きる疾病は、心筋梗塞、心臓不整脈、心不全および狭心症等の心臓病処置が含ま
れるが、これらに限定されない。特定された化合物は、（ａ）外傷、心発作およ
び他の心傷害後の正常心速度および心出力を回復させるための補助治療、（ｂ）
心筋梗塞（ＭＩ）、ＭＩ後および急性凝固の処置、において有用であろう。この
化合物は、左心室拡張期圧によって測定したような心収縮力を、血圧あるいは心
速度を変化させることなく増加させるのに有用であろう。急性凝固において、こ
の化合物は、コラーゲン沈着あるいは隔膜厚によって測定したような傷跡組織の
形成を、心臓抑制効果なしに減少させるのに効果があろう。特定された化合物は
診断及び診断のためのアッセイについて有用であり、化合物スクリーニングは、
血管処置および高血圧に関連して、血管拡張あるいは血管収縮を含む血管平滑筋
弾力を調節するために有用である化合物特定のために有用であろう。このような
化合物は、（ａ）たとえば外傷、手術あるいは心肺バイパス後の処置および麻酔
薬の心血管効果を低減するように設計した予防処置、（ｂ）自律神経系による血
管反射および血圧調節を改善するための処置、において使用できる。化合物を特
定することが有用な状態は、泌尿系状態［ａ）手術、外傷、尿毒症および薬物副
作用による腎機能の治療、回復、（ｂ）膀胱機能不全の治療、および（ｃ）血液
透析患者の尿毒症ニューロン毒性および低血圧］、生殖系状態［（ａ）インポテ
ンツを含む生殖機能障害および（ｂ）（Ｔチャネル調節の対象であろう自律調節
下の）アルコールインポテンツの治療］、肝臓系状態［急性アルコール過消費に
起因するニューロン毒性および自律神経系傷害の治療減少］、神経系状態［（ａ
）てんかんおよび間脳てんかんの治療、（ｂ）パーキンソンの治療、（ｃ）震え
および感染分泌および末梢血管血液供給の異常のような異常体温調節、（ｄ）ノ
ルアドレナリン、ドパミンおよび他のホルモンの異常分泌を含む下垂体体視床下
部機能の異常の治療］、呼吸系状態［麻酔の施術後合併症のような異常呼吸の処
置］、内分泌系失調［インスリン、チロキシンおよびアドレナリンを含むホルモ
ンの過産生の処置等のホルモン異常分泌の処置］を含む。

【０１８６】 実施例 以下の実施例は、説明のために含まれているのであって、本発明の範囲を限定
することを意図するものではない。

【０１８７】 実施例１ ： ヒトカルシウムチャネルα_１Ｈ−１サブユニットをコードする
ＤＮＡの単離 ｍｓＲＮＡおよびＴＴ細胞を用い、変法ＰＣＲアプローチをα_１サブユニットを
コードする核酸を単離するために用いた。α_１Ｈ−１サブユニットをコードする
核酸およびα_１Ｈ−２と命名されたサブユニットをコードする核酸を単離した。
核酸をＨＥＫ２９３細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞に導入し、電圧ゲー
トカルシウムチャネルを発現させた。これらのチャネルは天然ＬＶＡ、Ｔ型チャ
ネルと一致する薬理学的、電気生理学的性質を示す。

【０１８８】 Ａ．材料と方法 核酸増幅： ヒトα_１ＥサブユニットをコードするＤＮＡの１９４５−１９６４ヌクレオチ
ドに相当する以下のセンス鎖２０マーＰＣＲプライマーを合成した。

【０１８９】 ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＴＧＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣ（プラ
イマー１） 配列番号４ ヒトα_１Ｅの３９１９から３９４０のヌクレオチドに相当するアンチセンス２
２−ヌクレオチドＰＣＲプライマーも合成した。

【０１９０】 Ｔ（Ｃ／Ｔ）ＣＣＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣＣＣＣ（
プライマー２） 配列番号１ このセンスおよびアンチセンスプライマーをＴＴ細胞より調製したｃＤＮＡお
よびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いる増幅反応で使用した。

【０１９１】 反応条件：９５℃５分間に続きそれぞれ９５℃２０秒間、４２℃２０秒間、７
２℃２．５分間の５サイクルおよびそれぞれ９５℃２０秒間、続いて５０℃２０
秒間、最後に７２℃２．５時間の３０サイクル。この反応の産物は本明細書中（
以下）で「原ＰＣＲ産物」と称する。

【０１９２】 第２の５’縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、ヒトα_１ＥサブユニットＤ
ＮＡ配列のヌクレオチド３５９８と３６１４間の部分と整列されたセンス鎖配列
一部分としてのＣ．ｅｌｅｇａｎｓについて報告されている配列の一部［コスミ
ドＣ５４Ｄ２（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｕ３７５４８）］に対応して設計した
。このプライマーは以下の配列を持つ。 ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴ（プライマー３） 配列
番号１０ プライマー３を原ＰＣＲ産物およびプライマー２を用いるネスト増幅反応にて使
用した。

【０１９３】 クローンの単離および特性付け： 組換えｃＤＮＡライブラリーをＴＴ細胞株よりｐｏｌｙ（Ａ）^＋選択したＲＮ
Ａを用いてファージベクターλｇｔ１０中に構築した。約１．５×１０^６を、高
ストリンジェンシー条件（ハイブリット形成：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰ
Ｅ、５％ Ｄｅｄｎｈａｒｄｔｓ、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌニシン精
子ＤＮＡ中１６−１８時間、４２℃、洗浄：６５℃にてそれぞれ０．１×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳ中３０分間６回洗浄）下で、これらＰＣＲ断片を用いるスク
リーニングした。

【０１９４】 ノーザンブロット分析： 多数の組織を、１レーンあたり２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いたノーザンブロットにてスクリーニ
ングした。ブロットは上述したような高ストリンジェンシー条件で、全長α_１Ｈ ｃＤＮＡより産生した（すなわちヌクレオチド−６から７３９０）標識化断片に
よって調査した。

【０１９５】 ウエスタンブロット分析 （全）細胞膜を異なるα_１Ｈサブユニットを発現しているＨＥＫ２９３細胞よ
り単離し、膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに
写し、ポリクローナル抗α_１Ｈ抗血清およびＴＢＳ−Ｔ緩衝液を用いてブロット
した。ブロットされたタンパク質を製造者の指示書に従って、Ｌｕｍｉｇｌｏ試
薬キット（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて可視化した。 Ｂ．ＲＮＡ単離 ヒト髄質甲状腺癌細胞（ＴＴ細胞ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１８０３）を１０％
胎児ウシ血清を補足したＤＭＥＭ培養液中、３７℃、５％ＣＯ_２気中にて育て、
全細胞質ＲＮＡを製造者の指示書により「ミディプレップ（ｍｉｄｉｐｒｅｐ）
」ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い４０枚の１０ｃｍプレートより単離
した。この手順は核膜がそのままの状態で残っており、それによって不完全にス
プライスされたＲＮＡ転写物を調製物より取り除くような穏やかな状態下、細胞
膜を溶解させる洗浄剤ＮＰ４０の使用を含む。

【０１９６】 オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを２回通すことで全細胞質ＲＮＡよりｐｏ
ｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。簡単に記すと、全細胞質ＲＮＡ２−３ｍｇをＮ
ＥＴＳ緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ７．４、０．２％ＳＤＳ）に再懸濁させ、ＮＥＴＳ緩衝液にて平衡化し
たオリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）０．５ ｇを含むカラムにゆっくり通した。カラムを３０ｍｌのＮＥＴＳ緩
衝液にて洗浄し、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをＥＴＳ緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、０．２％ＳＤＳ）約３ｍｌを用いて溶出した。
ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ含有緩衝液のイオン強度を５００ｍＭ ＮａＣｌに調整し、
本質的に上述したように第２のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通した。第
２カラムからの溶出後ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをエタノール中２回沈殿させ、Ｈ_２Ｏ
にて再懸濁させた。

【０１９７】 Ｃ．ライブラリー構築 ２本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）を標準の手法によって合成した（例えばＧｕ
ｂｌｅｒら（１９８５）Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９；Ｌａｐｅｙｒｅら（
１９８５）Ｇｅｎｅ ３７：２１５−２２０を参照のこと）。簡単に記すると、
第１ｃＤＮＡ鎖合成をＴＴ細胞ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを鋳型とし、ランダムプライ
マーおよびモロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ
Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）を用いて開始した。第２鎖を大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼおよびＲＮａｓｅＨの組み合わせを
用いて合成した。

【０１９８】 平滑末端二本鎖断片を造り出すＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、一本鎖ＤＮＡ
の領域を二本鎖ＤＮＡに変化させた。ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位ア
ダプターである ５’ＣＧＴＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＣＴＡＧ ３’（配列番号２） ３’ＧＣＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＴＡＡ５’（配列番号３） を一般的な手順（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） ＩＮ：Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８章）を
用いて二本鎖ｃＤＮＡに連結した。ＥｃｏＲＩアダプターを連結した二本鎖ＤＮ
ＡをセファロースＣＬ−４Ｂレジンを用いたカラムクロマトグラフィー、その後
１．２％アガロースゲル上でのｃＤＮＡサイズ選択によりフリーのあるいは連結
されていないアダプターを取り除き精製した。臭化エチレンを用いて溶解ＤＮＡ
を視覚化した後、ｃＤＮＡの２つの画分、＞３．５ｋｂおよび１．０−３．５ｋ
ｂをゲルより単離し、ベクターλｇｔ１０に挿入した。

【０１９９】 ｃＤＮＡ挿入物を含む連結したλｇｔ１０をＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌ
ｄパッケージング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）キットを
用いてインビトロでλファージビリオン中にパッケージングした。本方法を用い
＞３．５ｋｂｃＤＮＡ画分に対する〜１．５×１０^６の組換え体および１．０と
３．５ ｋＢ間のＤＮＡ画分に対する〜１０×１０^６組換え体のファージライブ
ラリーを入手した。

【０２００】 Ｄ．ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの一部分をコードするＤＮＡ
の単離 ＴＴ細胞内にコードされたヒトα_１サブユニットの小領域をコードするＤＮＡ
を縮重ＰＣＲ−増幅（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２６９：２２３４７−２２３５７）を用いて単離した。これらの増幅した断
片を、ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの全長をコードするＤＮＡの
単離のためのＤＮＡプローブを生成するために使用した。

【０２０１】 上記のように、生成したオリゴヌクレオチドの２つの組を、既知のヒトα１カ
ルシウムチャネルサブユニット間で高頻度の配列同一性を有することが知られて
いるＩＩ−ＩＩＩループのフランキング領域を基に合成した。１）ＩＩＳ５−Ｉ
ＩＳ６ループの領域に相補的な２つの産生ヌクレオチドを５’上流プライマー（
配列番号４および５）として合成した；２）ＩＩＩＳ５膜貫通部分の一部分に相
補的な２つの縮重オリゴヌクレオチドを３’下流プライマー（配列番号６および
７）として合成した。

【０２０２】 これらの縮重オリゴヌクレオチドをＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いたネストＰＣＲ増幅反応でプライ
マー対として使用し、反応を製造者の指示に従って行った。サンプルを商業的に
入手可能なサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に設置し、増幅反
応を、９５℃５分間１サイクル、９５℃２０秒間／４２℃２０秒間／７２℃２．
５分間の５サイクル、９５℃２０秒間／５０℃２０秒間／７２℃２．５分間の３
０サイクル、および７２℃７分間１サイクルで行った。増幅ＤＮＡ産物をアガロ
ースゲル上の電気泳動にかけ、ゲルを一般的な手法を用いて精製した。

【０２０３】 Ｅ．ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの一部分をコードするＤＮＡ
の増幅 ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの一部をコードするＤＮＡを増幅
するために、ドメインＩＩＩのある領域に部分的に相補的である３つの縮重ヌク
レオチド（配列番号８−１０）を５’プライマーとして合成した。この領域は上
記セクションＣのすべての増幅α_１コード断片中に包含されている。この増幅産
物を鋳型として用いてヒトα_１Ｈサブユニットの一部をコードするＤＮＡを増幅
するために、ＩＩＩＳ２（配列番号８および１０）内の配列を基にした２つのヌ
クレオチドを第１ＰＣＲ反応（配列番号６および７）で用いた３’ＩＩＩＳ５膜
貫通プライマーとともに５’プライマーとして用いた。

【０２０４】 増幅ＤＮＡ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）内にサ
ブクローン化し、プラスミドＤＮＡを単離した形質転換体より精製し、それぞれ
の挿入物のＤＮＡ配列を決定した。既知のヒトα_１カルシウムチャネルサブユニ
ットとおよそ５５−６０％の配列同一性を有する３４０ｂｐ断片（配列番号４８
；配列番号４９のヌクレオチド４２７１から４６１０）を同定した。ＰＣＲ１と
呼ばれるこのＤＮＡ断片をヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットをコード
するＤＮＡを単離するためのＤＮＡプローブとして使用した。

【０２０５】 Ｆ．個々のクローンの単離および特性化 ハイブリッド形成および洗浄条件 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための固定化ＤＮＡへの放射標識核
酸のハイブリッド形成、ＤＮＡサザン転移、あるいはノーザン転移を、標準ハイ
ブリッド形成条件（ハイブリッド形成：５０％脱イオンホルムアミド、２００μ
ｇ／ｍｌ超音波処理ニシン精子ＤＮＡ（Ｃａｔ＃２２３６４６、Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｉｎｄｉａｎａｐｏ
ｌｉｓ、ＩＮ）、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、４２℃；洗浄０．
２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で常法により行った。ＳＳＰＥおよび
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓの作製法および脱イオンホルムアミドの準備は、例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、８章に記載されている。あるハイブ
リッド形成においては、標準ハイブリッド形成条件として記載された、５０％脱
イオンホルムアミドを１０％脱イオンホルムアミドに置き換える低ストリンジェ
ンシー条件を使用した。

【０２０６】 フィルターからの非特異的プローブを取り除くための洗浄条件は以下に記載の
高、中、低ストリンジェンシー条件であった。

【０２０７】 １）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２）中ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ 同等のストリンジェンシーが、他の緩衝液、塩および温度を用いて得られること
が理解される。

【０２０８】 ＞３．５ｋｂ挿入物を含むＴＴ細胞ファージライブラリーのおよそ１．５×１
０^５組換え体を平板培養し、二重リフトをそれぞれのプレートから調製した。こ
れらのリフトを標準ハイブリッド形成条件を用いて放射標識ＰＣＲ１を用いてプ
ローブ探査し、フィルターを洗浄し、およそ１００の陽性プラークを特定した。
まず５つの陽性物λ１．２０１−λ１．２０５をプラーク精製および特性化のた
めに選択した。

【０２０９】 λ１．２０１−λ１．２０５より単離した精製ＤＮＡのＥｃｏＲＩを用いた制
限エンドヌクレアーゼ消化により、クローン１．２０１は〜３５０ｂｐのＰＣＲ
１断片の原挿入物を含み、一方、クローン１．２０２、１．２０３、１．２０４
および１．２０５は、それぞれ〜１１００、〜４０００、〜２６００および〜２
２００ヌクレオチドの挿入物を含むことが示された。

【０２１０】 Ｆ．ヒトα_１ＨカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡの単離と
全長α_１ＨサブユニットをコードするＤＮＡの構築 １．部分ヒトα_１Ｈクローンの照合リスト 全長α_１ＨｃＤＮＡ配列を配列番号４９に示す。α_１Ｈの特性化に使用した部
分ｃＤＮＡクローンのリストおよび各クローンの全長α_１ＨｃＤＮＡ配列におけ
るヌクレオチド位置を以下に示す。これらのクローンの単離および特性化を以下
に記載する。

【０２１１】 １．３０５ 配列番号４９のヌクレオチド１から３５３０ １．２０５ 配列番号４９のヌクレオチド２４３２から４６５８ １．２０４ 配列番号４９のヌクレオチド３１５４から５６９９ ＰＣＲ１ 配列番号４９のヌクレオチド４２７１から４６１０ １．２０２ 配列番号４９のヌクレオチド４３７２から５４７６ １．２０３ 配列番号４９のヌクレオチド３８９１から７８９８ ２．クローンの特性化 それぞれの挿入物のＤＮＡ配列決定により、クローン１．２０２は配列番号４
９のヌクレオチド４３７２から５４７６に相当する１，１０５ｂｐ挿入物を含み
、クローン１．２０３は配列番号４９のヌクレオチド３８９１から７８９８に相
当する４，００８ｂｐ挿入物を含み、クローン１．２０４は配列番号４９のヌク
レオチド３１５４から５６９９に相当する２，５４６ｂｐ挿入物を含み、クロー
ン１．２０５は配列番号４９のヌクレオド２４３２から４６５８相当する２，２
２７ｂｐ挿入物を含むことがわかった。これらの４つのＤＮＡクローンは、完全
なカルボキシ末端および枠内転写終止コドンを含む、α_１Ｈサブユニットの大部
分をコードする約６．６ｋｂの読みとり枠をコードする重複配列を含んでいる。

【０２１２】 クローン１．２０５（配列番号４９のヌクレオチド２４３２からヌクレオチド
２９７９）の５’末端からの５４８ｂｐＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ制限エンドヌクレ
アーゼ断片を用いて、ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットの５’末端を
コードするＤＮＡを単離して、高ストリンジェンシー条件下にてＴＴ細胞ｃＤＮ
Ａライブラリーを再スクリーニングした。簡単に記すると、＞３．５ｋｂの挿入
物を含むヒトα_１Ｈカルシウムのアミノ末端をコードするＤＮＡを、精製した制
限断片とインキュベートし、４２℃でハイブリッド形成し、上述のように高スト
リンジェンシー条件下で洗浄した。

【０２１３】 １つの組換え体（クローン１．３０５）が、その３’末端がクローン１．２０
５（配列番号４９のヌクレオチド２４３２からヌクレオチド３５３０）の５’末
端とおよそ１．１ｋｂの配列同一性を持つ３，５３０ヌクレオチド挿入物を含み
、またクローン１．２０５（配列番号４９のヌクレオチド２４３３から２４３８
）の５’末端に位置するＥｃｏＲＩ部位の上流の２．４ｋｂ配列をも含むことが
わかった。この配列は、コンセンサスリボゾーム結合部位（配列番号４９のヌク
レオチド２４４からヌクレオチド２４８）を含む２４８ｂｐの５’非転写配列と
共にＡＴＧ開始コドン（配列番号１２のヌクレオチド２４９からヌクレオチド２
５１）およびアミノ末端の１，０９４アミノ酸をコードしている。

【０２１４】 ２つの他の組換え体が（配列番号１３および１４）、クローン１．３０５の３
’末端と配列同一の約１．１ｋｂを持つが、膜貫通ドメインＩおよびＩＩ間に位
置する伸長細胞内ループに相当するＤＮＡ配列の長さが異なることがわかった。

【０２１５】 ３．全長α_１Ｈ−１コードＤＮＡクローンの構築 これらの部分ｃＤＮＡクローンの一部をα_１Ｈコード断片中に存在する共通制
限エンドヌクレアーゼ部位を用いて連結して全長α_１ＨｃＤＮＡを調製すること
ができる。全長α_１Ｈコードクローンを、１）クローン１．３０５内に存在する
α_１Ｈの５’末端をコードするＤＮＡとクローン１．２０５とを共通ＥｃｏＲＩ
部位（配列番号４９のヌクレオチド２４３３から２４３８）を用いて結合させる
こと、２）α_１Ｈのアミノ末端をコードする得られたクローンを、クローン１．
２０５および１．２０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２のヌクレオチド４５１７−４
５２２）間に存在する共通ＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてクロ
ーン１．２０３内にコードされたα_１Ｈのカルボキシ末端配列と結合すること、
によって構築した。得られた全長ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルサブユニットは
、長さが２，３５３アミノ酸残基である（配列番号１２）。発現構築物は、ｐＣ
ＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）内に組立てられ
、コンセンサスリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に続いて全長α_１Ｈコード配列を
含んでいた（ＲＢＳを含むｐｃＤＮＡ１−ベースのベクターの記述として、たと
えば国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、許可米国出願番号第０
８／１４９，０９７号、米国特許第５，８５１，８２４号および米国特許第５，
８４６，７５６号を参照のこと）。得られた構築物はｐｃＤＮＡ１α_１ＨＲＢＳ
と命名された。

【０２１６】 実施例２ ヒトカルシウムチャネルα_１Ｈ−２サブユニットのクローニング Ｔ型チャネルイオン流は、異なる生物理学的および薬理学的特性を持っていて、
異なる細胞型間で異質であり、ここにそして以下の実施例で示すように、異なる
細胞での異なるα_１サブユニットサブタイプの発現により得られる。

【０２１７】 Ａ．α_１Ｈ−２のクローニング 上記したように、中央細胞質ループＩＩ／ＩＩＩ領域中のヒトα_１Ａ−α_１Ｅ 配列の整列に基づいて選んだＰＣＲプライマー１および２およびプライマー３（
ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴ 配列番号１０）を、ヒ
トα_１コード核酸配列と整列させたコスミドＣ５４Ｄ２中のα_１関連シーエレガ
ンスＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列を考慮して選んだ。

【０２１８】 α_１関連コード核酸を、プライマー１および２をまず縮重増幅反応で用い、引
き続きプライマー３およびプライマー２をネストＰＣＲ増幅で用いて、ＴＴ細胞
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡよりふたつの工程で増幅した。この結果、α_１Ｈサブユニッ
トの一部をコードする３４０ヌクレオチド断片が増幅された。この増幅産物を、
ライブラリーをスクリーニングし、全長α_１Ｈサブユニットをコードする核酸ク
ローンを単離するためのプローブとして使用した。

【０２１９】 α_１Ｈ−１配列に基づいたプライマーおよび種々の組織についてＲＴ−ＰＣＲ
を用いて、α_１Ｈ−１についてインフレーム欠失を持つ転写物をＴＴ細胞ライブ
ラリーより特定し、単離した。この欠失にまたがる断片単離した。これらは、整
列させると９５７塩基対欠失をのぞくα_１Ｈ−１配列に一致した。全長クローン
（α_１Ｈ−２と命名（配列番号１６を参照））を、これらの断片より構築し、Ｒ
ＢＳとともにｐｃＤＮＡ１中に挿入して得られたα_１Ｈ−１，α_１Ｈ−２転写物
は試験したすべての組織中で特定された。

【０２２０】 α_１Ｈ−２をコードする核酸はＲＮＡの選択的スプライシングの結果であり、
ＴＴ細胞ｃＤＮＡ、扁桃ｃＤＮＡ、尾状核ｃＤＮＡ、被殻ｃＤＮＡ、心臓ｃＤＮ
Ａ、腎臓ｃＤＮＡ、肝臓ｃＤＮＡを含む多数の組織と細胞からのＰＣＲ産物で検
出されたような、α_１Ｈ−１の９５７ヌクレオチド枠内欠失を持つ。ＰＣＲプラ
イマーは、（１）ヌクレオチド１３７３から１３９３でのα_１Ｈ−１のセンス鎖
に相当する５’プライマー、（２）ヌクレオチド２６５７から２６８０でのα_{１ Ｈ−１} のアンチセンス鎖に相当する３’プライマーであった。

【０２２１】 配列番号１２および１５はα_１Ｈ−１のヌクレオチド配列を示す。α_１Ｈ−１ のためのコード配列は、ヌクレオチド２４９より始まり、７３１０で終わる。（
配列番号１２および１５は小さな部分では異なり、たとえばアミノ酸２２３０（
塩基６９８３−６９８５）は配列番号１５ではアスパラギン酸（Ａｓｐ ＧＡＣ
）であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２ではグルタミン酸（Ｇｌｕ ＧＡＡ）である
。

【０２２２】 配列番号１６はα_１Ｈ−２スプライシング変異体のヌクレオチド配列を示す。
α_１Ｈ−２に対するコード配列は２４９で始まり６３５３で終わる。

【０２２３】 Ｂ．要約 全長α_１ＨＴ型チャネルサブタイプをコードする核酸クローンをＴＴ細胞より
単離した。他のすでにクローン化されたＨＶＡα_１サブユニットと全体的にヌク
レオチド配列形態が似ているが、α_１Ｈサブユニットは、大きなＩＩ／ＩＩＩド
メインループ、共通α_１相互作用部位の欠損、変化したイオン選択性特性を含む
、いくつかの通常でない特徴を含んでいた。α_１Ｈ−１およびα_１Ｈ−２と命名
された２つのα_１Ｈのアイソフォームを特定した。第一のα_１Ｈ−１は、大きい
方であり、第２のα_１Ｈ−２は小さい方であり、α_１Ｈ−１のＩＩ−ＩＩＩルー
プ内に９５７ヌクレオチド欠失を含んでいるα_１Ｈ−１のヌクレオチド配列を配
列番号１２および１５に示し、α_１Ｈ−２のそれを配列番号１６に示す。α_{１Ｈ −２} は、α_１Ｈ−１の９５７ヌクレオチド欠失を含み、その結果ドメインＩＩお
よびＩＩＩ間の細胞内ループ中から３１９アミノ酸（α_１Ｈ−_１のアミノ酸４７
０−７８８）を欠失している。スプライシング変異体欠失を、試験したすべての
細胞および組織内でのＰＣＲによって同定した。これらはＴＴ細胞、扁桃、尾状
核、被殻、心臓、腎臓および肝臓細胞を含む。脳内では、扁桃、尾状核、被殻で
主として発現している。腎臓、肝臓および心臓では高いレベルである。α_{１Ｈ− １} に対するコード配列はヌクレオチド２４９で始まりヌクレオチド７３１０で終
わる一方、α_１Ｈ−２の配列はヌクレオチド２４９で始まりヌクレオチド６３５
３で終わる。

【０２２４】 ポリクローナル抗血清をα_１Ｈサブユニットの推定ＩＩ−ＩＩＩ細胞内ループ
領域に対して調製した。ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現の後、適切な大き
さのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって検
出した。ヒトα_１Ｈチャネルの機能特性を実施例３に示す。

【０２２５】 実施例３ α_１Ｈ−１およびα_１Ｈ−２サブユニットを含むチャネルの生物理
学的、薬理学的特性 Ａ．材料と方法 カルシウムチャネルサブユニットの生物理学的および薬理学的研究の材料と方
法を、すでにクローン化されているサブユニットを参照しながら本実施例と実施
例４で記述する。これらの方法あるいは当業者に知られている他の同様の方法を
、本実施例で記載されているように、ヒトα_１Ｈ−１サブユニットのこれらの特
性を研究するために使用した。

【０２２６】 電気物理学：ＨＥＫ２９３細胞を、標準Ｃａ^２＋リン酸手法（たとえば以下の
実施例、またトランスフェクション手法としてＷｉｌｌｉａｍｓら（１９９２）
Ｎｅｕｒｏｎ、８：７１−８４を参照のこと）により、６μｇ ｐｃＤＮＡ１α _１Ｈ ＲＢＳを用いて一過性トランスフェクタントした。ヒトＣＤ発現プラスミド
であるｐＣＭＶＣＤ４を、トランスフェクトされた細胞を特定するためのマーカ
ーとしてトランスフェクション中に含めた。データ記録の前に、細胞を哺乳類リ
ンガー液にて洗浄し、Ｍ−４５０ ＣＤ４ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ
Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の１／１０００希釈を含む溶液中
およそ１０分間インキュベートし、過剰ビーズを取り除くために哺乳類リンガー
液にて再洗浄した。全細胞パッチクランプ技術を用いてトランスフェクションに
引き続きトランスフェクトした細胞内のα_１Ｈチャネルの機能的発現を２４−４
８時間評価した。すべてのデータ記録を室温（１９−２４℃）にて単一細胞で行
った。全細胞イオン流をＡｘｏｐａｔｃｈ−２００Ａ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）あるいはａｎＥＰＣ−９（ＨＥ
ＫＡ ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ， Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）パッ
チクランプ増幅器を用いて記録し、１ｋＨｚ（−３ ｄＢ、８−極Ｂｅｓｓｅｌ
フィルター）で低通過濾波し、特記しない限り、１０ｋＨｚの速度でデジタル化
した。ピペットをボロシリカガラス（ＴＷ１５０、ＷＰＩ、Ｓａｒａｓｏｔａ、
ＦＩ）より作製し、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｉｄｌａｎｄ
， ＭＩ）でコートし、内部溶液で満たしたとき１．１−２．０Ωの抵抗を持た
せた。直列抵抗は２−５ＭΩであって、７０−９０％直列抵抗補正を一般的に使
用した。ピペット溶液は１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、Ｃｓ−ＯＨにて調製）を含ん
だ。外部溶液は、１５ｍＭ ＢａＣｌ_２あるいはＣａＣｌ_２、１５０ｍＭ コリ
ンＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＴＥＡ−ＯＨおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ７．３、ＨＣｌで調整）を含んだ。単一チャネルデータ記録をパッチク
ランプ技術の細胞結合構造を用いて入手した。ピペット溶液は１１０ｍＭ Ｂａ
Ｃｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、ＴＥＡ−ＯＨにて調整）を含んだ
。個々のＨＥＫ２９３細胞の膜電位を１４０ｍＭアスパラギン酸カリウム、５ｍ
Ｍ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．３）を含む溶液でゼロに
設定した。単一チャネルデータ記録における膜電位は液体接合電圧オフセット（
＋１２ｍＶ）について補正しなかった。線形リークおよび残余容量イオン流をＰ
／４手順を用いてオンラインで削除し（全細胞記録）、なんの活性も持たない状
態で単一チャネル掃引をはかった（単一チャネル記録）。

【０２２７】 薬剤：ミベフラジル（Ｒｏ４０−５９６７）を、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲ
ｏｃｈｅ氏よりいただいた。ニモジピンおよび（−）Ｂａｙ Ｋ−８６４４をＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）より入手
した。ペプチド毒素ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ（コノトキシン）およびω−ＣｍＴ
ｘ ＭＶＩＩＣ（コノトキシン）をＢａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ， Ａ）よ
り入手した。すべての残りの化合物をＳｉｇｍａより入手した。保存溶液をジメ
チルスルフォキシド（アミロライド、ニモジピン）、エタノール（（−）Ｂａｙ
Ｋ−８６４４）、あるいは水（ベラパミル、ミベフラジル、エトスクシミド、
ω−ＣｍＴｘ ＧＶＩＡおよびω−ＣｍＴｘ ＭＶＩＩＣ）中で調製し、４℃で
保存した。薬剤を保存溶液よりそれぞれの実験日に新たに調製し、＜０．５ｍｌ
／分の流速にて蠕動ポンプによって適用した。最終試験溶液中の最大溶媒濃度は
＜０．１％である。これらの濃度において、これらの溶媒はα_１Ｈ媒介イオン流
になんの影響も及ぼさない。

【０２２８】 アフリカツメガエル卵母細胞研究： アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｌａｅｖｉｓ）をＮａｓｃｏ（Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、 Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ）より購入した。卵母細胞を８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ、０．８
２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび
１．５ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ， Ｆｒｅｅｈｏ
ｌｄ ＮＪ：タイプ４、１．５時間およびその後Ｓｉｇｍａ Ｓｔ． Ｌｏｕｉ
ｓ ＭＯ、タイプ１Ａ、０．５時間）を含む無Ｃａ^２＋溶液中でインキュベート
した。コラゲナーゼ処理に引き続き卵母細胞を８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．９１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．３３ｍＭ
Ｃａ（ＮＯ_３）_２、２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３および１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含
んだカエルリンガー液に移した。これらの条件下、濾胞細胞層を手で除去する必
要はなかった。卵母細胞にα_１Ｈサブユニットをコードするインビトロ転写物の
５０ｎｇ（１μｇ／ｍｌ）を注入し、記録の前に１９℃で３−５日間インキュベ
ートした。インキュベート培養液はペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍ
ａ；１０ｍｌ／Ｌ）、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ；１ｍｌ／Ｌ）および５％心
不活性ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むカ
エルリンガー液であった。マイクロエレクトロビーズを水平引き抜き器具（Ｍｏ
ｄｅｌ Ｐ８０， Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｖａｔｏ，
ＣＡ）上に引き抜き、３ Ｍ ＫＣｌでみたした。そして０．５−２．０ＭΩ
の範囲での抵抗についてスクリーニングした。データをＧｅｎｅＣｌａｍｐ ５
００を用いて記録し、１−５ｋＨｚにてデジタル化し、ｐＣｌａｍｐあるいはＡ
ｘｏｇｒａｐｈソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いたオ
フライン分析のため磁気ディスク上に保存した。Ｂａ^２＋あるいはＣａ^２＋イオ
ン流をそれぞれｐＨ７．３で、３６ｍＭ ＴＥＡ−ＯＨ、２．５ｍＭ ＫＯＨ、
７５ｍＭマンニトール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭ Ｂａ（ＯＨ）_２ あるいはＣａ（ＯＨ）_２を含む溶液中で記録した。イオン流をＰ／６手順を用い
てリーク控除した。Ｃａ^２＋活性化クロライドイオン流を遮断するため、ニフル
ム酸（３００μＭ）をＢａ^２＋あるいはＣａ^２＋へのα_１Ｈチャネルの相同的透
過性を測定する実験に含めた。すべての値は特記しない限り平均±Ｓ．Ｄ．で報
告した。（上記）薬剤を重力−供給−灌流系によりアプライした。本明細書で使
用した濃度では、溶媒はα_１Ｈ−媒介イオン流になんの影響も与えない。

【０２２９】 Ｂ．電気物理学 １．イオン流−電圧特性 α_１Ｈ−１Ｃａ^２＋のはやい不活性化は強く電圧に依存している。イオン流減
少は、−５０と＋３０ｍＶの間の膜電位での４２．２±７．８から８．８±３．
８ｍｓｓの範囲の時間定数での指数関数によって最もよく示された（ｎ＝６、デ
ータは示していない）。α_１Ｈ−１Ｃａ^２＋チャネルの活性化動力学はまた、−
５０と＋３０ｍＶの間での膜電位に対する９．９±４．７から０．９±０．３ｍ
ｓｓの範囲の時間定数で電圧に依存していた（ｎ＝８、データは示していない）
。α_１Ｈ−１Ｃａ^２＋チャネルは１５０−ｍｓ脱分極の間完全に不活性化する。
不活性化からの回復は、速い成分（τ＝３７±９ｍｓｓ、すべてのチャネルの１
６．５±４．６％）および低成分（τ＝３７±６１ｍｓｓ、すべてのチャネルの
７８±８．５％、ｎ＝３、データは示していない）である〜３ｓの期間起こった
。ＨＥＫ２９３細胞の全細胞記録で観察された組換え体α_１Ｈチャネルの生物理
学的特性を確認するために、アフリカツメガエル卵母細胞中のα_１Ｈ機能発現を
試験した。α_１Ｈ転写物のみを注入した後の実質イオン流（＜１μＡ）を観察し
た。

【０２３０】 追跡からのＢａ^２＋あるいはＣａ^２＋に関するイオン流−電圧相互関係を決定
した。ＨＥＫ２９３細胞のα_１Ｈ−１サブユニットをコードするＤＮＡでの一過
性トランスフェクションに引き続き、急激に活性化し不活性化するＢａ^２＋イオ
ン流が観察された。−９０ｍＶの保持電位からの様々な試験電位への脱分極工程
から導き出したＢａ^２＋イオン流を測定した。イオン流は−５０ｍＶの試験電位
で活性化し、−２０と−１０ｍＶの間でピークに達し、＋６０ｍＶよりもより陽
性な膜電位に戻る。同様の結果を電荷担体としてＣａ^２＋（１５ｍＭ）で入手し
た。

【０２３１】 ２．活性化および不活性化の電圧依存性 図１はＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現しているヒトα_１Ｈカルシウムチャネ
ルの活性化（ｍ∞）および安定状態不活性化（ｈ）の電圧依存性を示す。活性化
（ｍ∞）の電圧依存性をテールイオン流分析により決定した。テールイオン流を
＋６０ｍＶでえられた最大ピークテールイオン流に関して標準化し、試験電位に
対してプロットした（オープンシンボル、平均±ＳＥＭ；ｎ＝１１）。データは
２次ボルツマン関数ｍｓ∞＝ＦＡ^＊［１＋ｅｘｐ（−（Ｖ_ｔｅｓｔ−Ｖ_{１／２， Ａ} ）／ｋ_Ａ）］^−１＋Ｆ_Ｂ ^＊［１＋ｅｘｐ（−（Ｖ_ｔｅｓｔ−Ｖ_{１／２，Ｂ}）／
ｋ_Ｂ）］^−１、Ｆ_Ａ＝０．６７、Ｖ_{１／２，Ａ}＝−２１．５ｍＶ、ｋ_Ａ＝７．５
、Ｆ_Ｂ＝０．３３、Ｖ_{１／２，Ｂ}＝２５．５ｍＶ、Ｋ_Ｂ＝１４．７の合計に適合
した。安定状態不活性化（ｈ∞）を−２０ｍＶ（ｐ１）、つづいて−２０ｍＶ（
ｐ２）までの２次試験パルスに先んじる５ｍＶ減少（ｐＨｏｌｄ）における２０
秒間の−１００ｍＶから−１０ｍＶまでのプレパルスによる−１００ｍＶの保持
電位より決定した。標準化したイオン流の大きさを保持電位に対してプロットし
た（クローズシンボル、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９）。データはボルツマン関数 ｈ
∞＝［１＋ｅｘｐ（（Ｖ_ｈｏｌｄ−Ｖ_１／２）／ｋ）］^−１、Ｖ_１／２＝−６３
．９ｍＶ、Ｋ＝３．９ｍＶに適合した。

【０２３２】 ３．テールイオン流非活性化 テールイオン流非活性化プロフィルを、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ
細胞中のα_１Ｈ−１カルシウムチャネルについて研究した。ＬＶＡチャネルの１
つの顕著な特徴は、その非活性化の低速度であり、これはテールイオン流の減少
を示すことに反映している。この減少の時間定数はＬＶＡチャネル（２−１２ｍ
ｓｓ）に対して、ＨＶＡチャネル＜３００ μｓに対してよりも１０倍遅い。〜
１５ｍｓｓの期間を超えるα_１Ｈ−１媒介テールイオン流の遅い減少が観察され
た。多くの天然Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルで報告されたテールイオン流の単指数的な
減少に比べて、α_１Ｈ−１チャネルからのテールイオン流は二次指数的減少を示
した。−２０ｍＶの試験電位において、全イオン流の８８．１±３３．８％を含
む示された成分の減少速度は２．１±１．０６ｍｓｓ（ｎ＝６）であり、これは
天然Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルで観察されたものと同じである。より速い成分の減少
速度は、０．６４±０．２１ｍｓｓ（ｎ＝６）であった。α_１Ｈ−１媒介テール
イオン流のゆっくりとした減少は１５ｍｓｓの期間を超えて観察された。

【０２３３】 Ｃａ^２＋チャネルを含むα_１Ｈ−１の活性化の電圧依存性をテールイオン流分
析より決定した。標準化したテールイオン流振幅を試験電位の関数としてプロッ
トしたところ、それは２つのボルツマン関数の合計によく適合した２相活性化曲
線を示した（図１）。個々のボルツマン項の半最大活性化の電位は、Ｖ_{１／２， Ａ} ＝−２５．１±３３．０ｍＶおよびＶ_{１／２，Ｂ}＝＋２５．５±３９．９ｍＶ
（ｎ＝１１）であった。Ｖ_{１／２，Ａ}と同様の値がすでにヒトＴＴ細胞株中での
Ｔ型Ｃａ^２＋チャネルの活性化の電位依存性において報告されてきた（−２７ｍ
Ｖ）。第２ボルツマン項Ｖ_{１／２，Ｂ}は、ＨＶＡＣａ^２＋チャネルについて報告
されてきたものと幾分同じである。同様の手順を用い、ＨＶＡＣａ^２＋チャネル
のテールイオン流は＜３００ μｓの時間定数によって減少する一方、α_１Ｈで
は試験電位でのもっとも顕著なものはＶ_{１／２，Ｂ}に近い。開口のためのＣａ^{２ ＋} チャネルを含むα_１Ｈの利用性は、図１で示したように電位に対する膜に依存
している。半最大定常状態不活性化電位（Ｖ_１／２）は−６３．２±２．０ｍＶ
（ｎ＝９）であった。

【０２３４】 ４．α_１Ｈチャネルの活性化および不活性化の動力学 図２はヒトα_１Ｈカルシウムチャネルの活性化（図２Ａ）および不活性化（図
２Ｂ）の動力学を示す。活性化および不活性化の動力学を、指数関数をイオン流
の増加（図２Ａ）および減少（図２Ｂ）相に適合させることで、イオン流追跡よ
り決定した。活性化および不活性化の電圧依存性はほぼ指数関数に従う。

【０２３５】 ５．不活性化からの回復 ＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現したα_１Ｈチャネルの−２０ｍＶまでの脱分
極パルスを用いた二重パルス手順を用いることで誘導される不活性化からの回復
を評価した。回復したチャネルの数をインターパルス間隔に対してプロットした
。データ点は式ｌ＝Ａｏ＋Ａ１ｅｘｐ（−ｔ／τ１）＋Ａ２ｅｘｐ（−ｔ／τｒ
２）、ｒ１：３５ｍｓｓ、Ａ１：０．１６５、ｒ２：３３７ｍｓｓ、Ａ２：０．
７８８の２次指数関数に適合した。

【０２３６】 ６．ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルからの単一チャネル記録 ＨＥＫ２９３内のα_１ＨＣａ^２＋チャネルの単一チャネル特性を電荷担体とし
ての１１０ｍＭ Ｂａ^２＋を用いて細胞接着記録で決定した。少なくとも３つの
α_１Ｈを含むパッチからの−３０ｍＶの試験電位での単一チャネル記録は、チャ
ネル開口が破裂で起こり、また主に１００−ｍｓ脱分極パルスの最初の３番目に
おいて、特に強い脱分極を伴って集中発生することを示した。時折チャネル活性
化は全範囲を通して広がっていた。１１０ｍＭＢａ^２＋で−３０ｍＶにおいて記
録した集団平均イオン流の時間経過は、１５ｍＭ Ｂａ^２＋で−４０ｍＶにて記
録したα_１Ｈ全細胞Ｂａ^２＋イオン流と同様であった。２価濃度の上昇による活
性化曲線のより陽極電位への移動を補うために、イオン流を異なる電位にて比較
した。単一イオン流電圧の関係が９．０６±０．２２ｐＳ（ｎ＝４）の単一傾斜
コンダクタンスを産出した。

【０２３７】 Ｃ．アフリカツメガエル卵母細胞内のヒトα_１Ｈカルシウムチャネルの生物理
学的特性付け １．概要 クローン化したヒトα_１Ｈカルシウムチャネルをアフリカツメガエル卵母細胞
内のα_１Ｈ−１ｍＲＮＡの一過性の発現によってさらに特性化した。α_１Ｈ−１ ｍＲＮＡだけの注入は結果、１５ｍＭ Ｂａ^２＋内でのデータ記録のとき、大き
なイオン流すなわち典型的には＞１μＡの発現をもたらした。α_１Ｈチャネルは
、−３０ｍＶと−４０ｍＶの間でのピーク反応を伴って、およそ−５０ｍＶにて
活性化された。これは低電圧活性化チャネルと一致する。α_１ＨチャネルのＣａ ^２＋ に対する透過性はＢａ^２＋に対してよりもわずかに高い。高電圧チャネルに
比べて、α_１Ｈチャネルはゆっくりと活性化され、（Ｉ−Ｖ曲線のピークでτ＝
５．７±１．０ｍｓｓであり−２０ｍＶで３．５±０．５ｍｓｓである）、素早
く不活性化された（Ｉ−Ｖ曲線のピークでτ＝１３．４±１．９ｍｓｓであり−
２０ｍＶで１２．２±１．５ｍｓｓであった）。卵母細胞に発現したα_１Ｈチャ
ネルは相対的に陰性膜電位での定常状態不活性化に感受性であり（Ｖ１／２＝−
６４．５±１．０ｍＶ）、不活性化から素早く回復した（回復のｒ〜３３０ｍｓ
ｓ）。これらの値はＨＥＫ２９３細胞で発現したα_１Ｈチャネルから入手したも
のにとても類似している。卵母細胞でのα_１Ｈチャネルを通したＢａ^２＋イオン
流は、それぞれＩＣ５０値 ６．３μＭおよび８．３μＭでのＮｉ^２＋およびＣ
ｄ^２＋による遮断に感受性であった。アンタゴニストの試験で、卵母細胞で発現
しているα_１Ｈチャネルを通したα_１Ｈ媒介Ｂａ^２＋イオン流をアミロライド（
ＩＣ５０〜１６μＭ）およびミベプラジル（ＩＣ５０〜２μＭ）のみ明らかに阻
害した。結果をまとめて考えると、α_１Ｈは低電圧活性化カルシウムチャネルサ
ブユニットを表していることが示される。

【０２３８】 ２．α_１ＨチャネルＢａ^２＋イオン流の活性化および不活性化特性 Ｂａ^２＋（１５ｍＭ）イオン流に対するイオン流−電圧関係をヒトα_１Ｈサブ
ユニットをコードするｍＲＮＡを注入した単一卵母細胞より記録した。Ｂａ^２＋ イオン流は、約−５０ｍＶの膜電位にて活性化され、−３０ｍＶにてピークに達
する。ヒトα_１Ｈチャネルの関連する不活性加速度を、異なる卵母細胞調製物に
おいて調査し、α_１Ａ−２α２ｂδβ４ａチャネル、α１Ｂ−１α２ｂδβ３ａ
チャネルおよびα１Ｅ−３α２ｂδβ１ｂチャネルの不活性化速度と比較した。
Ｂａ^２＋イオン流を、α_１Ｈチャネルに対して−１２０ｍＶから−３０ｍＶの範
囲での、あるいは他のそれぞれα_１Ａ、α_１Ｂおよびα_１Ｅ含有チャネルに対し
て−９０ｍＶから０ｍＶあるいは＋１０ｍＶまでの範囲での電圧制御を用いて導
き出した。示された結果は、高電圧活性化α_１Ａ−２α２ｂδβ４ａ、α１Ｂ−
１α２ｂδβ３ａおよびα１Ｅ−３α２ｂδβ１ｂカルシウムチャネルと比較し
たときのα_１Ｈチャネルの関連する電気陰性活性化範囲を表す。

【０２３９】 ３．アフリカツメガエル卵母細胞に発現したヒトα_１Ｈの浸透性、不活性化お
よび生物理学特性 ヒトα_１Ｈチャネルの浸透性および不活性化特性をＢａ^２＋およびＣａ^２＋イ
オン流を研究することで卵母細胞で調査した。この結果は、α_１Ｈサブユニット
を発現している卵母細胞においてＢａ^２＋イオン流がＣａ^２＋イオン流よりも有
意義に多くはないことを示す。示された結果は、α_１Ｈ媒介Ｂａ^２＋イオン流に
ついて標準化定常状態不活性化曲線を示し、ここでＶ_１／２は−６４．５±１．
０ｍＶの値と同じと計算された。二重パルス手順を、すなわちパルス間の時間間
隔を増加させて、不活性化からのα_１Ｈチャネルの回復を試験するのに用いた。
チャネルの相対的回復の結果をパルス間間隔（ｍｓ）に対してプロットし、その
結果は、３３０ｍｓｓ（ｎ＝５）の平均時間定数で、α_１Ｈチャネルイオン流を
すぐに不活性化から回復することを示した。

【０２４０】 ４．カドミウム、ニッケル、アミロライドおよびミベフリジルはヒトα_１Ｈチ
ャネルＢａ^２＋イオン流に拮抗する。 Ｃｄ^２＋は濃度依存様式で卵母細胞における低閾値ヒトα_１Ｈイオン流に拮抗
することがわかった。異なるＣｄ^２＋濃度で得たコントロールＢａ^２＋イオン流
の割合としてＣｄ^２＋の抑制をプロットすることによって、１０．３μＭのＩＣ _５０ を計算した。Ｎｉ^２＋もまた、濃度依存様式で卵母細胞における低閾値ヒト
α_１Ｈチャネルを拮抗することがわかった。Ｎｉ^２＋の異なる濃度（ｎ＝４、実
験：ｎ_Ｈ＝０．８４）によって産生されるＢａ^２＋イオン流の抑制を試験した。
計算したＮｉ^２＋に対するＩＣ_５０は６．３μＭであった。Ｎｉ^２＋およびＢａ ^２＋ による拮抗作用は十分に可逆的である。

【０２４１】 加えて、アミロライドおよびミベフリジルそれぞれが、アミロライドについて
１６１μＭの計算されたＩＣ_５０（７試験の平均、ｎ_Ｈ＝０．６２）およびビベ
フリジルについて平均２．１μＭ（４試験の平均、ｎ_Ｈ＝０．７１）を与える、
濃度依存様式での卵母細胞における低閾値Ｂａ^２＋イオン流を遮断した。

【０２４２】 これらの結果は、α_１Ｈサブユニットの細胞膜における機能的カルシウムチャ
ネルへの取込が、これらのチャネル上の低電圧活性化、特にＴ型カルシウムチャ
ネルの電気物理学的および生物物理学的特性をもたらすことを示している。α_{１ Ｈ} −含有チャネルは相対的負膜電位（すなわちＶ_１／２＝６４．５ｍＶ）ですば
やく活性化され、またすばやく（すなわち−２０ｍＶにおいてτ＝１２．２ｍｓ
ｓ）不活性化される。最大チャネル開口活性が−３０ｍＶの膜電位にて観察され
た。これらのチャネルはまたＣａ^２＋およびＢａ^２＋に対してほぼ同等の浸透性
を示した。

【０２４３】 α_１Ｈ含有チャネルの薬理学的特性も他の低閾値カルシウムチャネルのそれと
一致した。これらはＮｉ^２＋（ＩＣ_５０＝６．３μＭ）、Ｃｄ^２＋（ＩＣ_５０＝
１０．３μＭ）、アミロライド（ＩＣ_５０＝１６．１μＭ）およびミベドフラジ
ル（ＩＣ_５０＝２．１μＭ）にて遮断された。

【０２４４】 Ｄ．ＨＥＫ２９３細胞において発現されたヒトα_１Ｈサブユニット含有カルシ
ウムチャネルとアフリカツメガエル卵母細胞において発現されたそれとの比較 表４は、（１）ＨＥＫ２９３細胞において発現したヒトα_１Ｈ−１含有カルシ
ウムチャネル（２）アフリカツメガエル卵母細胞において発現したヒトα_{１Ｈ− １} 含有チャネル、（３）様々な組織に発現している天然Ｔ型カルシウムチャネル
の生物理学的特性を要約している。

【０２４５】

【表４】 要約ディスカッション α_１Ｈ−２の生物理学的特性は、α_１Ｈ−１に対する−６２．５ｍＶのＶ_{１／ ２} と比較して−７３ｍＶへの等時活性化（２０秒間）のＶ_１／２のシフトを示し
た。α_１Ｈ−２のＶ_１／２はしたがって、ある天然Ｔ型カルシウムチャネルに対
して報告された（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ （１９９６） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８：３２９−３４８）Ｖ_１／２値に近い範囲を示す。例え
ば同様の記録条件下、速度ドーサルホーンニューロン（ＤＨＮ）でのＴ−チャネ
ルにたういての等時不活性化のＶ_１／２は−８２ｍＶと報告され、一方速度脊髄
側部膝状関節ニューロン（ＬＧＮ）のＶ_１／２は−６４ｍＶである。加えて、α _１Ｈ−２ のＶ_１／２は、かわりにＬＧＮのＴ型カルシウムチャネルに対して記録
された値に近くなってくるα_１Ｈ−１に対する値と比較して、天然ラットＤＨＮ
でのＶ１／２により近くに近づく。したがって、観察されたα_１Ｈ−１およびα _１Ｈ−２ サブユニットのアミノ酸配列の相違は、これらのα_１Ｈチャネルの２つ
の異なる形の組織分布での相違と結びついているように見える。これらの結果は
また、観察された異なる組織におけるＴ型カルシウムチャネルのＶ_１／２不活性
化（−１００から−５０ｍＶ）について報告されてきた（Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ
（１９９６） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５８：３２９−３
４８を参照のこと）値の異なる広い範囲を理解するベースを提供する。

【０２４６】 Ｆ．ヒトα_１Ｈ含有カルシウムチャネルの生物理学的特性の要約 表５はヒトα_１Ｈサブユニットを含んでいるカルシウムチャネルの生物理学的
特性を要約する。

【０２４７】

【表５】 Ｇ．ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルの薬理学的特性 ＨＥＫ２９３細胞において発現したα_１ＨＣａ^２＋チャネルの、ＶＧＣＣ（以
下の表）に作用することが知られている多くの薬剤への感受性を試験した。α_{１ Ｈ} −媒介イオン流はＣｄ^２＋（ＩＣ_５０＝１０４μＭ）に対するのに比べてＮｉ ^２＋ （ＩＣ_５０＝６．６μＭ）について１６倍感受性であった。イオン流はまた
、Ｔ型チャネルアンタゴニストアミロライド（ＩＣ_５０＝１６７μＭ）およびミ
ベフラジル（１μＭで５１．０±１０．０％；ｎ＝５）によって遮断される。反
対に、Ｔ型チャネルアンタゴニストのエトスクシミドはα_１Ｈ媒介イオン流（３
００μＭで７．２±１．８％の抑制：ｎ＝５）を少ししか抑制しなかった。カル
シウムチャネルインヒビターベラパミル、Ｌ−型アンタゴニストニモジピンおよ
びＬ−型アンタゴニスト（−）−Ｂａｙ Ｋ ８６４４は１μＭの濃度でα_１Ｈ チャネルに小さな効果しか有していなかった。ニモジピンあるいは（−）−Ｂａ
ｙ Ｋ ８６４４のより高い濃度（１０μＭ）は明らかな抑制（それぞれ４３．
７±４．１％、ｎ＝４および１８．１％±９．１％、ｎ＝５）をおこした。１μ
Ｍの濃度でのペプチド毒素ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡおよびω−ＣｍＴｘ ＭＶＩ
ＩＣは、α_１Ｈ媒介イオン流を少なく抑制するかあるいは抑制しなかった。

【０２４８】 薬理学的研究によりα_１Ｈ−１含有チャネルの抑制の潜在力の以下の順位序列
がわかった。Ｎｉ^２＋（ＩＣ５０：６．６μＭ）〜ミベフラジル（１μＭにて５
１％）＞Ｃｄ^２＋（ＩＣ５０：１０４Ｍ）＞アミロライド（ＩＣ５０：１６７μ
Ｍ）＞＞エトスクシミド（３００Ｍにて７％）。ニモジピン、ベラパミル、ω−
ＣｇＴｘ ＧＶＩＡおよびω−ＣｍＴｘ ＭＶＩＩＣは１μＭの濃度で小さな効
果（０−１７％）しかなかった。これらの知見は、α_１Ｈ含有カルシウムチャネ
ルは天然ＬＶＡあるいはＴ−型カルシウムチャネルに相当する特性を持つことを
示している。

【０２４９】 表６はＨＥＫ２９３細胞で発現したヒトα_１Ｈ含有カルシウムチャネルの薬理
学的特性を要約する。ω−ＣｍＴｘ ＭＶＩＩＣを除いてすべての場合で電荷担
体は１５ｍＭＢａ^２＋であった。ω−ＣｍＴｘ ＭＶＩＩＣはより低い２価濃度
により感受性であるので、ω−ＣｍＴｘ ＭＶＩＩＣの場合電荷担体は２ｍＭＢ
ａ^２＋であった。％阻害の値は平均±ＳＤ（ｎ）である。ＩＣ_５０値は３から６
測定値からのデータポイントについてシグモイド曲線適合データ（Ｐｒｉｓｍ，
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ）より計算した。

【０２５０】

【表６】 実施例４ 哺乳類細胞でのヒト正常カルシウムチャネルサブユニットコードｃ
ＤＮＡおよびＲＮＡ転写物の組換え体発現 本実施例で記載した方法およびアッセイは、以下に例示したα_１サブユニット
の代わりにα_１Ｈサブユニットをコードする核酸を用いて使用してよい。特定の
興味は、ホモマー、モノマー、マルチマーとしてのα_１Ｈサブユニットのみ、あ
るいは選択したα_２サブユニットの混合を発現した細胞である。

【０２５１】 Ａ．ＤＧ４４細胞でのヒトニューロンカルシウムチャネルα_２サブユニットｃ
ＤＮＡの組換え体発現 １．ＤＧ４４細胞の安定トランスフェクション ＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ チャイニーズハムスター卵巣細胞、たとえばＵｒｌ
ａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．
Ｇｅｎｓｅｔ． １２：５５５−５６６を参照のこと）をコロンビア大学のＬａ
ｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ氏より入手し、トランスフェクトした細胞内の多シ
ストロン性の発現／分泌つのためにヒトニューロンカルシウムチャネルα_２サブ
ユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈｆｒベクターをＣａＰＯ_４沈殿法（Ｗｉｇ
ｌｅｒら（１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ７６：１３７３−１３７６）を用いて安定的にトランスフェクトした。トラ
ンスフェクタントを発現ベクターを組み込んだ細胞をスクリーニングするために
ヒポキサンチンあるいはチミジンなしの１０％ ＤＭＥＭ培養液上で増殖させた
。１２トランスフェクタント細胞株をこの培養液上でその生存能を示すために確
立した。 ２．トランスフェクトしたＤＧ４４細胞でのα_２サブユニットｃＤＮＡ発現の
分析 ヒトニューロンカルシウムチャネルα_２サブユニットｃＤＮＡを含んでいるｐ
ＳＶ２ｄｈｆｒを安定的にトランスフェクトしたＤＧ４４細胞株の４つよりＢｉ
ｒｎｂｏｉｍ（（１９８８） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１４８
７−１４９７）の手法により全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１レーンあたり〜１
５μｇ）を１％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分離し、ニトロセルロース
に写し、ランダムプライマー化ヒトニューロンカルシウムチャネルα_２ＤＮＡと
ハイブリッド形成させた（ハイブリッド形成：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰ
Ｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、４２℃、洗浄：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％Ｓ
ＤＳ、６５℃）。ヒトニューロンカルシウムチャネルα_２サブユニットｃＤＮＡ
を含んでいるｐＳＶ２ｄｈｆｒを安定的にトランスフェクトしたＤＧ４４細胞株
の４つからの総ＲＮＡノーザンブロット分析は、４つの細胞株の１つが２日間１
０ｍＭ酪酸ナトリウムの存在下で培養したとき、α_２サブユニットｃＤＮＡの転
写物（ｃＤＮＡの大きさを基本としたヌクレオチド５０００）と予想できた大き
さであるハイブリッド形成したｍＲＮＡを含むことを示した。酪酸塩は非特異的
に転写物を誘導し、しばしばＳＶ４０アーリープロモーター（Ｇｏｒｍａｎ，
ＣおよびＨｏｗａｒｄ， Ｂ（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １１：１６３１）を誘導するために用いられている。この細胞株４４α_２ −９はまた、α_２ｃＤＮＡ基礎プローブにハイブリッド形成したα_２ｃＤＮＡの
転写物（５０００ヌクレオチド）として予想される大きさよりより小さい（いく
つかの種）および大きい（６８００ヌクレオチド）ｍＲＮＡ種をも産生した。こ
のトランスフェクタントより産生した５０００−および６８００−ヌクレオチド
転写物はα_２サブユニットコード配列全体を含み、したがって全長α_２サブユニ
ットタンパク質を産するはずである。弱くハイブリッド形成している８０００ヌ
クレオチド転写物がトランスフェクトしていない、またトランスフェクトしたＤ
Ｇ４４細胞に存在した。見かけ上、ＤＧ４４細胞はカルシウムチャネルα_２サブ
ユニットあるいは類似遺伝子を低レベルで転写する。この内因性α_２サブユニッ
ト転写物の発現レベルは、ノーザン分析のためのＲＮＡの単離前に、細胞を酪酸
塩へさらすことにより影響を受けるようにはみられなかった。

【０２５２】 全タンパク質をヒトニューロンカルシウムチャネルα_２サブユニットｃＤＮＡ
を含むｐＳＶ２ｄｈｆｒを安定的にトランスフェクトしたＤＧ４４細胞株の３つ
より抽出した。およそ１０^７細胞を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ＰＭＳＦを含んでいる３００μｌの溶液中で超音波処理した。同用量の
２×ローディングダイ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． （１９７０） Ｎａｔｕ
ｒｅ ２２７：６８０）を標本に加え、タンパク質を８％ポリアクリルアミドゲ
ル上での電気泳動にかけ、そしてニトロセルロースに電気転写した。ニトロセル
ロースを、ウサギ骨格筋カルシウムチャネルα_２サブユニットに対して結合する
ポリクローナルギニーブタ抗血清（ｌｏｗａ大学のＫ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ氏より
入手した）（１：２００希釈）でインキュベートし、つづいて［^１２５Ｉ］−プ
ロテインＡでインキュベートした。ブロットを−７０℃でＸ線フィルムに感光さ
せた。トランスフェクトした細胞からのタンパク質の還元サンプルは、非トラン
スフェクトＤＧ４４細胞からのものと同様、ヒトニューロンカルシウムチャネル
のα_２サブユニット（１３０−１５０ｋＤａ）として予想される大きさの免疫活
性タンパク質を含んでいた。この免疫活性タンパク質のレベルは１０ｍＭ酪酸ナ
トリウムの存在下で増殖した４４α_２−９細胞において酪酸ナトリウムのない状
態で増殖した４４α_２−９細胞においてよりもより高かった。これらのデータは
、４４α_２−９および非トランスフェクトＤＧ４４細胞からの全ＲＮＡのノーザ
ン分析で入手したものとよく一致している。細胞株４４α_２−９は、全長α_２サ
ブユニットのタンパク質分解の産物あるいは、α_２サブユニットｃＤＮＡプロー
ブへハイブリッド形成したこの細胞株を産出するより小さな（＜５０００ヌクレ
オチド）ｍＲＮＡの１つの転写産物のどちらかである可能性のある１１０ ｋＤ
免疫活性タンパク質も産生する。

【０２５３】 Ｂ．ＨＥＫ細胞内のヒトニューロンカルシウムチャネルα_１，α_２およびβ_１ サブユニットをコードするＲＮＡの発現 ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）にカルシウムチャネルサブユニットをコ
ードするヒトニューロンＤＮＡを一過性におよび安定にトランスフェクトした。
個々のトランスフェクタントを電圧活性化バリウムイオン流の存在に対して電気
生理学的に分析し、機能的組換え体電圧依存カルシウムチャネルを分析した。

【０２５４】 １．ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション ヒトニューロンカルシウムチャネルα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコ
ードするＤＮＡを含む分離した発現ベクター、プラスミドｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ
）、ｐＨＢＣａＣＨα_２Ａ、およびｐＨＢＣａＣＨβ_１ａＲＢＳ（Ａ）をそれぞ
れ国際ＰＣＴ願書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号および許可米国願書番号第
０８／１４９，０９７ｇ号で記載のように構築した。これらの３つのベクターは
ＨＥＫ２９３細胞を一過性に共トランスフェクトするのに使用した。ＨＥＫ２９
３細胞の安定なトランスフェクションのためにβ_１サブユニットをコードするＤ
ＮＡをｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）およびｐＨＢＣａＣＨα_２Ａのみの細胞へ導入す
るために、ベクターｐＨＢＣａＣＨβ_１ｂＲＢＳ（Ａ）をｐＨＢＣａＣＨβ_１ａ ＲＢＳ（Ａ）の代わりに使用した。

【０２５５】 ａ．一過性トランスフェクション 発現ベクターｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）、ｐＨＢＣａＣＨα_２ＡおよびｐＨＢＣ
ａＣＨβ_１ａＲＢＳ（Ａ）をＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７
３）の一過性トランスフェクションの２つの組で使用した。１つのトランスフェ
クション手法においてＨＥＫ２９３細胞をα_１サブユニットｃＤＮＡ発現プラス
ミド、α_２サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド、β_１サブユニットｃＤＮＡ発
現プラスミドおよびプラスミドｐＣＭＶβｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）によって一過性に共トラン
スフェクトした。プラスミドｐＣＭＶβｇａｌはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーターに融合した（大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃ
Ｚ遺伝子を含み、トランスフェクションの効率をモニターするためのマーカー遺
伝子として本トランスフェクションに含まれた。他のトランスフェクション手順
において、ＨＥＫ２９３細胞にα_１サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミドｐＶＤ
ＣＣＩＩＩ（Ａ）およびｐＣＭＶβｇａｌを共トランスフェクションした。両方
のトランスフェクションにおいて、１０ｃｍ組織培養プレート中の２−４×１０ ^６ ＨＥＫ２９３細胞に一般的なＣａＰＯ_４沈殿トランスフェクション手法（Ｗｉ
ｇｌｅｒら（１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ７６：１３７３−１３７６）に従った実験において含まれたそれぞれのプ
ラスミド５μｇを一過性に共トランスフェクトした。トランスフェクタントをβ
−ガラクトシダーゼおよびＸ−ｇａｌ基質を含む反応産物の直接着色（Ｊｏｎｅ
ｓ， Ｊ．Ｒ． （１９８６） ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２）によって
、およびβガラクトシダーゼ活性測定（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ． （１９７２
） Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
ｐｐ．３５２−３５５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ
）によってβガラクトシダーゼ発現について分析をした。これらのトランスフェ
クタントのサブユニットｃＤＮＡ発現を評価するために、細胞をサブユニット転
写産生（ノーザン分析）、サブユニットタンパク質産生（細胞溶解物のイムノブ
ロット分析）および機能的カルシウムチャネル発現（電気生理学的分析）につい
て分析した。

【０２５６】 ｂ．安定トランスフェクタント ＨＥＫ２９３細胞をリン酸カルシウムトランスフェクション手法（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖ
ｏｌ．１， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔ １４，Ｕｎｉｔ ９．１．１−９．１．９ （１９９０））を用いてトラン
スフェクトした。それぞれ１００万から２００万のＨＥＫ２９３細胞を含む１０
ｃｍプレートを５μｇ ｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）、５μｇ ｐＨＢＣａＣＨα_２ Ａ、５μｇ ｐＨＢＣａＣＨβ_１ｂＲＢＳ（Ａ）、５μｇ ｐＣＭＶβｇａｌ
および１μｇｐＳＶ２ｎｅｏ（選択可能マーカーとして）を含むＤＮＡ／リン酸
カルシウム沈殿 １ｍｌでトランスフェクトした。５００μｇのＧ４１８を含む
培養液中で１０−２０日間培養した後、コロニーを形成し、クローニングシリン
ダーを用いて単離した。 ２．ヒトニューロンカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを一過
性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の分析 ａ．βガラクトシダーゼ発現の分析 一過性トランスフェクタントを（国際ＰＣＴ願書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２
３０号および許可米国願書番号第０８／１４９，０９７号で記載のように調製し
た）細胞溶解液のβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｈ
． （１９７２） Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ， ｐｐ．３５２−３５５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ ｐｒｅｓｓ）および固定細胞の染色（Ｊｏｎｅｓ， Ｊ．Ｒ． （１９８６
） ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２）によってβ−ガラクトシダーゼ発現に
ついてアッセイした。このアッセイの結果はおよそ３０％のＨＥＫ２９３細胞が
トランスフェクトされたことを示した。

【０２５７】 ｂ．ノーザン分析 α_１、α_２およびβ_１サブユニットのそれぞれとｌａｃＺ遺伝子あるいはα_１ サブユニットとｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡを一過性にトランスフェクト
したＨＥＫ２９３より、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｔｒａｋキット（Ｉ
ｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によりｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡ
を単離した。このＲＮＡをアガロースゲル上の電気泳動にかけ、ニトロセルロー
スに写した。そしてこのニトロセルロースを以下の、ｌａｃＺ遺伝子、ヒトニュ
ーロンカルシウムチャネルα_１ＤサブユニットコードｃＤＮＡ、ヒトニューロン
カルシウムチャネルα_２サブユニットｃＤＮＡあるいはヒトニューロンカルシウ
ムチャネルβ_１サブユニットｃＤＮＡの放射標識化プローブの１つ以上でハイブ
リッド形成した。α_１サブユニットコードｃＤＮＡとハイブリッド形成した２つ
の転写物がα_１サブユニットコードｃＤＮＡおよびｌａｃＺ遺伝子をトランスフ
ェクトしたＨＥＫ２９３細胞内と同様にα_１，α_２およびβ_１サブユニットとｌ
ａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で検
出された。１つのｍＲＮＡ種はα_１サブユニットｃＤＮＡの転写物と予測された
大きさであった（８０００ヌクレオチド）。第２のＲＮＡ種はこの転写物と予測
された大きさより小さかった（４０００ヌクレオチド）。ｌａｃＺ遺伝子の転写
物と予測された大きさのＲＮＡを、ｌａｃＺ遺伝子配列にハイブリッド形成する
ことで、α_１、α_２およびβ_１サブユニットコードｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子を
トランスフェクトした細胞、およびα_１サブユニットｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子
をトランスフェクトした細胞で検出した。

【０２５８】 α_１，α_２およびβ_１サブユニットコードｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子をトラン
スフェクトした細胞からのＲＮＡもα_２およびβ_１サブユニットｃＤＮＡプロー
ブとハイブリット形成した。２つのｍＲＮＡ種がα_２サブユニットｃＤＮＡプロ
ーブへハイブリット形成した。１つの種はα_２サブユニットｃＤＮＡの転写物と
予測される大きさであった（４０００ヌクレオチド）。他の種はこの転写物の予
測される大きさより大きかった（６０００ヌクレオチド）。α_１，α_２およびβ _１ サブユニットコードｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子を共トランスフェクトした細胞
の複数のＲＮＡ種がβ１サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリット形成した
。βサブユニットｃＤＮＡ発現ベクターが２つの潜在的なｐｏｌｙＡ＋付加部位
を含むことから様々な大きさの複数のβサブユニット転写物が産生された。

【０２５９】 ｃ．電気物理学的分析 個々の一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をパッチクランプ技術
の全細胞変性（Ｈａｍｉｌｌら（１９８１） Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．
３９１：８５−１００）を用いて電圧依存バリウムイオン流の存在についてアッ
セイした。ｐＣＭＶβｇａｌのみで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３
細胞をこれらの実験の陰性対照としてバリウムイオン流についてアッセイした。
細胞をバリウムイオンを含んだバス溶液内においてイオン流担体を提供した。Ｎ
ａＣｌあるいはＫＣｌのかわりに塩化コリンをナトリウムチャネルおよびカリウ
ムチャネルを通したイオン流を除去するためにバス溶液の主要塩成分として使用
した。このバス溶液は１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含み、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（水酸
化ナトリウムあるいは水酸化テトラエチルアンモニウムにてｐＨを調整）でｐＨ
７．３に緩衝した。パッチピペットを１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ _２ 、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨを水酸化テトラエチルアンモニウムにて調整）を含む溶液に
浸した。セシウムおよびテトラエチルアンモニウムイオンはほとんどの型のカリ
ウムチャネルを遮断する。ピペットをＳｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ
、 Ｍｉｄｌａｎｄ、 ＭＩ）にてコートし、１−４メガオームに抵抗であった
。イオン流を、ＩＢＭ−互換ＰＣ上のＬａｂｍａｓｔｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、 Ｓｏｌｏｎｓ、 ＯＨ）データ収集基盤に接続したＡ
ｘｏｐａｔｃｈ ＩＣ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、 ＣＡ）増幅器をともなう５００メガオームのヘッドステージ抵抗器
を通して測定した。ＰＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を電圧
統御を行い、データを収集するために使用した。データをｐＣｌａｍｐあるいは
Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ、 Ｓｃｏｔｔｓ Ｖａｌｌｙ、 ＣＡ）プログラムにて分析した
。

【０２６０】 薬剤を加えるために、研究下細胞の数マイクロメーター内に位置させた「プッ
ファー」ピペットを圧力添加による溶液の添加に用いた。薬理学的特性化のため
に使用した薬剤をベイジング溶液と同様の溶液に溶解させた。ＤＭＳＯ内に準備
したＢａｙ Ｋ ８６４４（ＲＢＩ、 Ｎａｒｔｃｋ、 ＭＡ）の１０ｍＭ保存
溶液の試料を、添加する前に１５ｍＭ Ｂａ^２＋含有バス溶液にて最終濃度１μ
Ｍに希釈した。

【０２６１】 ２１の（ｌａｃＺ遺伝子発現ベクターｐＣＭＶβｇａｌのみを一過性にトラン
スフェクトした）陰性対照ＨＥＫ２９３細胞をイオン流を記録するためのパッチ
クランプ方法の全細胞変法によって分析した。たった１つの細胞が認識可能内部
バリウムイオン流を表示した。このイオン流は１μＭ Ｂａｙ Ｋ ８６４４の
存在によって左右されなかった。加えて、Ｂａ^２＋イオン流を示していなかった
４細胞へのＢａｙ Ｋ ８６４４の添加は結果としてなんのイオン流の発現も見
られなかった。

【０２６２】 α_１，α_２およびβ_１サブユニットコードｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子によるＨ
ＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション後の２日間、個々のトランスフェ
クタントを電圧依存性バリウムイオン流についてアッセイした。９つのトランス
フェクタントにおけるイオン流を記録した。１つの細胞のトランスフェクション
効率は他の細胞のトランスフェクション効率とは異なるので、個々のトランスフ
ェクタントの異種タンパク質の発現の度合いは異なり、いくつかの細胞は外来Ｄ
ＮＡを組み込んだりあるいは発現したりしない。内部バリウムイオン流をこれら
の９つのトランスフェクタントの内の２つで検出した。これらのアッセイにおい
て、膜の保持電位は−９０ｍＶであった。１μＭ Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在
下あるいは非存在下で記録した異なる試験電位およびイオン流への電圧連続段階
で膜は脱分極した。内部バリウムイオン流はＢａｙ Ｋ ８６４４の添加によっ
てその大きさが明らかに増幅された。もっとも大きい内部バリウムイオン流（〜
１６０ｐＡ）が膜を１μＭ Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下０ｍＶまで脱分極さ
せたときに記録された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下および比存在下で構築さ
れた記録と比較して、脱分極電圧に対してそれぞれの脱分極後記録したもっとも
大きいイオン流をプロットすることでえられたＩ−Ｖ曲線の比較は、Ｂａｙ Ｋ
８６４の存在下、電圧活性化イオン流の増幅を例示した。

【０２６３】 はっきりとしたテールイオン流をα_１，α_２，およびβ_１サブユニットコード
ｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＢ
ａｙ Ｋ ８６４４の存在下発生したイオン流の追跡で検出し、これは本トラン
スフェクトで記録された電圧活性化バリウムイオン流に対する組換え体カルシウ
ムチャネル応答性がＤＨＰ−感受性であると思われることを示している。

【０２６４】 内部バリウムイオン流を示した２つのトランスフェクトした細胞の２つめは膜
を−９０ｍＶから脱分極させたときに〜５０ｐＡイオン流を示した。このイオン
流はカルシウムチャネルブロッカーとして確立されている２００μＭカドミウム
によってほとんど完全にブロックされた。

【０２６５】 α_１サブユニットとｌａｃＺ遺伝子をコードするＤＮＡを一過性にトランスフ
ェクトした１０の細胞をトランスフェクションの２日後に全細胞パッチクランプ
法によって分析した。これらの細胞の内１つは３０ｐＡ内部バリウムイオン流を
示した。このイオン流は１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下で２倍に増幅し
た。さらに小さなテールイオン流がＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下で検出された
。これらのデータはＨＥＫ２９３でのヒトニューロンカルシウムチャネルα_１Ｄ サブユニットコードｃＤＮＡの発現が機能的ＤＨＰ−感受性カルシウムチャネル
を産出することを指し示す。

【０２６６】 ３．ヒトニューロンカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡを安
定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の分析 個々の安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３細胞の電気生理学的分析として記述されたように（国
際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、また許可米国明細番号第０８
／１４９，０９７号を参照のこと）、電圧依存バリウムイオン流の存在について
電気生理学的にアッセイした。環状ＡＭＰ−依存キナーゼ媒介リン酸化によるカ
ルシウムチャネル活性（Ｐｅｌｚｅｒ，ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｒｅｖ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１４：１０
７−２０７）を最大化するために、記録のいくつかにおいてｃＡＭＰ（ナトリウ
ム塩、２５０μＭ）をピペット溶液に加え、フォルスコリン（１０μＭ）をバス
溶液に加えた。これらの化合物が存在しようともせずとも質的に類似の結果が得
られた。

【０２６７】 バリウムイオン流をＢａｙ Ｋ ８６４４（１μＭ）の非存在下および存在下
で安定にトランスフェクトされた細胞より記録した。細胞がＢａｙ Ｋ ８６４
４の非存在下の−９０ｍＶの保持電位から−１０ｍＶまで脱分極したとき、はや
い非活性化テールイオン流を伴う約３５ｐＡのイオン流を記録した。Ｂａｙ Ｋ
８６４４の適用中、同一の脱分極化プロトコールはおよそ７５ｐＡのイオン流
を導き、これは増加され引き延ばされたテールイオン流を伴った。脱分極電圧の
連続の機能として、この同じ細胞から記録されたイオン流のピーク量を評価した
。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下の応答は増加しただけでなく、全イオン流−電
圧関係が約−１０ｍＶ移動した。したがって、Ｂａｙ ８６４４作用の３つの典
型的な特徴、すなわちイオン流量の増加、テールイオン流の延長、陰性に移動し
た活性電圧が観察され、これはこれらの安定にトランスフェクトされた細胞での
ＤＨＰ−感受性カルシウムチャネルの発現を明らかに指し示している。このよう
なＢａｙ Ｋ ８６４４の効果はｃＡＭＰあるいはフォルスコリンを用いても用
いなくてもトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３では観察されなかった。

【０２６８】 Ｃ．ヒトニューロンカルシウムチャネルサブユニットをコードするＤＮＡの発
現のためのｐＣＭＶ−基礎ベクターおよびｐｃＤＮＡ １−基礎ベクターの使用 １．構築物の準備 さらなる発現ベクターをｐＣＭＶを用いて構築した。ｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）
（国際ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、また許可米国明細書番
号第０８／１４９，０９７号を参照のこと）らの全長α_１Ｄ ｃＤＮＡ、ＨＢＣ
ａＣＨα_２（国際ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、また許可米
国明細書番号第０８／１４９，０９７号を参照のこと）からの３６００ｂｐＥｃ
ｏＲＩ断片上に含まれている全長α_２ｃＤＮＡ、およびｐＨＢＣａＣＨβ_１ｂＲ
ＢＳ（Ａ）（国際ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、また許可米
国明細書番号第０８／１４９，０９７号を参照のこと）からの全長β１サブユニ
ットｃＤＮＡを別々にプラスミドｐＣＭＶβｇａｌ内にサブクローン化した。プ
ラスミドｐＣＭＶβｇａｌをｌａｃＺ遺伝子をのぞくためにＮｏｔＩにて消化し
た。ｐＣＭＶと呼ばれるプラスミドの残ったベクター部分はＮｏｔＩ部位での平
滑末端であった。分離したＥｃｏＲＩ断片上に含まれた全長α_２コードＤＮＡお
よびβ_１コードＤＮＡを単離し、平滑末端化し、ｐＣＭＶのＣＭＶプロモーター
とＳＶ４０ポリアデニル化部位の間のＤＮＡに局在しているｐＣＭＶの平滑末端
化ベクター断片に別々に連結した。α_１ＤコードｃＤＮＡをｐＣＭＶと連結する
ために、ＣＭＶプロモーターの５’のすぐとＳＶ４０ポリアデニル化部位の３’
すぐのポリリンカーの制限部位をｐＣＭＶから取り除いた。ポリリンカーをＮｏ
ｔＩ部位に添加した。ポリリンカーを制限酵素認識部位の以下の配列を持った。
次いでｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）からのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片として単離され
たα_１ＤコードＤＮＡをＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間
に位置させるためにＸｂａＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＣＭＶに連結した。

【０２６９】 プラスミドｐＣＭＶはｐｃＤＮＡ１がそうであるようにＣＭＶプロモーターを
含むが、挿入したサブユニットコードＤＮＡと関連するスプライスドナー／スプ
ライスアクセプター部位の位置がｐｃＤＮＡ１と異なる。ｐＣＭＶへサブユニッ
トコードＤＮＡを挿入した後、スプライスドナー／スプライスアクセプター部位
はＣＭＶプロモーターの３’およびサブユニットコードＤＮＡ開始コドンの５’
に局在する。ｐｃＤＮＡ１にサブユニットコードＤＮＡを挿入した後、スプライ
スドナー／スプライスアクセプター部位はサブユニットｃＤＮＡ終止コドン３’
に局在する。

【０２７０】 ２．ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション ＨＥＫ２９３細胞にｐＣＭＶのα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットコードＤ
ＮＡ、あるいはｐｃＤＮＡ１（ベクターｐＶＤＣＣＩＩＩ（Ａ）、ｐＨＢＣａＣ
Ｈα_２ＡおよびｐＨＢＣａＣＨβ_１ｂＲＢＳ（Ａ）、それぞれ国際ＰＣＴ明細書
第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、また許可米国明細書番号第０８／１４９，
０９７号を参照のこと）のα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットコードＤＮＡを
トランスフェクションした。プラスミドｐＣＭＶβｇａｌをトランスフェクショ
ン効率の測定としてそれぞれのトランスフェクションに含めた。トランスフェク
タントのβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果（国際ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９４／０９２３０号、また許可米国明細書番号第０８／１４９，０９７号を参
照のこと）はＨＥＫ２９３細胞がｐＣＭＶ−およびｐｃＤＮＡ１−基礎プラスミ
ドと等しい効率でトランスフェクタントされたことを指し示した。しかしながら
ｐｃＤＮＡ１−基礎プラスミドは現在むしろカルシウムチャネルレセプターの発
現に使用される。

【０２７１】 Ｄ．ヒトニューロンカルシウムチャネルサブユニットをコードするＲＮＡのア
フリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞での発現 インビトロで準備されたヒトニューロンα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニット
をコードするＤＮＡの転写物の様々な組み合わせをアフリカツメガエル（Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内に注入した。α_１Ｄを含んだ組み合わせに
よるこれらの注入は電圧活性化バリウムイオン流を示した。

【０２７２】 １．転写物の準備 ヒトニューロンカルシウムチャネルα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコ
ードする転写物をｍＣＡＰｍｓＲＮＡ ＣＡＰＰＩＮＧ ＫＩＴ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 ＣＡ カタログ＃２００３５０）の使用説明書
にしたがって合成した。国際ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２３０号、
また許可米国明細書番号第０８／１４９，０９７号に記載のように、ｐｃＤＮＡ
１と、リボゾーム結合部位およびコード配列の８番目ＡＴＧコドンによって始ま
るα_１ＤｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＶＤＣＣＩＩＩ．ＲＢＳ（Ａ）、ｐ
ｃＤＮＡ１とα_２サブユニットｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＨＢＣａＣＨ
α_１Ａ、ｐｃＤＮＡ１とイントロン配列を欠きリボゾーム結合部位を含んでいる
β_１ＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＨＢＣａＣＨβ_１ｂＲＢＳ（Ａ）を制限消
化することで直線化した。α_１ＤｃＤＮＡ−およびα_２サブユニット−コードプ
ラスミドをＸｈｏＩ、β_１サブユニット−コードプラスミドをＥｃｏＲＶにて消
化した。ＤＮＡ挿入物をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。

【０２７３】 ２．卵母細胞の注入 アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を単離しコラ
ゲナーゼ処理にて脱小胞化し、注入後および記録前の２から５日間、１９−２５
℃で１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．６、２０μｇ／ｍｌ アンピシ
リンおよび２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン中に保持した。卵母細胞内に注入
したそれぞれの転写物の対して、全容量５０ ｎｌの細胞あたり６ｎｇの特異的
ｍＲＮＡを注入した。

【０２７４】 ３．細胞内電圧記録 注入した卵母細胞を２−電気オード電圧クランプ法（Ｄａｓｃａｌ，Ｎ． （
１９８７） ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２：３１７
）を用いて電位−依存バリウムイオン流について試験した。電圧統御を引き起こ
すために、そしてデータを入手し分析するためにｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ソフトウェアパッケージをＬａｂｍａｓｔｅｒ １２５ｋ
Ｈｚデータ収集インターフェイスと併せて用いた。Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅ
ｓｓｉｏｎａｌも本分析で使用した。イオン流信号を１−５ｋＨｚでデジタル化
し、適切にフィルタに通した。バス溶液は以下の４０ｍＭ ＢａＣｌ_２、３６ｍ
Ｍ テトラエチルアンモニウムクロライド（ＴＥＡ−Ｃｌ）、２ｍＭ ＫＣｌ、
５ｍＭ ４−アミノピリジン、０．１５ｍＭ ニフルム酸、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
，ｐＨ ７．６を含んだ。 ａ．ヒトニューロンカルシウムチャネルα_１，α_２およびβ_１サブユニットを
コードする転写物を注入した卵母細胞の電気生理学的分析 注入していない卵母細胞を２−電気オード電圧クランプ法を用いて試験し、と
ても小さい（２５ ｎＡ）内因性内部Ｂａ^２＋イオン流を分析した７つの細胞の
内ただ一つから検出した。

【０２７５】 α_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニット転写物を共注入した卵母細胞は−９０ｍ
Ｖあるいは−５０ｍＶの保持電位からの膜の過分極において持続内部バリウムイ
オン流を示した（１５４±１２９ ｎＡ；ｎ＝２１）。これらのイオン流は１４
０から７００ｍｓｓｅｃまでにわたる試験パルスを与えたときの小さな不活性化
を一般的に示した。電圧の連続に対する脱分極はおよそ−３０ｍＶで最初に現れ
、およそ０ｍＶでピークに達するイオン流を示す。

【０２７６】 ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４の適用はイオン流量を増加させ、細胞の再分極
において存在するテールイオン流を引き延ばし、イオン流活性化における過分極
化移動を引き起こす。Ｂａｙ Ｋ ８６４４はＤＭＳＯ内の保存溶液から鮮度良
く準備し、還流ポンプがとまった間、１０×濃度として直接６０μｌのバスに導
入した。細胞と接触した最終希釈薬剤溶液のＤＭＳＯ濃度は０．１％を超えるこ
とはなかった。コントロール実験では０．１％ ＤＭＳＯは膜イオン流になんの
影響も与えないことを示した。

【０２７７】 ＤＨＰアンタゴニストであるニフェジピン（保存溶液をＤＭＡＯ中で準備し、
Ｂａｙ Ｋ ８６４４の添加について記載したように細胞に添加した）はα_１Ｄ 、α_２およびβ_１サブユニットの転写物を共注入した卵母細胞内の内部バリウム
イオン流の相当な割合（９１±６％、ｎ＝７）遮断した。内部バリウムイオン流
の残余不活性化成分が一般的にニフェジピン添加後残る。内部バリウムイオン流
は５０μＭ Ｃｄ^２＋にて完全に遮断されるが１００μＭ Ｎｉ^２＋ではおよそ
１５％のみが遮断された。

【０２７８】 ω−ＣｇＴＸ−ＧＶＩＡのα_１Ｄ、α_２，およびβ_１サブユニットの転写物を
共注入した卵母細胞内の内部バリウムイオン流における効果を調査した。ω−Ｃ
ｇＴＸ−ＧＶＩＡ（Ｂａｃｈｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ）を
担体タンパク質を提供するために０．１％ シトクロームＣ（Ｓｉｇｍａ）を含
む１５ｍＭＢａＣｌ_２バス溶液に準備した。コントロール実験においてシトクロ
ームＣはイオン流になんの影響も与えないことが示された。−９０ｍＶ保持電位
から０ｍＶまでの電圧パルス連続を２０ｍｓｓｅｃ間隔にて記録した。２価カチ
オンによるωＣｇＴＸ結合の阻害を減少させるために、記録を１５ｍＭ ＢａＣ
ｌ_２、７３．５ｍＭ テトラエチルアンモニウムクロライド中で作製し、残った
成分は４０ｍＭ Ｂａ^２＋記録溶液に等しい。延長されたテールイオン流によっ
て区別されたＤＨＰ−感受性イオン流へのωＣｇＴＸの効果を決定するために、
Ｂａｙ Ｋ ８６４４をωＣｇＴＸの添加前に細胞に加えた。内部バリウムイオ
ン流は比較的高い濃度（１０−１５μＭ）のωＣｇＴＸにより弱く（５４±２９
％、ｎ＝７）可逆的に遮断された。試験イオン流および付随するテールイオン流
はωＣｇＴＸの添加後２から３分以内に次第に遮断されたが、ωＣｇＴＸをバス
よりフランジュしたとき双方とも部分的に回復した。

【０２７９】 ｂ．ヒトニューロンカルシウムチャネルα_１Ｄをコードする転写物あるいはα _１Ｄ と他のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析 α_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞
内の内部バリウムイオン流へのα_２およびβ_１サブユニットの貢献をα_１Ｄサブ
ユニットのみあるいはβ_１サブユニットあるいはα２サブユニットどちらかとの
組み合わせの発現によって評価した。α_１Ｄ ｃＤＮＡの転写物のみを注入した
卵母細胞において、なんのＢａ^２＋イオン流も検出されなかった（ｎ＝３）。α _１ およびβ_１コードＤＮＡの転写物を注入した卵母細胞において、イオン流の量
は少ないが、α_１Ｄ、α_２とβ_１コードＤＮＡの転写物を注入した細胞で観察さ
れたイオン流と似ている−９０ｍＶの保持電位からの膜の脱分極において小さな
（１０８±３９ ｎＡ）Ｂａ^２＋イオン流が検出された。α_１Ｄコードおよびβ _１ コードＤＮＡの転写物を注入した４つの卵母細胞のうち２つにおいてＢａ^２＋ イオン流が、α_１Ｄ、α_１，α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を
注入した卵母細胞で発現したＢａ^２＋イオン流のＢａｙ Ｋ ８６４４感受性と
にているＢａｙ Ｋ ８６４４への感受性を示した。

【０２８０】 α_１Ｄおよびα_２サブユニットをコードする転写物を注入した５つの卵母細胞
のうちの３つが−９０ｍＶの保持電位からの膜の脱分極においてとても小さなＢ
ａ^２＋イオン流（１５−３０ ｎＡ）を示した。これらのバリウムイオン流はＢ
ａｙ Ｋ ８６４４に対してほとんどあるいは全く応答を示さなかった。 ｃ．ヒトニューロンカルシウムチャネルα_２および／あるいはβ_１サブユニット
をコードする転写物を注入した卵母細胞の分析 α_１Ｈ、α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を共注入した卵母細
胞において検出された内部バリウムイオン流へのα_１Ｄ、α_１−サブユニットの
寄与を評価するために、ヒトニューロンカルシウムチャネルα_２および／あるい
はβ_１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞をバリウムイオン流
に対してアッセイした。α_２サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細
胞はなんの検出可能な内部バリウムイオン流も示さなかった（ｎ＝５）。β_１サ
ブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は脱分極の時に測定可能な（
５４±２３ ｎＡ：ｎ＝５）内部バリウムイオン流を示し、α_２およびβ_１サブ
ユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は、β_１コードＤＮＡのみの転
写物を注入した卵母細胞で検出されたものよりも約５０％大きい（８０±６１
ｎＡ：ｎ＝１８）内部バリウムイオン流を示した。

【０２８１】 β_１サブユニットあるいはα_２とβ_１サブユニットをコードする転写物を注入
した卵母細胞での内部バリウムイオン流は典型的に膜が−９０ｍＶの保持電位か
ら−３０ｍＶまで脱分極したときにまず観察され、膜が１０から２０ｍＶまで脱
分極したときにピークに達する。巨視的にはα_２とβ_１サブユニットをコードす
る転写物を、あるいはβ_１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞
でのイオン流は見分けがつかなかった。α_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットの
転写物を共注入した卵母細胞でのイオン流と比べて、これらのイオン流は試験パ
ルス間の有意な不活性化と保持電位への強い感受性を示した。α_２およびβ_１サ
ブユニットをコードする転写物を共注入した卵母細胞での内部バリウムイオン流
は通常１４０−ｍｓｅｃパルス間でピーク量の１０−６０％の不活性化され、α _１Ｄ 、α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を共注入した卵母細胞の
それと比べて有意により保持電位に感受性であった。α_１とβ_１サブユニットを
コードする転写物を共注入した卵母細胞の膜の保持電位を−９０から−５０ｍＶ
に変えることで、結果としてこれらの細胞の内部バリウムイオン流量が約８１％
（ｎ＝１１）減少した。それに比べてα_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコ
ードする転写物を共注入した卵母細胞で測定した内部バリウムイオン流は、保持
電位が−９０から−５０ｍＶに変化させた時におよそ２４％（ｎ＝１１）減少し
た。

【０２８２】 α_２とβ_１をコードする転写物を注入した卵母細胞で検出された内部バリウム
イオン流は、α_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を共注入
した卵母細胞で観察されたものと薬理学的に異なった。α_２とβ_１サブユニット
をコードする転写物を注入した卵母細胞はＢａｙ Ｋ ８６４４に対して非感受
性である内部バリウムイオン流を示した（ｎ＝１１）。ニフェジピンとα_２とβ _１ サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞で観察されたイオン流の
保持電位感受性のために、ニフェジピン感受性は測定するのが難しかった。しか
しながらα_２とβ_１サブユニットをコードする転写物を共注入した２つの卵母細
胞は、−５０ｍＶの保持電位より脱分極した時にニフェジピン（５から１０μＭ
）に非感受性である測定可能な（２５から４５ ｎＡ）内部バリウムイオン流を
示した。α_２とβ_１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞での内
部バリウムイオン流は、α_１Ｄ、α_２およびβ_１サブユニットをコードする転写
物を注入した卵母細胞で検出されたイオン流のように重金属に同様の感受性を示
した。

【０２８３】 ヒトニューロンα_２およびβ_１サブユニットをコードする転写物を注入した卵
母細胞で検出された内部バリウムイオン流は、非注入アフリカツメガエル卵細胞
でのカルシウムイオン流と似た薬理学的、生物理学的特性を持つ。このヒトニュ
ーロンカルシウムチャネルβ_１サブユニットのアミノ酸は膜貫通部位を形成する
ことができる疎水性部位を欠いているからである。組換え体β_１サブユニット単
独がイオンチャネルを形成するということはありそうもなくむしろ内因性α_１サ
ブユニットが卵母細胞に存在し、そのようなα_１サブユニットによって媒介され
る活性がヒトニューロンβ_１サブユニットの発現によって増加される。

【０２８４】 本発明の目的内容をいくつかの特異性を持って記述してきたが、当業者に対し
て明らかな修正を本発明の範囲から逸脱することなしに行ってよい。このような
修正が当業者に明らかであるので、本発明が付属の特許請求の範囲によってのみ
限定することが意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＨＥＫ細胞によって一過性に発現されるヒトα_１Ｈカルシウムチャネ
ルの活性化の電圧依存性（ｍ∞）と定常状態の不活性化（ｈ）を示す。活性化の
電圧依存性（ｍ∞）はテールイオン流分析から決定した。＋６０ｍＶで得た最大
ピークテールイオン流に関してテールイオン流を基準化し、試験電位に対してプ
ロットした（白丸、平均±ＳＥＭ；ｎ＝１１）。データを２つのボルツマン関数
の合計に当てはめた。ｍ∞＝ＦＡ^＊「１＋ｅｘｐ（−Ｖｔｅｓｔ−Ｖ_１／２，Ａ
）／ＫＡ）］１＋Ｆ_Ｂ ^＊［１＋ｅｘｐ（−（Ｖｔｅｓｔ−Ｖ_１／２，Ｂ）／ｋ_Ｂ ）］−１、Ｆ_Ａ＝０．６７Ｖ_１／２，Ａ＝−２１．５ｍＶ、ｋ_Ａ＝７．５、Ｆ_Ｂ ＝０．３３、Ｖ_１／２，_Ｂ＝２５．５ｍＶ、ｋ_Ｂ＝１４．７。定常状態不活性化
（ｈ∞）は、−２０ｍＶまでの試験パルス（ｐ１）、次いで−２０ｍＶまでの２
回目の試験パルス（ｐ２）の前に、５ｍＶずつ漸増する−１００ｍＶから−１０
ｍＶまでの２０秒間のプレパルス（ｐＨｏｌｄ）により、−１００ｍＶの保持電
位から決定した。基準化したイオン流の振幅を保持電位に対してプロットした（
黒丸、平均±ＳＥＭ；ｎ＝９）。データをボルツマン関数に当てはめた。ｈ∞＝
［１＋ｅｘｐ（（Ｖｈｏｌｄ−Ｖ_１／２）ｋ）］^−１、Ｖ_１／２＝−６３．９ｍ
Ｖ、ｋ＝３．９ｍＶ。

【図２】 図２は、ヒトα_１Ｈカルシウムチャネルの活性化（図２Ａ）と不活性化（図２
Ｂ）の動力学を示す；活性化と不活性化の動力学は、イオン流の上昇期（図２Ａ
）あるいは下降期（２Ｂ）に指数関数をあてはめて（活性化と不活性化について
の電圧依存性はほぼ指数関数に従う）イオン流追跡から決定した。

【図３】 図３は、α_１Ｈ−１サブユニットの特徴を図式的に表したものであり、４つの
ポア領域の各々にα_１Ｄとα_１Ｅを持つヒトα_１Ｈのアミノ酸配列アラインメン
トを示す；^＊は４つのポア領域の各々でイオン選択性に関わる残基を表す；膜内
外ドメインＩとＩＩの間のＬＶＡ関連α_１Ｈサブユニットに著しく大きなループ
がある。

【図４】 図４Ａは、−８０と−１０ｍＶの間で１０ｍｓの段階的脱分極後−９０ｍＶに
再分極して誘発したテールイオン流を示す。テールイオン流の測定に関して、計
動化／フィルター比は５０／１６ｋＨｚであった。テールイオン流の減衰を次の
式の二指数関数にあてはめた。Ｉ＝Ａ_０＋Ａ_１ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ_１）＋Ａ_２ｅｘ
ｐ（−ｔ／Ｔ_２）。テールイオン流の二指数減衰プロフィールは検討したすべて
の細胞（ｎ＝１２）で認められた。図４Ｂと４Ｃは、イオン流非活性化について
の時間定数Ｔ１とＴ２（図４Ｂ）及びイオン流フラクションＡ１とＡ２（図４Ｃ
）の電圧依存性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 13/00 ４Ｈ０４５ 13/00 25/00 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｆ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ストーダーマン，ケネス アメリカ合衆国、カリフオルニア・92106、 サン・デイエゴ、ロータス・ドライブ・ 3615 (72)発明者 ハーポルド，ミシエル アメリカ合衆国、ニユー・メキシコ・ 87505−4726、サンタ・フエ、エンシナ・ ロード・1462 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 AA35 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA34 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 BA63 BA80 CA04 CA09 CA11 CA12 DA02 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ13 QQ42 QQ53 QQ79 QR32 QR35 QR36 QR48 QR50 QR51 QR56 QR62 QR77 QR80 QS25 QS34 QX04 4B065 AA90X AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 BA35 NA14 ZA011 ZA012 ZA361 ZA362 ZA591 ZA592 ZA751 ZA752 ZA811 ZA812 ZC021 ZC022 4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 FA72 FA74 HA05

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物カルシウムチャネルの低電位で活性化されるサブユニッ
   トをコードする、単離された核酸断片。
2. 【請求項２】 サブユニットがα_１Ｈ−１サブユニットである、請求項１の
   核酸。
3. 【請求項３】 カルシウムチャネルが、哺乳動物のカルシウムチャネルであ
   る、請求項２の核酸。
4. 【請求項４】 上記サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、上
   記ヌクレオチド配列は、 （ａ） カルシウムチャネルのサブユニットをコードし、配列番号１２から１
   ６のいずれかに記載された塩基配列のコーディング部分を含むヌクレオチド配列
   、 （ｂ） α_１Ｈ−１サブユニットをコードし、高ストリンジェンシー条件下で
   、哺乳動物細胞の中に存在するｍＲＮＡ転写産物に相補的で、α_１Ｈ−１サブユ
   ニットをコードするＤＮＡとハイブリッド形成するヌクレオチド配列、 （ｃ） 配列番号１２から１６のいずれかによってコードされているアミノ酸
   配列を含むサブユニットをコードするヌクレオチド配列、および、 （ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかと縮退しているヌクレオチド
   配列から選択される、請求項２の単離された核酸断片。
5. 【請求項５】 サブユニットが、α_１Ｈ−１サブユニットまたはα_１Ｈ−２ サブユニットである、請求項２の分子。
6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれかの核酸によってコードされるα_１ サブユニットをコードする異種核酸を含む真核細胞。
7. 【請求項７】 さらに、カルシウムチャネルのα_２δサブユニットをコード
   する異種核酸を含む、請求項６の細胞。
8. 【請求項８】 異種核酸によってコードされるサブユニットを少なくとも１
   つを含む機能的異種カルシウムチャネルを有する、請求項６または７の真核細胞
   。
9. 【請求項９】 ＨＥＫ ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ア
   フリカミドリザル細胞、およびマウスＬ細胞からなる細胞より選択される、請求
   項６から８いずれかの真核細胞。
10. 【請求項１０】 カルシウムチャネルの少なくとも一つのサブユニットをコ
    ードする異種核酸を真核細胞に導入することを含み、上記サブユニットが請求項
    １から５のいずれかの核酸によってコードされている方法によって産生される、
    機能する異種カルシウムチャネルを有する真核細胞。
11. 【請求項１１】 両生類の卵母細胞である、請求項１０の真核細胞。
12. 【請求項１２】 異種カルシウムチャネルが、複数のα_１Ｈ−１サブユニッ
    トを含む、請求項８または請求項１０の真核細胞。
13. 【請求項１３】 α_１Ｈ−１サブユニットがホモマーを含む、請求項１２の
    真核細胞。
14. 【請求項１４】 さらに、カルシウムチャネルのα_２δサブユニットを含む
    、請求項１０から１３のいずれか一項の真核細胞。
15. 【請求項１５】 異種核酸がＴ型カルシウムチャネルをコードする、請求項
    １０の真核細胞。
16. 【請求項１６】 カルシウムチャネルのα_１Ｈ−１サブユニットをコードす
    るＲＮＡを細胞の中に導入すること、および、場合によっては、カルシウムチャ
    ネルのβサブユニット、α_２δサブユニット、および／またはγサブユニットを
    コードする核酸を細胞の中に導入することを含む方法によって産生され、異種カ
    ルシウムチャネルが異種核酸によってコードされる少なくとも一つのサブユニッ
    トを含み、異種イオンチャネルだけがカルシウムチャネルである、機能する異種
    カルシウムチャネルを有する請求項８の真核細胞。
17. 【請求項１７】 カルシウムチャネルのα_１Ｈ−１サブユニットをコードす
    るＲＮＡを細胞の中に導入すること、および、場合によっては、カルシウムチャ
    ネルのβサブユニット、α_２δサブユニット、および／またはγサブユニットを
    コードする核酸を細胞の中に導入することを含む方法によって産生され、異種カ
    ルシウムチャネルが異種核酸によってコードされる少なくとも一つのサブユニッ
    トを含む、機能する異種カルシウムチャネルを有する請求項８の真核細胞。
18. 【請求項１８】 ＨＥＫ ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、
    アフリカミドリザル細胞、マウスＬ細胞及び両生類の卵母細胞からなる細胞より
    選択される、請求項１７の真核細胞。
19. 【請求項１９】 両生類の卵母細胞からなる群から選択される、請求項１６
    の真核細胞。
20. 【請求項２０】 α_１Ｈサブユニットが、α_１Ｈ−１サブユニットまたはα _１Ｈ−２ サブユニットである、請求項６から１９いずれかの真核細胞。
21. 【請求項２１】 α_１Ｈサブユニットが、ヒトカルシウムチャネルのサブユ
    ニットである、請求項２０の真核細胞。
22. 【請求項２２】 α_１Ｈサブユニットを含むカルシウムチャネルの活性を調
    節する化合物を同定するための方法であって、 該化合物とカルシウムチャネル選択的イオンとを含む溶液に、請求項８から２
    １のいずれかの真核細胞を懸濁すること、 該細胞の細胞膜を脱分極すること、および、 細胞の中に流入するイオン流またはイオン流を検出すること、を含み、 異種カルシウムチャネルが、該細胞にとって異種であるＤＮＡまたはＲＮＡに
    よってコードされるカルシウムチャネルサブユニットを少なくとも一つ含み、 検出されるイオン流が、同じカルシウムチャネル選択的イオンは存在するが、
    該化合物は存在しないところで、同一の細胞、または実質的に同一の細胞を脱分
    極することによって生じるイオン流とは異なっている、上記方法。
23. 【請求項２３】 脱分極工程の前に、細胞に内在するカルシウムチャネルを
    実質的に不活性化させる保持電圧で細胞を維持する、請求項２２の方法。
24. 【請求項２４】 細胞が、両生類の卵母細胞であり、 異種サブユニットが、卵母細胞の中に注入された核酸によってコードされてお
    り、 また、該異種サブユニットが、α_１Ｈサブユニットを含む、請求項２３の方法
    。
25. 【請求項２５】 核酸によってコードされているサブユニットが、さらに、
    α_２δサブユニットを含む、請求項２４の方法。
26. 【請求項２６】 細胞がＨＥＫ細胞であり、異種サブユニットが異種核酸に
    よってコードされている、請求項２２から２５いずれかの方法。
27. 【請求項２７】 α_１Ｈサブユニットが、α_１Ｈ−１サブユニットまたはα _１Ｈ−２ サブユニットである、請求項２２から２６いずれかの方法。
28. 【請求項２８】 異種カルシウムチャネルが、細胞にとって異種であるＤＮ
    ＡまたはＲＮＡによってコードされるカルシウムチャネルサブユニットを少なく
    とも一つ含み、 少なくとも一つのサブユニットがα_１Ｈサブユニットであり、 検出されるイオン流が、同じカルシウムチャネル選択的イオンは存在するが、
    該化合物は存在しないところで、同一の細胞、または実質的に同一の細胞を脱分
    極することによって生じるイオン流とは異なっている、請求項２２の方法。
29. 【請求項２９】 請求項１から５のいずれかの核酸分子によってコードされ
    る、実質的に純粋なα_１サブユニット。
30. 【請求項３０】 カルシウムチャネルのα_１Ｈサブユニットをコードする請
    求項１のヌクレオチド配列からの、少なくとも１６個の実質的に連続した核酸塩
    基を含む、少なくとも１６塩基長のＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブ。
31. 【請求項３１】 カルシウムチャネルのサブユニットをコードする、少なく
    とも３０個の核酸塩基を含む、請求項２８のプローブ。
32. 【請求項３２】 カルシウムチャネルサブユニットのα_１Ｈサブユニットを
    コードする核酸を同定するための方法であって、少なくとも低ストリンジェンシ
    ー条件下で、請求項２８のプローブを、核酸断片のライブラリーとハイブリッド
    形成させること、およびハイブリッド形成した断片を選ぶことを含む、上記方法
    。
33. 【請求項３３】 ハイブリッド形成が高ストリンジェンシー条件下で行なわ
    れる、請求項３０の方法。
34. 【請求項３４】 カルシウムチャネルサブユニットをコードする核酸を発現
    する細胞または組織を特定するための方法であって、少なくとも低ストリンジェ
    ンシー条件下で、請求項３０または請求項３１のプローブを、該細胞または組織
    の中で発現するｍＲＮＡ、または該ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡとハイブリ
    ッド形成させること、および、それによって、該サブユニットをコードするｍＲ
    ＮＡを発現する細胞または組織を特定することを含む方法。
35. 【請求項３５】 ハイブリッド形成が高ストリンジェンシー条件下で行なわ
    れる、請求項３２の方法。
36. 【請求項３６】 コードされたサブユニットを発現させる条件下で、請求項
    １から５のいずれかの核酸分子を宿主細胞の中に導入することを含む、カルシウ
    ムチャネルサブユニットを産生させるための方法。
37. 【請求項３７】 細胞が真核細胞である、請求項３５の方法。
38. 【請求項３８】 カルシウムチャネルのα−サブユニットをコードする核酸
    によってコードされている、低電位で活性化されるチャネルまたはＴ型チャネル
    である、異種カルシウムチャネルを含む真核細胞。
39. 【請求項３９】 α−サブユニットが、配列番号１２から１６のいずれかに
    示されているアミノ酸配列を含む、請求項６から２１および３８のいずれかの真
    核細胞。
40. 【請求項４０】 配列番号１２の１５０６番目から２６２７番目のヌクレオ
    チドによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子。
41. 【請求項４１】 配列番号１２の１５０６番目から２６２７番目の塩基配列
    を含む、請求項４０の単離された核酸分子。
42. 【請求項４２】 ＲＮＡである、請求項１から５、４０および４１のいずれ
    かの核酸。
43. 【請求項４３】 ＤＮＡである、請求項１から５、４０および４１のいずれ
    かの核酸。
44. 【請求項４４】 カルシウムチャネルによって調節される一つ以上の転写調
    節因子に機能的に結合したレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物をコ
    ードする核酸をさらに含む、請求項８の細胞。
45. 【請求項４５】 低電位で活性化されるカルシウムチャネルの活性を調節す
    る化合物を特定するための方法であって、該化合物が存在するときの、請求項４
    ４の細胞におけるレポーター遺伝子の転写量を、該化合物が存在しないときの転
    写量、または、異種カルシウムチャネルが存在しないときの転写量と比較し、そ
    れによって、細胞の中で異種カルシウムチャネルの活性を調節する化合物を特定
    することを含む、上記方法。
46. 【請求項４６】 カルシウムチャネルが、ヒトのカルシウムチャネルである
    、請求項１から５、４０および４１のいずれかの核酸分子。
47. 【請求項４７】 低電位で活性化される（ＬＶＡ）カルシウムチャネルの活
    性を調節する化合物を特定するためのスクリーニングアッセイ法であって、 該試験化合物をＬＶＡカルシウムチャネルを発現する細胞と接触させる工程、 被験化合物を加える前後の細胞における、または、ＬＶＡチャネルを発現しな
    い比較用細胞におけるＬＶＡチャネルの活性を測定する工程、および、 化合物を加えた後の測定値が、化合物を加える前の測定値と異なるとき、また
    は、レセプターが存在するときの測定値が、レセプターが存在しないときの測定
    値と異なるときに、該被験化合物は低電位カルシウムチャネルの活性を調節する
    ものと判定する工程を含むスクリーニングアッセイ法。
48. 【請求項４８】 ＬＶＡをコードする核酸を細胞の中に導入することにより
    、コードされているＬＶＡを発現する条件下でＬＶＡチャネルを産生する、請求
    項４７の方法。
49. 【請求項４９】 ＬＶＡがＴ型チャネルである、請求項４７または請求項４
    ８の方法。
50. 【請求項５０】 ＬＶＡが、カルシウムチャネルのα_１Ｈサブユニットを含
    む、請求項４７から４９のいずれかの方法。
51. 【請求項５１】 細胞が、相対的コンダクタンスが約５ｐＳから約９ｐＳの
    Ｂａ^２＋の相対的コンダクタンス、約２ミリ秒から約８ミリ秒の活性化時間、約
    ６０ミリボルトから約２６ミリボルトの活性化Ｖ_１／２値の動力学値、約１０か
    ら約３０ミリ秒の不活性化時間、約−１００ミリボルトから約−５００ミリボル
    トの不活性化Ｖ_１／２値の動力学値、および、約２ミリ秒から約１２ミリ秒のテ
    ール脱活性化時間を有する低電位カルシウムチャネルを発現する、請求項４７か
    ら５０のいずれかの方法。
52. 【請求項５２】 単離された核酸分子が、カルシウムチャネルのα_１Ｈサブ
    ユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４７から５１のいずれか
    のスクリーニング方法。
53. 【請求項５３】 請求項４５および４７から５２のいずれかの方法によって
    特定される化合物。
54. 【請求項５４】 請求項１から５、４０および４１のいずれかの核酸によっ
    てコードされるサブユニットを含むチャネルを発現させる細胞において、ＬＶＡ
    型チャネルの活性を調節する化合物を特定することを含む、ＬＶＡ型カルシウム
    チャネルによって起こる疾患を治療するための化合物を特定するための方法。
55. 【請求項５５】 請求項５４の方法によって特定される化合物。
56. 【請求項５６】 請求項１から５、４０および４１のいずれかの核酸を導入
    することによって、コードされているサブユニットを含むチャネルが発現される
    ような条件下でチャネルを産生する、請求項５４の方法。
57. 【請求項５７】 疾患が、神経疾患、内分泌疾患、心血管疾患、泌尿器疾患
    、肝臓疾患、呼吸器疾患、および血管疾患から選択される、請求項５４または請
    求項５６の方法。