KR101141951B1 - 흑색종용 다중-항원 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드, 폴리펩티드 및 핵산, 및 암을 예방 및/또는 치료하는데 있어서의 당해 펩티드, 폴리펩티드 및 핵산의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 흑색종을 진단, 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다.
흑색종, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 다중-항원 벡터

Description

흑색종용 다중-항원 벡터{Multi-antigen vectors for melanoma}
본 발명은 암을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 다중-항원(multi-antigen) 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 흑색종을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 다중-항원 벡터에 관한 것이다.
고밀도 미세배열(microarray), SEREX, 면역조직화학 (IHC), RT-PCR, 윈-위치 하이브리드화 (ISH) 및 레이저 포획 현미경 (Rosenberg, Immunity, 1999; Sgroi et al, 1999, Schena et al, 1995, Offringa et al, 2000)과 같은 여러 기술의 도움으로 원발성 종양 세포 및 정상 세포의 발현 양상을 토대로 한 분자 동정이 크게 진전됨에 따라 종양-관련 항원(TAA)을 이용한 암 백신의 개발이 지난 몇 년 동안 크게 발전하였다. TAA는 종양 세포에 의해 발현되거나 과발현된 항원이며, 1 개 또는 수 개 종양에 특이적일 수 있으며, 예를 들어 CEA 항원은 결장직장, 유방 및 폐 암에서 발현된다. 스그로이 등(Sgroi et al., (1999))은, 레이저 포획 미세절개(micordissection) 및 cDNA 미세배열을 병용하여 침습 암종 및 전이 암종에서 차등적으로 발현되는 여러 유전자를 동정하였다. DNA 또는 바이러스와 같은 여러 전달 시스템이 사람 암에 대한 치료적 백신접종에 사용될 수 있으며[참조: Bonnet et al, 2000], 면역 반응을 일으킬 수 있고 또한 TAA에 대한 면역 내성을 약화시킬 수 있다. 특히, T-세포 공동-자극 분자, 예를 들면 B7.1 또는 사이토킨, 예를 들면 IFN-γ, IL2 또는 GM-CSF를 암호화하는 전이유전자(transgene)를 삽입함으로써, 종양 세포는 보다 면역원성이 될 수 있다. TAA 및 사이토킨 또는 공동-자극 분자의 공동-발현을 통해 효과적인 치료적 백신을 개발할 수 있다[참조 문헌: Hodge et al, 95, Bronte et al, 1995, Chamberlain et al, 1996].
암을 예방하거나 치료하기 위하여 면역 반응을 자극하는데 유용한 시약 및 방법론이 당업계에서 요구되고 있다. 본 발명은, 암 치료를 시도하던 중에 다른 사람들이 직면했던 수 많은 난관들을 극복하는 시약 및 방법론을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 암을 예방 및/또는 치료하기 위하여 환자에게 투여되는 다중-항원 벡터를 제공한다. 특히, 다중-항원 벡터는 하나 이상의 종양 항원("TA")을 암호화한다. 다중-항원 벡터는 또한 공동-자극 분자와 같은 면역 자극인자를 암호화하고/하거나 애주번트와 함께 투여될 수 있다.
도 1은 플라스미드 pALVAC.Tricom (#33) 및 pT1132의 구성도이다.
도 2는 플라스미드 pALVAC.Tricom (#33)의 DNA 서열 (서열번호 1 및 2)이다.
도 3은 플라스미드 pT1132의 DNA 서열 (서열번호 3 및 4)이다.
도 4는 플라스미드 pT3217의 구성도이다.
도 5는 플라스미드 pT3217의 DNA 서열 (서열번호 5 및 6)이다.
도 6은 예시적 NY-ESO-1 (서열번호 7), TRP-2 (서열번호 8), gp100 (서열번호 9), gplOOM (서열번호 10), MART-1 (서열번호 11), MAGE-1 (서열번호 12), MAGE-3 (서열번호 13), B7.1 (서열번호 14), LFA-3 (서열번호 15), 및 ICAM-1 (서열번호 16) 단백질의 아미노산 서열이다.
본 발명은 암을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 시약 및 방법론을 제공한다. 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 참조로서 포함된다.
일 태양으로, 본 발명은 암을 예방 및/또는 치료하기 위하여 하나 이상의 종양 항원("TA")에 대한 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 것이다. 특정 태양에서, 하나 이상의 TA가 조합될 수 있다. 바람직한 태양에서, 당해 면역 반응은, 예를 들어 종양 항원을 암호화하는 핵산 벡터, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 형태의 종양 항원 그 자체를 투여한 후, 숙주 세포 내에서 TA가 발현된 결과이다.
본원에서 사용된 "항원"은 항원이 투여되었던 숙주에서 면역 반응을 일으키는 분자(예를 들어, 폴리펩티드) 또는 이의 부분이다. 면역 반응은, 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체의 생성 및/또는 항원의 에피토프를 발현하는 세포에 대한 세포 면역 반응의 생성을 포함할 수 있다. 상기 반응은, 예를 들면 항체 생성을 증가시키거나, 항원에 대한 친화성이 증가한 항체를 생성시키거나, 세포 면역 반응을 증가(즉, 면역반응성 T 세포의 수 또는 활성을 증가)시킴으로써, 현재의 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 면역 반응을 일으키는 항원은 달리 면역원성 또는 면역원으로서 지칭될 수 있다. 본 발명을 기술하는 때에, TA는 "면역원성 표적"으로 지칭될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 면역원성 표적을 숙주에서 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다.
TA란 용어는 종양-관련 항원 (TAA) 및 종양-특이적 항원 (TSA) 둘 모두를 포함하며, 이때 암 세포는 당해 항원의 공급원이다. TAA는 종양 세포의 표면 상에서 정상 세포에서 관찰된 것 보다 더 많은 양으로 발현된 항원 또는 태아 발생 동안에 정상 세포에서 발현된 항원이다. TSA는 종양 세포에 특유하며, 정상 세포에서는 발현되지 않는 항원이다. TA는 또한 TAA 또는 TSA, 이의 항원성 단편, 및 이의 항원성을 보유하는 변형체를 포함한다.
통상적으로, TA는 이들의 발현 패턴, 기능 또는 유전적 기원에 따라 5개의 범주로 분류된다: 암-고환 (CT) 항원 (즉, MAGE, NY-ESO-1); 멜라닌세포 분화 항원 (즉, Melan A/MART-1, 티로신아제, gp100); 돌연변이성 항원 (즉, MUM-1, p53, CDK-4); 과발현된 '자가' 항원 (즉, HER-2/neu, p53); 및 바이러스 항원 (즉, HPV, EBV). 본 발명을 수행하기 위한 목적으로, 적합한 TA는, TA가 투여되었던 숙주에서 항-종양 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 모든 TA이다. 적합한 TA로는, 야생형 (즉, 천연적으로 존재하는 게놈에 의해 정상적으로 암호화된 것), 변형체 및 돌연변이체 뿐만 아니라 이의 다른 단편 및 유도체를 포함하여, 예를 들어 gpl00 [참조 문헌: Cox et al., Science, 264: 716- 719 (1994); 미국 특허 제6,500,919 B1호 및 WO 01/30847 - 잔기 162에 Val 보유 - "gplOOM"로서 지칭되기도 함; 미국 특허 제6,537,560 B1호 - 잔기 162에 Phe 보유], MART-1/Melan A [참조 문헌: Kawakami et al., J. Exp. Med., 180: 347-352 (1994); 미국 특허 제5, 874,560호), gp75 (TRP-1) [참조 문헌: Wang et al., J. Exp. Med., 186: 1131-1140 (1996)], TRP-2 [참조 문헌: Wang et al. 1996 J. Exp. Med. 184: 2207; 미국 특허 제5,831,016호 및 6,083,783호], 티로신아제 [참조 문헌: Wolfel et al., Eur. J Immunol., 24: 759-764 (1994); WO 200175117; WO 200175016; WO 200175007], NY-ESO-1 [참조 문헌: WO 98/14464; WO 99/18206; GenBank 수탁번호 제P78358호; 미국 특허 제5,804,381호], 흑색종 프로테오글리칸 [참조 문헌: Hellstrom et al. , J. Immunol., 130: 1467-1472 (1983)], MAGE 계열 항원 [즉, MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12, 51; Van der Bruggen et al., Science, 254: 1643-1647 (1991); 미국 특허 제6,235,525호; CN 1319611], BAGE 계열 항원 [참조 문헌: Boel et al., Immnunity, 2: 167-175 (1995)], GAGE 계열 항원 [즉, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182: 689-698 (1995); 미국 특허 제6,013,765호], RAGE 계열 항원 [즉, RAGE-1; Gaugler et at., Immunogenetics, 44: 323-330 (1996); 미국 특허 제5,939,526호), N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V [참조 문헌: Guilloux et at., J. Exp. Med., 183: 1173-1183 (1996)], pl5 [참조 문헌: Robbins et al. , J. Immunol. 154: 5944-5950 (1995)], β-카테닌 [참조 문헌: Robbins et al., J. Exp. Med., 183: 1185-1192 (1996)], MUM-1 [참조 문헌: Coulie et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980 (1995)], 사이클린 의존형 키나제-4 (CDK4) [참조 문헌: Wolfel et al., Science, 269: 1281-1284 (1995) ], p21-ras [참조 문헌: Fossum et at., Int. J. Cancer, 56: 40-45 (1994)], BCR-abl [참조 문헌: Bocchia et al., Blood, 85: 2680-2684 (1995)], p53 [참조 문헌: Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11993-11997 (1995)], pl85 HER2/neu [참조 문헌: erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med., 181: 2109-2117 (1995) ], 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) [참조 문헌: Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29: 1-2 (1994)]), 암종배아 항원(CEA) [참조 문헌: Kwong et al., R Natl. Cancer Inst., 85: 982-990 (1995), 미국 특허 제5,756,103호; 제5,274,087호; 제5,571,710호; 제6,071,716호; 제5,698,530호; 제6,045,802호; EP 263933; EP 346710; 및 EP 784483]; 암종-관련 돌연변이된 무신 [즉, MUC-1 유전자 산물; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662 (1993)]; EBV의 EBNA 유전자 산물 [즉, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys, 13: 53-80 (1992)]; 사람 파필로마바이러스의 E7, E6 단백질 [참조 문헌: Ressing et al., J. Immunol, 154: 5934-5943 (1995)]; 전립선 특이적 항원 [PSA ; Xue et al., The Prostate, 30: 73-78 (1997)]; 전립선 특이적 막 항원 [PSMA; Israeli, et al., Cancer Res., 54: 1807-1811 (1994)]; 개별특이적(idiotypic) 에피토프 또는 항원, 예를 들어 면역글로불린 개별특이형(idiotype) 또는 T 세포 수용체 개별특이형 [참조 문헌: Chen et al, J. Immunol., 153: 4775-4787 (1994)]; KSA [참조 문헌: 미국 특허 제5,348,887호], 키네신 2 [참조 문헌: Dietz, et al. Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7; 275 (3): 731-8], HIP-55, TGFβ-l 항-아폽토시스 인자(apoptotic factor) [참조 문헌: Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001; 58 (3): 177-83], 종양 단백질 D52 [참조 문헌: Bryne J. A., et al., Genomics, 35: 523-532 (1996)], H1FT, NY-BR-1 [참조 문헌: WO 01/47959], NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, NY-BR-96 [참조 문헌: Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY]가 포함된다. 이들 TA 중 어느 것은 단독으로 이용되거나 또는 공동-면역화 프로토콜에서 서로 병용될 수 있다.
바람직한 TA는 흑색종 세포에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. "흑색종"이란 용어는 예를 들어 흑색종, 전이성 흑색종, 멜라닌세포 또는 멜라닌세포 관련 모반 세포로부터 유래된 흑색종, 악성흑색종, 흑색상피종(melanoepithelioma), 흑색육종(melanosarcoma), 상피내 흑색종(melanoma in situ), 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma), 결절형 흑색종, 악성 흑자 흑색종(lentigo maligna melanoma), 말단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanoma), 침습성 흑색종(invasive melanoma) 및 가족성 비전형 몰 흑색종 (FAM-M: familial atypical mole and melanoma) 증후군을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 흑색종은, 예를 들어 염색체 비정상, 퇴행성 성장 및 발달 장애, 분열촉진제, 자외선(UV), 바이러스 감염, 유전자의 비적절한 조직 발현, 유전자 발현의 변화 또는 발암제로 인한 것이다.
특정 경우에는, 환자를 TA 및 다른 항원, 예를 들면 혈관형성-관련 항원("AA")으로 공동-면역화시키는 것이 유익할 수 있다. AA는 혈관의 유도 및/또는 지속적 발달과 관련된 세포와 연관된 면역원성 분자 (즉, 펩티드, 폴리펩티드)이다. 예를 들면, AA는 혈관의 일차 구조물인 내피 세포("EC") 상에 발현될 수 있다. 암이 암인 경우에, AA는 종양을 공급하는 혈관 내 또는 부근에서 발견되는 것이 바람직하다. AA에 대한 환자의 면역화는 바람직하게는 항-AA 면역 반응을 일으켜서, 이에 의해 종양 내 또는 부근에서 일어나는 혈관형성 과정이 방지되고/되거나 억제된다. AA의 예로는, "야생형" (즉, 천연적으로 존재하는 게놈에 의해 정상적으로 암호화된 것), 변형체, 돌연변이체 뿐만 아니라 기타 단편 및 유도체를 포함하여, 특히 혈관 내피 성장 인자 [즉, VEGF ; Bernardini, et al. J. Urol., 2001,166 (4): 1275-9; Starnes, et al. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. ; 2001, 122 (3): 518-23; Dias, et al. Blood, 2002,99 : 2179-2184], VEGF 수용체 [즉, VEGF-R, flk-1/KDR; Starnes, et al. J. Thorac. Cardiovasc. Surg, 2001,122 (3): 518-23], EPH 수용체 [즉, EPHA2; Gerety, et al. 1999, Cell, 4: 403-414], 표피 성장 인자 수용체 [즉, EGFR; Ciardeillo, et al. Clin. Cancer Res., 2001, 7 (10): 2958-70], 염기성 섬유아세포 성장 인자 [즉, bFGF; Davidson, et al. Clin. Exp. Metastasis 2000,18 (6): 501-7; Poon, et al. Am J. Surg., 2001, 182 (3): 298-304], 혈소판-유래된 세포 성장 인자 [즉, PDGF-B], 혈소판-유래된 내피 세포 성장 인자 [즉, PD-ECGF; Hong, et al. J. Mol. Med., 2001,8 (2): 141-8], 형질전환성 성장 인자 [즉, TGF-α; Hong, et al. J. Mol. Med., 2001, 8 (2): 141-8], 엔도글린(endoglin) [Balza, et al. Int. J. Cancer, 2001, 94: 579-585], Id 단백질 [Benezra, R. Trends Cardiovasc. Med., 2001, 11(6): 237-41], uPA, uPAR, 및 매트릭스 메탈로프로테인아제와 같은 프로테아제 [MMP-2, MMP-9; Djonov, et al. J. Pathol., 2001, 195(2): 147-55], 산화질소 신타제 [Am. J. Ophthalmol., 2001, 132(4): 551-6], 아미노펩티다제 [Rouslhati, E. Nature Cancer, 2: 84-90, 2002], 트롬보스폰딘 [즉, TSP-1, TSP-2; Alvarez, et al. Gynecol. Oncol., 2001, 82 (2): 273-8; Seki, et al. Int. J. Oncol., 2001, 19 (2): 305-10], k-ras [Zhang, et al. Cancer Res. , 2001, 61 (16): 6050-4], Wnt [Zhang, et al. Cancer Res., 2001, 61(16): 6050-4], 사이클린-의존형 키나제 [CDK; Drug Resist. Updat. 2000, 3(2): 83-88], 미세관 [Timar, et al. 2001. Path. Oncol. Res., 7(2): 85-94], 열 쇽크 단백질 [즉, HSP90 (Timar, supra)], 헤파린-결합 인자 [즉, 헤파린아제; Gohji, et al. Int. J. Cancer, 2001, 95(5): 295-301], 신타제 [즉, ATP 신타제, 티미딜레이트 신타제), 콜라겐 수용체, 인테그린 [즉, αυ3, αυβ5, α1β1, α2β1, α5β1], 표면 프로테오글리칸 NG2, AAC2-1 또는 AAC2-2가 포함된다. 이들 표적 중의 어떤 것은 단독으로, 또는 서로 함께, 또는 다른 제제와 함께 사용하여 본 발명을 수행하는데 적합할 수 있다.
핵산 분자는 하나 이상의 면역원성 표적을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 유도체, 예를 들어 ATCC 기탁물 중의 DNA 삽입체 내에 함유된 것으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"란 용어는 DNA 또는 RNA 서열을 말한다. 당해 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 동족체, 예를 들어 특히 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐-시토신, 슈도이소시토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시-메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소-펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카보닐-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노퓨린 등으로부터 형성된 분자를 포괄한다.
분리된 핵산 분자는, (1) 전체 핵산이 공급원 세포로부터 분리될 때 분리될 핵산 분자와 함께 천연적으로 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질의 약 50% 이상으로부터 분리된 것; (2) 천연 상태에서 핵산 분자에 연결된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 연결되지 않은 것; (3) 천연 상태에서 분리될 핵산 분자에 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 것 및/또는 (4) 거대 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 천연에 존재하지 않는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 핵산 분자는, 폴리펩티드의 제조시에 이를 사용하는 것을 방해하거나 또는 치료학적, 진단학적, 예방학적 또는 연구용으로 이를 사용하는 것을 방해하는, 이의 천연 환경에서 발견되는 모든 기타 오염성 핵산 분자(들) 또는 기타 오염물질이 실질적으로 부존재한다. 본원에서 사용되는 "천연적으로 존재하는" 또는 "천연의" 또는 "천연적으로 발견되는"이란 용어는, 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 사용될 때, 천연에서 발견되고, 사람에 의해 조작되지 않은 물질을 의미한다. 유사하게, 본원에서 사용된 "비-천연적으로 존재하는" 또는 "비-천연의"란 천연에서 발견되지 않거나 사람에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 의미한다.
2 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열을 비교하여 결정한다. 당업계에 공지된 바와 같이, "동일성"은 당해 분자를 구성하는 단위체 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기) 사이의 합치에 의해 결정되는 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 서열 관련도를 의미한다. 동일성은, 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, 알고리듬)에 의해 어드레스된 갭 얼라인먼트(존재하는 경우)를 가진 2 이상의 서열 중 보다 작은 것 사이의 동일한 합치 %를 측정한다. 핵산 서열 사이의 동일성은 당해 핵산 서열이 서로 하이브리드를 형성할 수 있는 능력에 의해 판정될 수 있다. 하이브리드화 과정을 정의할 때, "고도로 엄격한 조건" 및 "적당히 엄격한 조건"은 서열이 상보적인 핵산 쇄의 하이브리드화를 허용하고 현저히 불합치된 핵산의 하이브리드화를 배제하는 조건을 의미한다. 하이브리드화 및 세척을 위한 "고도로 엄격한 조건"의 예는 65 내지 68℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 42℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 및 50% 포름아미드이다 [참조 문헌: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ; Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Approach Ch. 4 (IRL Press Limited)]. "적당히 엄격한 조건"이란 용어는 "고도로 엄격한 조건" 하에서 일어날 수 있는 것보다 더 높은 수준의 염기쌍 불합치를 가진 DNA 이중체가 형성될 수 있는 조건을 의미한다. 적당히 엄격한 조건의 예는 50 내지 65℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 37 내지 50℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 및 20% 포름아미드이다. 예로써, 0.015 M 나트륨 이온 중의 50℃의 적당히 엄격한 조건은 약 21% 불합치를 허용할 것이다. 하이브리드화 동안에, 비-특이적 및/또는 기본수준 하이브리드화를 감소시킬 목적으로 하이브리드화 및 세척 완충제 중에 다른 제제를 포함할 수 있다. 예로는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 나트륨 도데실설페이트, NaDodS04, (SDS), 피콜(ficoll), 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (또는 또 다른 비-상보적 DNA), 및 덱스트란 설페이트가 있으나, 다른 적당한 제제도 또한 사용될 수 있다. 이들 첨가물의 농도 및 유형은, 하이브드화 조건의 엄격도에 실질적으로 영향을 주지 않으면서, 변화될 수 있다. 하이브리드화 실험은 통상적으로 pH 6.8 내지 7.4에서 수행되나; 전형적인 이온 농도 조건에서는, 하이브리드화의 속도는 pH와는 거의 무관하다.
본 발명의 바람직한 태양에서, 벡터가 면역원성 표적물을 암호화하는 핵산 서열을 세포로 전달하는데 사용된다. 벡터는 핵산 서열을 숙주 세포로 전달하는데 사용되는 모든 분자이다. 특정 경우에는, 발현 벡터가 사용된다. 발현 벡터는, 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 전달된 핵산 서열의 발현을 지시하고/하거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자이다. 발현은 전사, 해독 및 스플라이싱(인트론이 존재하는 경우)과 같은 과정을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로, 발현 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 플랭킹 서열을 포함한다. 플랭킹 서열은, 예를 들면, 동종성 (즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 주(strain)로부터 유래된 것), 이종성 (즉, 숙주 세포 종 또는 주 이외의 다른 종으로부터 유래된 것), 하이브리드 (즉, 하나 이상의 공급원으로부터 유래된 플랭킹 서열의 조합), 또는 합성일 수 있다.
플랭킹 서열은 바람직하게는 암호 서열의 복제, 전사 및/또는 해독에 영향을 미칠 수 있고 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 "작동가능하게 연결된"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 요소를 기능적 관계로 연결하는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는, 암호 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러나, 플랭킹 서열은, 정확하게 기능하는 한, 암호 서열과 반드시 연속적일 필요는 없다. 따라서, 예를 들면, 전사는 되지만 해독되지 않는 개재 서열이 프로모터 서열과 암호 서열 사이에 존재할 수 있고 프로모터 서열은 여전히 암호 서열에 작동가능하게 연결된 것으로 간주될 수 있다. 유사하게, 인핸서가 암호 서열의 상류 또는 하류에 위치하여, 서열의 전사에 영향을 줄 수 있다.
특정 태양에서, 플랭킹 서열은, 표적 세포 내에서 고-수준 유전자 발현을 유도하는 전사 조절 영역인 것이 바람직하다. 전사 조절 영역은 예를 들면 프로모터, 인핸서, 사이렌서(silencer), 레프레서(repressor) 요소 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 전사 조절 영역은 구성적, 조직-특이적, 세포-특이적 (즉, 다른 유형에 비해 특정 유형의 조직 또는 세포에서 고 수준의 전사를 유도하는 영역), 또는 조절성 (즉, 테트라사이클린과 같은 화합물과의 상호작용에 반응성) 일 수 있다. 전사 조절 영역의 공급원은 원핵 또는 진핵 생물체, 모든 척추 또는 무척추 생물체 또는 모든 식물일 수 있으나, 단 플랭킹 서열은 그 세포 내에서 핵산의 전사를 일으킴으로써 세포 내에서 기능을 발휘한다. 매우 다양한 전사 조절 영역이 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있다.
적합한 전사 조절 영역으로는 CMV 프로모터 (즉, CMV-즉시 초기(immediate early) 프로모터); 진핵생물 유전자 기원의 프로모터 (즉, 에스트로겐-유도성 닭 난(卵) 알부민(ovalbumin) 유전자, 인터페론 유전자, 글루코코르티코이드-유도성 티로신 아미노트랜스퍼라제 유전자, 및 티미딘 키나제 유전자); 및 주요 초기 및 후기 아데노바이러스 유전자 프로모터; SV40 초기 프로모터 영역 [참조 문헌: Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-10]; 라우스 육종 바이러스(RSV: Rous sarcoma virus)의 3' 장말단 반복체(LTR) 내에 함유된 프로모터[참조 문헌: Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97]; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK) 프로모터 [참조 문헌: Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45]; 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열[참조 문헌: Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42]; 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵 생물 발현 벡터[참조 문헌: Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31]; 또는 tac 프로모터 [참조 문헌: DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25]가 포함된다. 조직- 및/또는 세포-유형 특이적 전사 제어 영역은 예를 들어 특히 췌장의 샘꽈리 세포 내에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역[참조 영역: Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515]; 췌장의 베타 세포 내에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역[참조 문헌: Hanahan, 1985, Nature. 315: 115-22); 림프계 세포 내에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역[참조 문헌: Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44]; 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포 내의 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역[참조 문헌: Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95]; 간 내의 알부민 유전자 제어 영역[참조 문헌: Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76]; 간 내의 알파-태아 단백질(alpha-feto-protein) 유전자 제어 영역[참조 문헌: Krumlauf et al., 1985, MoL Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58]; 간 내의 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역[참조 문헌: Kelsey et al., 1987, Genes and DeveL 1: 161-71]; 골수 세포 내의 베타-글로빈 유전자 제어 영역 [참조 문헌: Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94]; 뇌의 희소돌기아교세포 내의 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역[참조 문헌:Readhead et al., 1987, Cell 48 : 703-12] ; 골격근 내의 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역[참조 문헌: Sani, 1985, Nature 314: 283-86]; 시상하부 내의 성선자극호르몬 방출 호르몬 유전자 제어 영역[참조 문헌: Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78], 및 흑색종 세포 내의 티로신아제 프로모터[참조 문헌: Hart, I. Semin Oncol 1996 Feb; 23 (1): 154-8; Siders, et al. Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct; 5 (5): 281-91]를 포함한다. 특정 화합물 또는 조건, 예를 들면 빛, 열, 방사선, 테트라사이클린 또는 열 쇽크 단백질의 존재하에서 활성화되는 유도성 프로모터가 또한 이용될 수 있다[참조 문헌: WO 00/10612]. 기타 적합한 프로모터가 당업계에 공지되어있다.
상기한 바와 같이, 인핸서는 또한 적합한 플랭킹 서열일 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 통상적으로 약 10 내지 300 bp 길이의 DNA의 시스-작용 요소이다. 통상적으로 인핸서는 배향- 및 위치-독립적이므로, 제어된 암호 서열의 5' 및 3' 모두에서 확인되었다. 포유동물 유전자로부터 구할 수 있는 몇몇 인핸서 서열이 공지되어있다 (즉, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아 단백질 및 인슐린). 유사하게, SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵 생물 프로모터 서열과 함께 사용될 수 있다. 인핸서는 핵산 암호 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있으나, 이는 통상적으로 프로모터의 5' 부위에 위치한다. 다른 적합한 인핸서가 당업계에 공지되어있으며, 본 발명에 이용될 수 있을 것이다.
본 발명의 시약을 제조하는 때에, 세포를 형질감염시키거나 형질전환시킬 필요가 있다. 형질감염은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 섭취를 의미하며, 외인성 DNA가 세포막 내로 도입되어졌을 때 세포는 형질감염되어진다. 수 많은 형질감염 기법이 당업계에 널리 공지되어있다[참조 문헌: Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 19S6) ; and Chu et al., 1981, Gene 13: 197]. 이러한 기법은 하나 이상의 외인성 DNA 잔기를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다.
특정 태양에서, 세포의 형질감염이 그 세포의 형질전환을 초래하는 것이 바람직하다. 세포의 특징 중에 변화가 있을 때 세포는 형질전환되므로, 새로운 핵산을 함유하도록 변형되어졌을 때 형질전환된다. 형질감염 후, 형질감염된 핵산은, 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합시킴으로써 세포의 핵산과 재조합될 수 있거나, 복제되지 않으면서 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 핵산이 세포의 분열과 함께 복제되는 경우, 세포가 안정하게 형질전환된 것이다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 면역원성 표적물의 단편의 발현을 제공한다. 단편은 아미노 말단 (리더 서열을 포함하거나 포함하지 않음) 및/또는 카복시 말단에서 절두된(truncated) 서열을 포함할 수 있다. 단편은 또한 변이체 (즉, 대립형질, 스플라이스), 오르토로그(ortholog), 동족체, 및 모(母) 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 부가 또는 치환 또는 내부 결실을 가진 기타 변이체를 포함할 수 있다. 바람직한 태양에서, 절두물 및/또는 결실물은 약 1 내지 5개 아미노산, 5 내지 10개 아미노산, 10 내지 20개 아미노산, 20 내지 30개 아미노산, 30 내지 40개 아미노산, 40 내지 50개 아미노산, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 단편은 임의로 아미노 말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 단편이 예를 들어 면역원성 표적물에 대한 항체 또는 세포 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있다고 본다.
변이체는 해당 서열에 비해 하나 이상의 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는 서열이다. 변이체는 천연적으로 존재하거나 인공적으로 작제될 수 있다. 이러한 변이체는 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다. 바람직한 태양에서, 변이체는 1 내지 3개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 1 내지 40개, 1 내지 50개, 또는 50개 이상의 아미노산 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실을 갖는다.
대립형질 변이체는, 생물체 또는 생물체 집단의 염색체 상의 소정의 유전자좌를 차지하는 서열의 여러 가능한 천연적으로 존재하는 대안 형 중의 하나이다. 스플라이스 변이체는 일차 전사체의 스플라이싱의 결과로 생성된 여러 RNA 전사체 중의 하나로부터 생성된 폴리펩티드이다. 오르토로그(ortholog)는 또 다른 종 기원의 유사한 핵산 또는 폴리펩티드 서열이다. 예를 들면, 면역원성 표적물의 마우스 및 사람 형은 서로 오르토로그로 간주될 수 있다. 서열의 유도체는, 모 서열로 부터 유래된 것으로서, 치환, 부가, 결실 또는 화학적으로 변형된 변이체를 갖는 서열 중의 하나이다. 변이체는 또한 융합 단백질을 포함하며, 이는 하나 이상의 제1 서열(예를 들면, 펩티드)가 하나 이상의 다른 서열(예를 들면 이종성 펩티드)의 아미노 카복시 말단에서 융합된 것을 의미한다.
"유사성"은 동일성 관련 개념이나, 단 유사성은 동일 합치 및 보존성 치환 합치 둘 모두를 포함하는 관련도의 척도를 의미한다. 두 개의 폴리펩티드 서열이 예를 들어 10/20 동일 아미노산을 갖고 나머지는 모두 비-보존적 치환인 경우에, 동일성 및 유사성 %는 모두 50% 일 것이다. 동일한 예에서, 5개 이상의 위치에 보존적 치환이 있는 경우에, 동일성 %는 50%를 유지하지만, 유사성 %는 75% (15/20)일 것이다. 따라서, 보존적 치환이 있는 경우에, 두 개의 폴리펩티드 사이의 유사성 %는 이들 두 폴리펩티드 사이의 동일성 % 보다 더 높을 것이다.
치환은 보존적 또는 비-보존적이거나, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 폴리펩티드의 서열에 대한 보존적 아미노산 변형 (및 암호화 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형)은, 모(母) 폴리펩티드와 유사한 기능 및 화학적 특징을 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 예를 들면, "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기가 그 위치에서 당해 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 영향을 거의 주지 않거나 전혀 주지 않으며, 특히 면역원성을 감소시키지 않도록, 비-천연 잔기로 치환되는 것을 포함할 수 있다. 적합한 보존적 아미노산 치환은 표 I에 제시된다.
Figure 112006015634313-pct00001
당업자는 익히 공지된 기법을 이용하여 면역원성 표적의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 생물학적 활성(예: MHC 결합성, 면역원성)을 파괴하지 않으면서 변화시킬 수 있는 적당한 분자 영역을 확인하기 위하여, 당업자는 당해 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들면, 동일한 종 또는 다른 종으로부터의 유사한 활성을 가진 면역원성 표적이 공지된 경우에, 당업자는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 이러한 유사한 폴리펩티드와 비교할 수 있다. 이러한 분석을 수행함으로써, 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 이러한 유사한 면역원성 표적에 비해 보존되지 않는 분자 영역 내의 변화가 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 악영향을 줄 가능성은 적을 것이라고 생각된다. 유사하게, MHC에 대한 결합에 요구되는 잔기가 공지되었으며, 이는 결합을 개선시키도록 변형될 수 있다. 그러나, MHC에 대한 결합을 감소시키는 변형은 대부분의 경우에 적당하지 않을 것이다. 당업자는 또한 비교적 보존된 영역 내일지라도, 천연적으로 존재하는 잔기를 활성을 유지하면서 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환할 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역에도, 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 또는 면역원성 표적의 구조에 악영향을 주지 않으면서, 보존적 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
다른 바람직한 폴리펩티드 변이체는, 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 해당 아미노산 서열에 비해 변형되어진 글리코실화 변이체를 포함한다. 일 태양에서, 폴리펩티드 변이체는 해당 아미노산 서열보다 더 많거나 적은 수의 N-결합된 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합된 글리코실화 부위는 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하며, 이때 X로서 표기된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 서열을 형성하는 아미노산 잔기의 치환은 N-결합된 탄화수소 쇄의 부가를 위한 새로운 잠재적인 부위를 제공한다. 달리, 상기 서열을 제거하는 치환은 기존의 N-결합된 탄화수소 쇄를 제거할 것이다. 또한, 하나 이상의 N-결합된 글리코실화 부위 (통상적으로 천연적으로 존재하는 것들)이 제거되고 하나 이상의 새로운 N-결합 부위가 형성되는 N-결합된 탄화수소 쇄의 재배열이 제공된다. 폴리펩티드의 O-결합된 글리코실화에 영향을 주기 위하여, 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 변형시킬 수 있다.
추가적 바람직한 변이체는, 해당 아미노산 서열 세트에 비해 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 (예: 세린)으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 펩티드 또는 폴리펩티드가 불용성 봉입체(inclusion body)의 분리 후와 같이 생물학적 활성 입체형태로 재폴딩되어야 할 때, 시스테인 변이체가 유용하다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질 보다 시스테인 잔기가 더 적고, 쌍을 형성하지 않은 시스테인에 의한 상호작용을 최소화하기 위하여 짝수의 시스테인을 갖는 것이 통상적이다.
다른 태양에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는, 당해 폴리펩티드의 정제를 보조하는 하나 이상의 융합 절편에 부착될 수 있다. 융합은 이의 해당 폴리펩티드 변이체의 아미노 말단 또는 카복시 말단에서 이루어질 수 있다. 융합은 링커 또는 어댑터 분자 없이 직접 연결될 수 있거나, 또는 링커 또는 어댑터 분자를 통하여 연결될 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 하나 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로 약 20 내지 약 50개의 아미노산 잔기일 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 또한, 융합된 부분을 분리시킬 수 있는 DNA 제한 엔도뉴클리아제 또는 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖도록 설계될 수 있다. 일단 작제되면, 융합 폴리펩티드는 본원에 기재된 방법에 따라 유도체화될 수 있다고 생각될 것이다. 적합한 융합 절편은 특히 금속 결합 도메인 (예: 폴리-히스티딘 절편), 면역글로불린 결합 도메인 (즉, 단백질 A, 단백질 G, T 세포, B 세포, Fc 수용체, 또는 보체 단백질 항체-결합 도메인), 당류 결합 도메인 (예: 말토스 결합 도메인), 및/또는 "태그(tag)" 도메인 (즉, α-갈락토시다제의 적어도 일부, 스트렙(strep) 태그 펩티드, T7 태그 펩티드, FLAG 펩티드, 또는 모노클로날 항체와 같이 도메인에 결합된 화합물을 사용하여 정제할 수 있는 기타 도메인)을 포함한다. 이러한 태그는 통상적으로 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있으며, 발현시 숙주 세포로부터 목적하는 폴리펩티드 서열의 친화성 정제를 위한 수단으로서의 역할을 할 수 있다. 친화성 정제는, 예를 들면 태그에 대한 항체를 친화성 매트릭스로서 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 달성할 수 있다. 임의로, 태그는 다양한 수단, 예를 들면 절단용 특정 펩티다제를 사용하여 목적하는 폴리펩티드의 정제된 서열로부터 후속적으로 제거될 수 있다. 후술하는 바와 같이, 융합은 예를 들면 TA와 공동-자극 성분, 예컨대 케모킨 CXC10 (IP-10), CCL7 (MCP-3) 또는 CCL5 (RANTES) 사이에서 이루어질 수 있다.
융합 모티프는 면역원성 표적의 MHC 프로세싱 구획, 예를 들면 소포체로의 수송을 증가시킬 수 있다. 트랜스덕션(tranduction) 또는 트랜스사이토시스(transcytosis) 서열로서 지칭되는 이들 서열은 HIV tat[참조: Kim et al. 1997 J. Immunol. 159: 1666), 드로소필라 안테나페디아(Drosophiila antennapedia)[참조: Schutze-Redelmeier et al. 1996 J. Immunol. 157: 650], 또는 사람 1기 단백질 [hPER1; 특히 SRRHHCRSKAKRSRHH (서열번호 17)]로부터 유래된 서열을 포함한다.
또한, 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 동종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합되어 동종이량체를 형성할 수 있거나 또는 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합되어 이종이량체를 형성할 수 있다. 이종 펩티드 및 폴리펩티드는, 융합 폴리펩티드의 검출 및/또는 분리를 허용하는 에피토프; 막관통(transmembrane) 수용체 단백질 또는 이의 부분, 예를 들면 세포외 도메인 또는 막관통 및 세포내 도메인; 막관통 수용체 단백질에 결합하는 리간드 또는 이의 부분; 촉매적으로 활성인 효소 또는 이의 부분; 올리고머화를 촉진하는 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들면 루이신 지퍼(zipper) 도메인; 안정성을 증가시키는 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들면 면역글로불린 불변 영역; 당해 펩티드 또는 폴리펩티드와 상이한 치료학적 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드; 및/또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 태양에서, 면역원성 표적을 암호화하는 핵산 서열과 하나 이상의 공동-자극 성분(들), 예를 들면 세포 표면 단백질, 사이토킨 또는 케모킨을 본 발명의 조성물 내에 배합하는 것이 유리할 수 있다. 공동-자극 성분은, 예를 들면 폴리펩티드 또는 당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로서 조성물 내에 포함될 수 있다. 적합한 공동-자극 분자는 예를 들어, CD28 계열의 일원(즉, CD28, ICOS; Hutloff, et al. Nature 1999, 397: 263-265; Peach, et al. J Exp Med 1994, 180: 2049-2058)에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 CD28 결합 폴리펩티드 B7.1 [CD80; Schwarz, 1992; Chen et al, 1992; Ellis, et al. J. Immunol., 156 (8): 2700-9], B7.2 [CD86; Ellis, et al. J. Immunol., 156 (8): 2700-9], 및 이의 돌연변이체/변이체[WO 00/66162]; ICAM 계열의 일원(즉, ICAM-1, -2 또는 -3)을 포함하여, 인테그린 계열의 일원(즉, LFA-1 (CD1la/CD18); Sedwick, et al. J Immunol 1999, 162: 1367-1375; Wulfing, et al. Science 1998, 282: 2266-2269; Lub, et al. Immunol Today 1995, 16: 479-483]에 결합하는 폴리펩티드; CD2 계열의 일원 [즉, CD2, 시그널전달 림프구 활성화 분자 (CDw150 또는 "SLAM"; Aversa, et al. J Immunol 1997, 158: 4036-4044)]에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들면 CD58 (LFA-3; CD2 리간드; Davis, et al. Immunol Today 1996, 17: 177-187) 또는 SLAM 리간드 (Sayos, et al. Nature 1998, 395 : 462-469); 열 안정성 항원 (HSA 또는 CD24; Zhou, et al. Eur J Immunol 1997, 27: 2524-2528)에 결합하는 폴리펩티드; TNF 수용체 (TNFR) 계열의 일원 [즉, 4-1BB (CD137; Vinay, et al. Semin Immunol 1999, 10: 481-489), OX40 (CD134; Weinberg, et al. Semin Immunol 1998, 10: 471-480; Higgins, et al. J Immunol 1999, 162: 486-493), 및 CD27 (Lens, et al. Semis Immunol 1998, 10: 491-499)]에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들면 4-1BBL (4-1BB 리간드; Vinay, et al. Serein Immunol 1998, 10: 481-48; DeBenedette, et al. J Immunol 1997, 158: 55l-559), TNFR 관련 인자-1 (TRAF-1; 4-1BB 리간드; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862, Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565), TRAF-2 (4-1BB 및 OX40 리간드; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862; Oshima, et al. Int Immunol 1998, 10: 517-526, Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), TRAF-3 (4-1BB 및 OX40 리간드; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Jang, et al. Biochem Biophys Res Commun 1998, 242: 613-620; Kawamata S, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), OX40L (OX40 리간드; Gramaglia, et al. J Immunol 1998, 161: 6510-6517), TRAF-5 (OX40 리간드; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), 및 CD70 (CD27 리간드; Couderc, et al. Cancer Gene Ther., 5(3): 163-75)를 포함한다. CD 154 (CD40 리간드 또는 "CD40L"; Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161: 4563-4571; Sine, et al. Hum. Gene Ther., 2001, 12: 1091-1102)가 또한 적당할 수 있다.
하나 이상의 사이토킨이 또한 본 발명의 조성물 내에 함유된 폴리펩티드 또는 핵산에 의해 암호화된 것으로서 적합한 공동-자극 성분 또는 "애주번트" 일 수 있다[참조 문헌: Parmiani, et al. Immunol Lett 2000 Sep 15; 74 (1): 41-4; Berzofsky, et al. Nature Immunol. 1: 209-219]. 적합한 사이토킨은, 예를 들어 인터루킨-2 (IL-2) [참조 문헌: Rosenberg, et al. Nature Med. 4: 321-327 (1998)], IL-4, IL-7, IL-12 [참조 문헌: Pardoll, 1992; Harries, et al. J. Gene Med. 2000 Jul-Aug; 2(4): 243-9; Rao, et al. J. Immunol. 156: 3357-3365 (1996)], IL-15 [참조 문헌: Xin, et al. Vaccine, 17: 858-866, 1999], IL-16 [참조 문헌: Cruikshank, et al. J. Leuk Biol. 67(6): 757-66, 2000], IL-18 [참조 문헌: J. Cancer Res Clin. Oncol. 2001. 127(12): 718-726], GM-CSF [CSF (Disis, et al. Blood, 88: 202-210 (1996)], 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 또는 INF-α또는 INF-γ와 같은 인터페론을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 사이토킨이 또한 본 발명을 실행하는데 적합할 수 있다.
케모킨은 폴리펩티드 또는 핵산 형으로 이용될 수 있다. 종양 자가-항원에 융합된 CXCL10 (IP-10) 및 CCL7 (MCP-3)을 포함하는 융합 단백질이 항-종양 면역성을 유도한다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999, 17: 253-258]. 케모킨 CCL3 (MIP-lα) 및 CCL5 (RANTES) [참조 문헌: Boyer, et al. Vaccine, 1999, 17. (Supp. 2): S53-S64]이 또한 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 다른 적합한 케모킨이 당업계에 공지되어있다.
억제성 또는 음성 조절 면역 기전이 차단되면, 면역 반응이 증강될 수 있다는 것이 또한 당업계에 공지되었다. 예를 들면, 항-CTLA-4 (Shrikant, et al. Immunity, 1996, 14: 145-155; Sutmuller, et al. J. Exp. Med., 2001, 194: 823-832), 항-CD25 (Sutmuller, supra), 항-CD4 (Matsui, et al. J. Immunol., 1999, 163: 184-193), 융합 단백질 IL 13Ra2-Fc (Terabe, et al. Nature Immunol., 2000, 1: 515-520), 및 이의 조합 (즉, 항-CTLA-4 및 항-CD25, Sutmuller, supra)을 사용한 처리가 항-종양 면역 반응을 상향조절하는 것으로 밝혀졌으며 본 발명을 실행하는데 적합할 것이다. 특히, 상기와 같은 처리는 본 발명의 하나 이상의 면역원성 표적과 조합될 수 있다.
이들 성분들은 모두 단독으로 또는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, CD80, ICAM-1 및 LFA-3 ("TRICOM")의 배합물이 항-암 면역 반응을 강화시킬 수 있다[참조 문헌: Hodge, et al. Cancer Res. 59: 5800-5807 (1999)]. 기타 효과적인 배합물은 예를 들어 IL-12 + GM-CSF [Ahlers, et al. J. Immunol., 158: 3947-3958 (1997); Iwasaki, et al. J. Immunol. 158: 4591-4601 (1997)], IL-12 + GM-CSF + TNF-α[Ahlers, et al. Int. Immunol. 13: 897-908 (2001)], CD80 + IL-12 (Fruend, et al. Int. J. Cancer, 85: 508-517 (2000); Rao, et al. supra], 및 CD86 + GM-CSF + IL-12 [Iwasaki, supra]을 포함한다. 당업자는 본 발명을 수행하는데 유용한 또 다른 배합물을 알 것이다. 또한, 당업자는 상기와 같은 기전을 조절하는데 사용될 수 있는 추가적 시약 또는 방법을 알 것이다. 이들 시약 및 방법뿐만 아니라, 당업자에 의해 공지된 그밖의 것이 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있다.
핵산-이용 면역화의 효율을 향상시키기 위한 추가적 전략, 예를 들어 자가-복제성 바이러스 레플리콘의 사용 [참조 문헌; Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55], 코돈 최적화 [참조 문헌: Liu, et al. 2000. Mol. laser., 1: 497-500; Dubensky, supra ; Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951], 생체내 전기천공 [참조 문헌: Widera, et al. 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640], CpG 자극 모티프의 도입 [참조 문헌: Gurunathan, et al. Ann. Rev. Immunol., 2000, 18: 927-974; Leitner, supra ; Cho, et al. J. Immunol. 168 (10): 4907-13], 세포내이입 또는 우비퀴틴-프로세싱 경로의 표적화를 위한 서열[참조 문헌: Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166 : 5366-5373], 마렉(Marek's) 질환 바이러스 1형 VP22 서열 [참조 문헌: J. Virol. 76(6): 2676-82, 2002], 초회감작-추가감작(prime-boost) 방법 [참조 문헌: Gurunathan, supra; Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74], 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 점막 전달 벡터의 사용 [참조 문헌: Darji, et al. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001] 등이 이용될 수 있다. 다른 방법들이 당업계에 공지되어있고, 그 중 일부는 후술된다.
화학요법제, 방사선조사, 항-혈관형성 화합물 또는 다른 제제가, 면역원성 표적을 사용하여 암을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있다[참조 문헌: Sebti, et al. Oncogene 2000 Dec 27; 19(56): 6566-73]. 예를 들면, 전이성 흑색종을 치료하는데 있어서, 적합한 화학요법제로는 특히 BELD (블레오마이신, 빈데신, 로무스틴 및 데카르바진; Young, et al. 1985. Cancer, 55: 1879-8i), BOLD (블레오마이신, 빈크리스틴, 로무스틴, 데카르바진; Seigler, et al. 1980. Cancer, 46: 2346-8); DD (데카르바진, 액티노마이신; Hochster, et al. Cancer Treatment Reports, 69: 39-42), 또는 POC (프로카르바진, 빈크리스틴, 로무스틴; Carmo-Pereira, et al. 1984. Cancer Treatment Reports, 68: 1211-4)가 포함될 수 있다. 다른 적합한 화학요법적 방법이 또한 이용될 수 있다.
다수의 항-혈관형성제가 당업계에 공지되어있으며, 면역원성 표적 백신 및/또는 화학요법제와 함께 공동-투여하기에 적합할 것이다[참조 문헌: Timar, et al. 2001. Pathology Oncol. Res., 7(2): 85-94]. 이러한 제제로는 예를 들면 생리학적 제제, 예컨대 성장 인자 (즉, ANG-2, NK1,2,4 (HGF), 형질전환성 성장 인자 베타 (TGF-β)), 사이토킨 (즉, 인터페론, 예를 들어 IFN-α, -β, -γ, 혈소판 인자 4 (PF-4), PR-39), 프로테아제 (즉, 절단된 AT-III, 콜라겐 XVIII 단편 (Endostatin)), HmwKallikrein-d5 플라스민 단편 (Angiostatin), 프로트롬빈-Fl-2, TSP-1), 프로테아제 억제제 (즉, 메탈로프로테아제의 조직 억제제, 예를 들어 TIMP-1, -2, 또는 -3; 매스핀(maspin); 플라스미노겐 활성인자-억제제, 예를 들어 PAI-1; 색소 상피 유래된 인자 (PEDF)), 툼스타틴(Tumstatin) (구입처: ILEX, Inc. ), 항체 생성물 (즉, 콜라겐-결합 항체 HUIV26, HUI77, XL313; 항-VEGF; 항-인테그린 (즉, Vitaxin, (Lxsys))), 및 글리코시다제 (즉, 헤파린아제-I, -III)가 포함된다. 공지되었거나 항-혈관형성 잠재력을 갖는 것으로 여겨지는 "화학적" 또는 변형된 생리학적 제제로는, 예를 들어 빈블라스틴, 탁솔, 케토코나졸, 탈리도미드(thalidomide), 돌레스타틴(dolestatin), 콤브레스타틴(combrestatin) A, 라파마이신 (Guba, et al. 2002, Nature Med., 8: 128- 135), CEP-7055 (구입처: Cephalon, Inc.), 플라본(flavone) 아세트산, Bay 12-9566 (Bayer Corp.), AG3340 (Agouron, Inc.), CGS 27023A (Novartis), 테트라사이클린 유도체 (즉, COL-3 (Collagenix, Inc.)), 네오바스타트(Neovastat) (Aeterna), BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb), 저 용량 5-FU, 저 용량 메토트렉세이트 (MTX), 이르소플라딘(irsofladine), 라디시콜(radicicol), 사이클로스포린, 캡토프릴(captopril), 셀렉콕시브(celecoxib), D45152-설페이트화 다당류, 양이온성 단백질 (Protamine), 양이온성 펩티드-VEGF, 수라민(Suramin) (폴리설포네이트화 나프틸 우레아), VEGF의 기능 또는 생성을 방해하는 화합물 (즉, SU5416 또는 SU6668 (Sugen), PTK787/ZK22584 (Novartis)), 디스타마이신(Distamycin) A, 엔지오자임(Angiozyme) (리보자임), 이소플라비노이드, 스타우로스포린(staurosporine) 유도체, 게니스테인(genistein), EMD121974 (Merck KcgaA), 트립토스틴(tyrphostin), 이소퀴놀론, 레티노산, 카르복시아미도트라이졸, TNP-470, 옥트레오티드(octreotide), 2-메톡시에스트라디올(methoxyestradiol), 아미노스테로이드 (즉, 스쿠알라민(squalamine)), 글루타티온 유사체 (즉, N-아세틸-L-시스테인), 컴브레타스타틴 A-4 (Oxigen), Eph 수용체 차단제 (Nature, 414: 933-938, 2001), Rh-안지오스타틴(Angiostatin), Rh-엔도스타틴(Endostatin) (WO 01/93897), 사이클릭-RGD 펩티드, 액쿠틴(accutin)-디스인테그린(disintegrin), 벤조디아제펜, "사람화된 항-avb3 Ab, Rh-PAI-2, 아밀로라이드(amiloride), p-아미도벤자미딘, 항-uPA ab, 항-uPAR Ab, L-페닐알라닌-N-메틸아미드 (즉, 바티미스타트(Batimistat), 마리마스타트(Marimastat)), AG3340, 및 미노사이클린이 포함된다. 다수의 다른 적합한 제제가 당업계에 공지되어있으며 본 발명을 실행하는데 충분할 것이다.
본 발명은 또한 암 치료의 "비-전통적" 방법과 함께 병용될 수 있다. 예를 들면, 특정 혐기성 세균의 투여가 종양 성장을 지연시키는데 도움을 줄 수 있다는 것이 최근에 입증되었다. 한 연구에서, 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi)를 변형시켜 파아지 에피솜 상에 보유되는 독소 유전자를 제거하여, 결장직장 암을 가진 마우스에 투여하였다[참조 문헌: Dang, et al. P.N.A.S. USA, 98 (26): 15155-15160, 2001]. 화학요법과 함께, 상기 치료는 동물에서 종양 괴사를 일으킨다는 것이 밝혀졌다. 본 출원에 기재된 시약 및 방법론이 상기와 같은 시약 및 방법론과 함께 병용될 수 있다.
면역원성 표적을 암호화하는 핵산은 다수의 이용가능한 기법 중의 하나에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 핵산을 숙주에 도입하는데 성공적으로 이용되었던 다양한 바이러스 벡터로는 특히 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스 (AAV: Adeno-Associated Virus), 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스가 포함된다. 다수의 이러한 바이러스 벡터가 당업계에 이용될 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 본 발명의 벡터는 당업자에게 널리 이용된 표준 재조합 기법을 사용하여 작제할 수 있다. 이러한 기법은 통상의 분자 생물학 문헌[예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), 및 PCR Protocols: 4 Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)]에서 찾아 볼 수 있다.
바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스의 유도체 뿐만 아니라 쥐 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 적합한 레트로바이러스의 예로는 예컨대 몰로네이(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하르베이(Harvey) 쥐 육종 바이러스 (HaMuSV), 쥐 유방 종양 바이러스 (MuMTV), SIV, BIV, HIV 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)가 포함된다. 수 많은 레트로바이러스가 다중 외인성 핵산 서열에 도입될 수 있다. 재조합 레트로바이러스는 결함이 있기 때문에, 이들은 감염성 벡터 입자를 생성하기 위하여는 도움을 필요로 한다. 이러한 도움은 예를 들어 레트로바이러스 구조 유전자를 암호화하는 헬퍼 세포주에 의해 제공될 수 있다. 적합한 헬퍼 세포주로는 특히 Ψ2, PA317 및 PA12가 포함된다. 이러한 세포주를 사용하여 생성된 벡터 비리온(virion)을 사용하여 조직 세포주, 예를 들어 NIH 3T3 세포를 감염시켜, 다량의 키메라 레트로바이러스 비리온을 생성할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 전통적 방법 (즉, 주사)에 의해 또는 표적 세포 집단 가까이에 "생산자 세포주"를 이식하는 방법[참조 문헌: Culver, K., et al., 1994, Hum. Gene Iher., 5(3): 343-79; Culver, K., et al., Cold Spring Harb. Snap. Quant. Blol., 59: 685-90); Oldfield, E. , 1993, Hum. Gene Ther., 4 (1): 39-69]으로 투여될 수 있다. 생산자 세포주를 조작하여, 바이러스 벡터를 생성하고 표적 세포 근처에 바이러스 입자를 방출하도록 한다. 방출된 바이러스 입자의 일부는 표적 세포와 접촉하여 이들 세포를 감염시키므로, 본 발명의 핵산이 표적 세포로 전달된다. 표적 세표의 감염 후, 벡터의 핵산의 발현이 일어난다.
아데노바이러스 벡터는, 진핵생물 세포로의 유전자 전달 [참조 문헌: Rosenfeld, M., et al., 1991, Science, 252 (5004): 431-4; Crystal, R., et al., 1994, Nat. Genet., 8(1): 42-51], 진핵생물 유전자 발현 연구 [참조 문헌: Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101(2): 195-202], 백신 개발 [참조 문헌: Graham, F. and Prevec, L., 1992, Biotechnology, 20: 363-90], 및 동물 모델 [참조 문헌: Stratford-Perricaudet, L., et al., 1992, Bone Marrow Transplant., 9 (Suppl. 1): 151-2; Rich, D., et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4(4): 461-76]에서 특히 유용한 것으로 입증되었다. 재조합 Ad를 상이한 생체내 조직으로 투여하기 위한 실험 경로로는 특히 기관내 주입 [참조 문헌: Rosenfeld, M., et al., 1992, Cell, 68 (1): 143-55], 근육내 주사 [참조 문헌: Quantin, B., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(7): 2581-4], 말초 정맥내 주사 [참조 문헌: Herz, J., and Gerard, R., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(7): 2812-6] 및 뇌에의 정위 접종 [참조 문헌: Le Gal La Salle, G., et al., 1993, Science, 259 (5097): 988-90]이 포함된다.
아데노-수반 바이러스 (AAV)는 고 수준 감염성, 넓은 숙주 범위, 및 숙주 세포 게놈 내로의 통합에서의 특이성을 보여준다[참조 문헌: Hermonat, P. , et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (20): 6466-70]. 또한, 단순 포진 바이러스 1형 (HSV-1)은, 이의 향신경 특성 때문에 특히 신경계에서 사용하기에 매력적인 또 다른 벡터 시스템이다[참조 문헌: Geller, A., et al., 1991, Trends Neurosci., 14(10) : 428-32; Glorioso, et al., 1995, Mol. Biotechrtol., 4(1): 87-99 ; Glorioso, et al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675-710].
폭스바이러스는 또 다른 유용한 발현 벡터이다 [참조 문헌: Smith, et al. 1983, Gene, 25(1): 21-8; Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38; Moss, et al. 1991. Science, 252: 1662-1667]. 유용한 것으로 밝혀진 폭스바이러스로는 특히 백시니아(vaccinia), NYVAC, 조류폭스(avipox), 계두(fowlpox), 카나리폭스(canarypox), ALVAC 및 ALVAC(2)이 포함된다.
NYVAC (vP866)는, 공지된 또는 잠재적 독성 인자를 암호화하는 게놈의 6개의 비필수 영역을 제거함으로써 백시니아의 코펜하겐 백신 종으로부터 유래되었다[참조 문헌; 미국 특허 제5,364,773호 및 제5,494,807호]. 결실 유전자좌는 또한 외래 유전자의 삽입을 위해 수용체 유전자좌로서 조작되었다. 결실된 영역은 다음과 같다: 티미딘 키나제 유전자 (TK; J2R); 출혈 영역 (u; B13R+B14R); A 형 봉입체 영역 (ATI; A26L); 적혈구응집소 유전자 (HA; A56R); 숙주 범위 유전자 영역 (C7L-K1L); 및 거대 아단위, 리보뉴클레오티드 리덕타제 (I4L). NYVAC는, 독성 및 숙주 범위와 관련된 유전자 산물을 암호화하는 18개의 개방형 판독 프레임의 특이적 결실에 의해 생성된, 유전자 조작된 백시니아 바이러스 종이다. NYVAC는 TA를 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: 미국 특허 제6,265,189호]. NYVAC (vP866), vP994, vCP205, vCP1433, placZH6H4Lreverse, pMPC6H6K3E3 및 pC3H6FHVB는 또한 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 수탁번호 VR-2559, VR-2558, VR-2557, VR-2556, ATCC-97913, ATCC-97912, 및 ATCC-97914로 각각 기탁되었다.
ALVAC-계 재조합 바이러스 (즉, ALVAC-1 및 ALVAC-2)가 또한 본 발명을 실행하는데 사용하기에 적합하다[참조 문헌: 미국 특허 제5,756,103호]. ALVAC(2)는 ALVAC(l)과 동일하나, 단 ALVAC(2) 게놈은 백시니아 프로모터의 제어하에 백시니아 E3L 및 K3L 유전자를 포함한다 [참조 문헌: 미국 특허 제6,130,066호; Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993]. ALVAC(1) 및 ALVAC(2)는 둘다 모두 외래 DNA 서열, 예를 들어 TA를 발현하는데 유용한 것으로 입증되었다[참조 문헌: Tartaglia et al., 1993 a,b; 미국 특허 제5,833,975호]. ALVAC는 부다페스트 조약의 조건하에, 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버스티 보울러버드 10801에 소재하는 아메리타 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 ATCC 수탁번호 VR-2547로 기탁되었다.
또 다른 유용한 폭스바이러스 벡터는 TROVAC이다. TROVAC는, 1일령의 닭의 백신접종에 인가된 계두바이러스(fowlpoxvirus)의 FP-1 백신 종으로부터 유래된 플라크-클로닝된 분리물인 약독화된 계두(fowlpox)를 의미한다. TROVAC는 마찬가지로 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 수탁번호 2553으로 기탁되었다.
"비-바이러스" 플라스미드 벡터가 또한 본 발명을 실행하는데 적합할 수 있다. 바람직한 플라스미드 벡터는 세균, 곤충 및/또는 포유동물 숙주 세포에 적합할 수 있다. 이러한 벡터로는 예를 들어 PCR-II, pCR3, 및 pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-알파 (PCT 공보 제WO 90/14363호) 및 pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) 뿐만아니라 블루스크립트(Bluescript)R 플라스미드 유도체 (고 복사체 수 COLEl-계 파아지미드, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), Taq-증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드 (예: TOPOTM TA 클로닝R 키트, PCR2.1R 플라스미드 유도체, Invitrogen, Carlsbad, CA)가 포함된다. 세균 벡터가 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 이들 벡터로는 예를 들어 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 락토바실루스(Lactobacillus), 바실 칼메테 구에린(Bacille calmette guerin) (BCG), 및 스트렙토코코스가 포함된다 [참조 문헌: WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; 및 WO 92/21376]. 다수의 다른 비-바이러스 플라스미드 발현 벡터 및 시스템이 당업계에 공지되었으며 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
적합한 핵산 전달 기법으로는 특히 DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접 주사, CaPO4 침전, 유전자 총 기법, 전기천공, 및 콜로이드 분산 시스템이 포함된다. 콜로이드 분산 시스템으로는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비이드 및 지질계 시스템, 예를 들어 수중유 유탁액, 마이셀 및 혼합 마이셀 및 리포좀이 포함된다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소낭인 리포좀이다. RNA, DNA 및 온전한 비리온은 수성 내부 내에서 캡슐화되어, 생물학적 활성 형으로 세포에 전달될 수 있다 [참조 문헌: Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77]. 리포좀의 조성물은, 통상적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 배합된 인지질, 특히 고-상-전이-온도(high-phase-transition-temperature) 인지질의 배합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 농도, 및 이가 양이온의 존재에 따라 결정된다. 리포좀 생성에 유용한 지질의 예로는 포스파티딜 화합물, 예를 들어 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핀고지질(sphingolipid), 세레브로시드(cerebroside), 및 강글리오시드(ganglioside)가 포함된다. 지질 부분이 14 내지 18개의 탄소 원자, 특히 16 내지 18개의 탄소 원자를 함유하며, 포화된 디아실포스파티딜글리세롤이 특히 유용하다. 예시적 인지질로는 난(egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 포함된다.
면역원성 표적은 또한 면역 반응을 증강시키기 위하여 하나 이상의 애주번트와 함께 투여될 수 있다. 예시적 애주번트는 표 II에 제시된다.
면역원성 애주번트의 유형
애주번트의 유형 일반적 예 구체적 예/참조문헌
겔-형
 수산화알루미늄/포스페이트("명반 애주번트") (Aggerbeck and Heron, 1995)
인산칼슘 (Relyveld, 1986)
미생물


 무라밀 디펩티드 (MDP) (Chedid et al., 1986)
세균 외독소 콜레라 독소 (CT), 이.콜라이 불안정 독소 (LT) (Freytag and Clements, 1999)
내독소-계 애주번트 모노포스포릴 지질 A (MPL) (IJIrich andMyers, 1995)
기타 세균 CpG 올리고뉴클레오티드 (Corraland Petray, 2000), BCG 서열 (Krieg, et al. Nature, 374: 576), 파상풍 톡소이드 (Rice, et al. J. Immunol., 2001,167 : 1558-1565)
미립자

 생체분해성
중합체 미소구		 (Gupta et al., 1998)
면역자극성 복합체 (ISCOM) (Morein and Bengtsson, 1999)
리포좀 (Wassef et al., 1994)
오일-유탁액 및 계면활성제-계 애주번트

 프로인트(Freund) 불완전 애주번트 (Jensen et al., 1998)
미세유동화 유탁액
 MF59 (Ott et al., 1995)
SAF (Allison and Byars, 1992) (Allison, 1999)
사포닌 QS-21 (Kensil, 1996)
합성



 무라밀 펩티드 공중합체 무라부티드 (Lederer, 1986) 트레노니-MDP (Allison, 1997)
비이온성 블럭 공중합체 L121 (Allison, 1999)
폴리포스파젠(PCPP) (Payne et al., 1995)
합성 폴리뉴클레오티드 폴리 A:U, 폴리 I:C (Johnson, 1994)
탈리도미드 유도체 CC-4047/ACTIMID (J. Immunol., 168 (10): 4914-9)
당업자에게 공지된 각종 기법을 사용하여, 본 발명의 조성물을 숙주에 투여할 수 있다. 당해 조성물(들)은, 사람 및 기타 포유동물을 포함한 환자에게 투여하기 위한 약제(즉, "약제학적 조성물)를 제조하기 위하여 통상적인 조제술에 따라 처리될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어 소정량의 DNA, 바이러스 벡터 입자, 폴리펩티드 또는 펩티드를 함유하는 투여 단위의 형태로 제조하는 것이 바람직하다. 사람 또는 기타 포유동물에 적합한 1일 투여량은 환자의 상태 및 기타 인자에 따라 크게 달라질 수 있으나, 다시 한번, 통상의 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
약제학적 조성물은 경구로, 비경구로, 흡입 분무로, 직장으로, 결절내로 또는 국소로, 통상의 약제학적으로 허용되는 담체, 애주번트 및 비히클을 함유하는 투여 단위 제형으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"란 용어는, 약제학적 조성물로서 핵산, 폴리펩티드 또는 펩티드의 전달을 달성하거나 증가시키기에 적합한 하나 이상의 제형 물질을 의미한다. "약제학적 조성물"은 치료학적 유효량의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물이다. "유효량" 및 "치료학적 유효량"이란 용어는 각각 효과적인 면역 반응을 유도하거나 증강시키는데 사용된 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 의미한다. 본 발명의 조성물은, 숙주에서 항-종양 면역 반응의 유도 또는 증강을 제공하여, 숙주를 종양의 발달로부터 보호하고/하거나 숙주가 기존 종양을 체내로부터 제거할 수 있는 것이 바람직하다.
경구 투여의 경우에, 약제학적 조성물은, 예를 들어 특히 캡슐제, 정제, 현탁제 또는 액제를 포함한 여러 형태 중 하나 일 수 있다. 액제는 염수, 덱스트로스 또는 물을 포함한 적합한 담체를 함유하는 조성물로서 주사에 의해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "비경구"란 용어는 피하, 정맥내, 근육내, 복장내, 주입 또는 복막내 투여를 포함한다. 약물의 직장 투여를 위한 좌제는, 코코나 버터 및 폴리에틸렌 글리콜과 같이 통상의 온도에서는 고체이나 직장 온도에서는 액체인 적당한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 사용하여 숙주를 면역화시키거나 또는 달리 장애 또는 질환을 치료하기 위한 투여 방법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 상태의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정 화합물을 포함한 각종 인자를 토대로 한다. 예를 들면, 폭스바이러스 벡터는, 용량당 1 x 106개의 감염성 입자를 포함하는 조성물로서 투여될 수 있다. 따라서, 투여 방법은 매우 다양할 수 있으나, 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다.
초회감작-추가감작(prime-boost) 방법 (WO 01/30382 Al)이 또한 이용될 수 있는데, 이에 따르면, 표적화된 면역원이 최초로 초회감작(priming) 단계에서 한가지 형태로 투여된 후, 추가감작(boosting) 단계에서 표적화된 면역원이 또 다른 형태로 투여된다. 초회감작 단계 및 추가감작 단계에서 표적화된 면역원의 형태는 상이하다. 예를 들면, 초회감작 단계에서 핵산이 이용된 경우에, 추가감작물은 펩티드로서 투여된다. 유사하게, 초회감작 단계에서 한가지 유형의 재조합 바이러스 (즉, ALVAC)가 이용된 경우에, 추가감작 단계에서는 다른 유형의 바이러스 (즉, NYVAC)가 이용될 수 있다. 이러한 초회감작-추가감작 투여 방법이 강한 면역학적방법을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 각종 배합 형이 본 발명을 실행하는데 적합하다.
본 발명의 조성물이 단일 활성 약제학적 제제로서 투여될 수 있는 경우에, 이는 하나 이상의 또 다른 조성물 또는 제제 (즉, 다른 면역원성 표적, 공동-자극 분자, 애주번트)와 함께 사용될 수 있다. 배합물로서 투여되는 경우에, 개개의 성분은 동시에 또는 다른 시기에 투여되는 별개의 조성물로서 제형화될 수 있거나, 또는 단일 조성물로서 배합될 수 있다.
주사용 제제, 예를 들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은, 적합한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 비독성의 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 비히클 및 용매로는 특히 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 예를 들면, 폭스바이러스와 같은 바이러스 벡터는 0.4% NaCl 중에 제조될 수 있다. 추가로, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 모든 무자극 고정유가 사용될 수 있다. 추가로, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
국소 투여의 경우에, 조성물의 적당한 국소 투여량이 1일에 1 내지 4회, 바람직하게는 2 또는 3회 투여될 수 있다. 당해 투여량은 또한 투여를 하지 않는 조정 기간을 두고 투여될 수 있다. 적합한 조성물은 제형의 0.001% 내지 10% w/w, 예를 들면 1중량% 내지 2중량%를 포함할 수 있으나, 이는 제형의 10% w/w 정도, 바람직하게는 5% w/w 이하, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 1%를 포함할 수 있다. 국소 투여에 적합한 제형은 피부를 통한 침투에 적합한 액제 또는 반-액제 (예: 도찰제, 로션제, 연고제, 크림제 또는 페이스트제) 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 고체 형태(과립제, 산제 또는 좌제 포함)로 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균과 같은 통상의 제약 작업으로 처리되고/되거나 통상의 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤화제, 유화제, 완충제 등을 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 투여형은 캡슐제, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함할 수 있다. 이러한 고체 투여형에서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성 희석제, 예를 들면 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합될 수 있다. 이러한 투여형은 또한 통상적으로 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우에, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 추가로 장용 제피제로 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 투여형으로는, 당업계에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유하는, 약제학적으로 허용되는 유탁액제, 용액제, 현탁액제, 시럽제, 및 엘릭서제가 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤화제, 감미제, 향신제 및 방향제를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 여러 형태 중 하나를 취할 수 있으며 여러 경로 중 하나로 투여될 수 있다. 바람직한 태양에서, 당해 조성물은 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위하여 비경구 경로 (피내, 근육내 또는 피하)를 통해 투여된다. 달리, 당해 조성물은 림프절 (결절내) 또는 종양 덩어리 (즉, 종양내 투여)로 직접 투여될 수 있다. 예를 들면, 용량이 0, 7 및 14일에 피하로 투여될 수 있다. 특히 p53 (Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), 흑색종-관련 항원 (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988), 흑색종-관련 항원 E (WO 99/30737) 및 암배아 항원 (CEA) (Kantor et al., 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991)에 대해 밝혀진 바와 같이, TA를 포함하는 조성물을 사용하여 면역화하는 적합한 방법이 당업계에 공지되어있다.
투여가능 조성물의 바람직한 태양은, 예를 들어 현탁액제, 시럽제 또는 엘릭서제와 같은 액제 제제 중에 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 주사용 제제는 멸균 현탁액 또는 유탁액과 같이 비경구, 즉 피내, 근육내 또는 정맥내 투여에 적합한 핵산 또는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 재조합 폭스바이러스는 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리학적 염수, 글루코스 등과 혼합될 수 있다. 당해 조성물은 또한 예를 들어 등장성 수성 염수 완충제 중에서 재구성하기 위한 동결건조형으로 제공될 수 있다. 추가로, 당해 조성물은 다른 항신생물제, 항종양제 또는 항암제 및/또는 항신생물제, 항종양제 또는 항암제의 해로운 효과를 감소 또는 완화시키는 제제와 함께 공동-투여되거나 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 당해 키트는 적당한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 별개의 용기를 포함할 수 있다. 당해 키트는 또한 추가적 항암제, 항종양제 또는 항신생물제 및/또는 공동- 또는 연속-투여를 위한 항신생물제, 항종양제 또는 항암제의 해로운 효과를 감소 또는 완화시키는 제제를 포함할 수 있다. 추가로, 당해 키트는 성분의 혼합 또는 배합 및/또는 투여를 위한 지침을 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 나은 이해 및 본 발명의 다수의 이점은 설명을 위해 제공된 후술되는 실시예로부터 밝혀질 것이다.
실시예 1
다중-항원 작제물 vT416 의 구축
발현 벡터 vT416 (ALVAC-NY-ESO-l/Trp-2-LFA-31ICAM-l/B7.1-E3L/K3L)를 표준 기법을 사용하여 ALVAC 벡터 내에 구축하였다. NY-ESO-1, Trp-2, LFA-3, ICAM-1, B7.1, vvE3L 및 wK3L를 암호화하는 DNA 서열을 ALVAC 게놈 내의 다양한 유전자좌 속에 삽입하였다. NY-ESO-1 (Chen et al. 1997 PNAS 94: 1914) 및 TRP-2 (Wang et al. 1996 J. Exp. Med. 184: 2207)를 암호화하는 DNA 서열을 C5 유전자좌 속에 삽입하였다. LFA-3 (Wallner, et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 923-932), ICAM-1 (Staunton, et al. (1988) Cell 52: 925-933) 및 B7.1 (Chen, et al. (1992) Cell 71: 1093-1102)를 암호화하는 DNA 서열을 C3 유전자좌 속에 삽입하였다. LFA-3, ICAM-1 및 B7.1은 TRICOM으로서 공지된 발현 카세트를 형성한다. vvE3L (Chang, et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 89: 4825-4829) 및 wK3L (Beattie, et al. 1991. Virology 183: 419-422)를 암호화하는 DNA 서열을 C6 유전자좌 속에 삽입하였다. 프로모터를 아래와 같이 사용하였다:
Figure 112006015634313-pct00002
프로모터 sE/L은 문헌[Chakrabarti, et al., BioTechniques 23: 1094-1097, 1997]에 기재되어있다. 사용된 공여체 플라스미드는 아래에 제시된다:
Figure 112006015634313-pct00003
NY-ESO-1 및 TRP-2 DNA 서열을 ALVAC 공여체 플라스미드 pT1132 속에 삽입하였다. 이어서, 상기 공여체 플라스미드를 pALVAC.Tricom(C3) #33와 함께 사용하여 표준 기법에 의해 이들 유전자를 발현하는 ALVAC-TRICOM 재조합체를 제조하였다. 플라스미드 pALVAC.Tricom(C3) #33 및 pT1132는 도 1에 도시되어있다. pALVAC.Tricom(C3) #33 및 pT1132의 DNA 서열은 각각 도 2 및 3에 도시되어있다.
실시예 2
다중-항원 작제물 vT419 의 구축
발현 벡터 vT419 (ALVAC-gplOOM/Mart-l/Mage-1,3 미니유전자-LFA-3/ICAM-1/B7.1-E3L/K3L)를 표준 기법을 사용하여 ALVAC 벡터 내에 구축하였다. gplOOM/MART-l/MAGE-1,3 미니유전자, LFA-3, ICAM-1, B7.1, wE3L 및 wK3L를 암호화하는 DNA 서열을 ALVAC 게놈 내의 다양한 유전자좌 속에 삽입하였다. gp100M/ MART-1/MAGE-1,3 미니유전자를 C5 유전자좌 속에 삽입하였다. LFA-3 (Wallner, et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 923-932), ICAM-1 (Staunton, et al. (1988) Cell 52: 925-933) 및 B7.1 (Chen, et al. (1992) Cell 71: 1093-1102)를 암호화하는 DNA 서열을 C3 유전자좌 속에 삽입하였다. LFA-3, ICAM-1 및 B7.1은 TRICOM으로서 공지된 발현 카세트를 형성한다. vvE3L (Chang, et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89: 4825-4829) 및 vvK3L (Beattie, et al. 1991. Virology 183: 419-422)를 암호화하는 DNA 서열을 C6 유전자좌 속에 삽입하였다. 프로모터를 아래와 같이 사용하였다:
Figure 112006015634313-pct00004
프로모터 sE/L은 문헌[Chakrabarti, et al., BioTechniques 23: 1094-1097, 1997]에 기재되어있다. 사용된 공여체 플라스미드는 아래에 제시된다:
Figure 112006015634313-pct00005
gp100(M), Mart-1 및 Mage-1,3 미니유전자를 ALVAC C5 공여체 플라스미드pT3217 속에 삽입하였다. 이어서, 상기 공여체 플라스미드를 pALVAC.Tricom(C3) #33와 함께 사용하여 표준 기법에 의해 이들 유전자를 발현하는 ALVAC-TRICOM 재조합체를 제조하였다. 상기 공여체 플라스미드를 C5 부위에 삽입한다. pALVAC.Tricom(C3) #33은 도 1 및 2에 도시되어있다. pT3217 플라스미드는 도 4에 도시되어있다. pT3217의 DNA 서열은 도 5에 도시되어있다.
실시예 3
다중-항원 벡터의 면역학적 평가
제1 동물 실험의 결과는, 백신을 2종의 별개의 주사제로서 제공했을 때, 4개의 항원 중 3개(Mart 1, NY-ESO-1 및 gp100)에 대한 보다 높은 면역학적 반응에 대한 경향을 나타내었다. 그러나, 이들 차이는 통계학적으로 유의적이지 않았다. 상세히, HLA-A2/Kb 유전자전이된(transgenic) 마우스 (5/그룹)를 한 부위에, 배합된 또는 별개의 주사제로 제공된 vT419 (ALVAC (2)-gpl00M/MART-l/MAGE-1/3 미니유전자/TRICOM) 및 vT416 (ALVAC(2)-TRP-2/NY-ESO-1/TRICOM)로 피하로 면역화시켰다. 대조군 마우스를 모(母) ALVAC(2)로 면역화시켰다. 마우스를 3회 (3주 간격으로) 백신접종하고, 최종 추가감작 후 3주가 지나고, 펩티드로 시험관내 재자극한 다음에 개개의 마우스에서 T 세포 반응을 IFN-g ELISPOT 및 CTL 검정으로 분석하였다. 대조군 동물에 비해, 다중-항원 벡터로 (2 부위에서) 백신접종된 마우스는 MART-1에 대해 통계학적으로 유의적인 ELISPOT 반응을 나타내었다. gpl00M 및 NY-ESO-1에 대한 IFN-감마 반응이 또한 검출될 수 있었으나, 이들 반응은, 반응 가변성 및 시험된 배양물의 수가 적음으로 인해, 통계학적으로 유의적이지 않았다. TRP-2 항원에 대한 ELISPOT 반응은 시험된 모든 그룹 (대조군 동물 포함)에서 상승하였는데, 이는 추측컨대 우성 A2-제한된 TRP-2 펩티드 (180-188)가 H-2Kb와 교차반응하여, 시험관내 배양 후 무감작(naive) 마우스에서 낮은 결합력(avidity) T 세포 반응을 유도할 수 있으므로, 통계학적으로 유의적이지 않았기 때문이다. 흥미롭게도, vT416 및 vT419의 혼합물을 주사한 마우스에서의 ELISPOT 반응은 일반적으로 각 바이러스를 별개로 투여한 마우스에서 보다 더 낮았으나, 이들 차이가 통계학적 유의성을 갖지는 않았다. CTL 데이터는 주로 음성적이었으나, 예외적으로 하나의 강한 항-gp100 반응 및 하나의 불충분한 항-MART-1 반응이 있었으며, 이 둘은 모두 vT416 및 vT419를 (2 부위에) 백신접종한 마우스에서 나타났다. 전체적으로, 이들 결과는, 다중-항원 벡터가 MAT-1에 대해 반응을 일으킬 수 있음을 확립하며, 또한 항-gp100 및 항-NY-ESO-1 반응이 유도될 수 있음을 암시하는 고무적인 데이터를 제공한다.
흑색종 다중-항원 ALVAC 재조합체를 사용하여, 2종의 추가적인 예비-임상 동물 연구를 완료하였다. 이들 실험에서, HLA-A2/Kb 유전자전이된 마우스 (5/그룹)를 한 부위에, 배합된 또는 별개의 주사제로 제공된 vT419 (ALVAC(2)-gplOOM/MART-l/MAGE-1/3 미니유전자/TRICOM) 및 vT416 (ALVAC (2)-TRP-2/NY-ESO-1/TRICOM)로 피하로 면역화시켰다. 대조군 마우스를 모(母) ALVAC(2)로 면역화시켰다. 백신접종 후, 개개의 마우스에서의 T 세포 반응을, 펩티드로 시험관내 재자극한 다음에, IFN-감마 ELISPOT 검정으로 분석하였다. 고무적인 면역원성 데이터를 제공하는 이전의 다중-항원 실험과는 달리, 상기 2종의 가장 최근의 연구는, 대조-면역화된 동물에서 높은 기본수준 반응으로 인해, 결정적이 않은 데이터를 제공하였다. 따라서, 전체적인 결과는 결정적이지 않은 것으로 여겨진다.
다중-항원 작제물의 면역원성을 확인하고 제1 연구로부터의 결과를 재현하기 위하여, 또 다른 예비-임상 동물 연구를 완료하였다. HLA-A2/Kb 유전자전이된 마우스 (10/그룹)을, 별개의 주사제로 제공된 vT419 (ALVAC(2)-gplO0M/MART-l/MAGE-1/3 미니유전자/TRICOM) 및 vT416 (ALVAC(2)-TRP-2/NY-ESO-1/TRICOM)로 피하로 면역시켰다. 대조군 마우스를 모(母) ALVAC(2)로 면역화시켰다. 통계학적으로 유의적인 ELISPOT 반응이 gplO0, Mart-l 및 TRP-2에 대해 검출될 수 있었으며, 몇몇 반응은 NY-ESO-1에 대해 검출되었는데, 이는 통계학적으로 유의적인 경계에 있는 것이다.
본 발명이 바람직한 태양의 관점에서 기재되었지만, 당업자가 변화 및 변형을 생각할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위는, 청구된 본 발명의 범위 내에 해당하는 이러한 모든 동등한 변형을 포괄한다고 본다.
<110> Sanofi Pasteur, Ltd.; Therion Biologics, Inc. <120> Multi-Antigen Vector For Melanoma <130> API-03-12-PCT <150> US 60/500,572 <151> 2003-09-05 <150> US 60/504,007 <151> 2003-09-18 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10470 <212> DNA <213> Synthetic <223> ALVAC <400> 1 ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc cattcaggct 480 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540 agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600 ttgtaaaacg 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cctcagaatg acgagtagcc gacaaccata acatcttctg ctttacctat gtctcggaac 7860 tacctatttt cagaagtaca accgtgagtt acacggaatt gttcttctac gggtgttctt 7920 cccaaactag tagccctgtc gtttcacaga gaagttctct ttttgacact tggacaccaa 7980 gggttacgag gtggacgaat actctttgag agacgtcttg tcagtggtgg tggaataagt 8040 ggaattagat ctcagctgga cgtccgtacg tttttaactt taaaataaaa aaaaaaaacc 8100 ttatatttat tacctcagga acgtcgacca gaaaccgtaa ctgcacttcc ttcgtctggg 8160 gtggccggtg aggatacagg aacagtggac ggatccagag aggatactac cgttattcgc 8220 atttcttcac ctggggtagc cggtgaacat gatcaaaaat agggcccaaa aatactgatc 8280 aattagtgcc ggcgaatatt tctagatttt acgtattaaa gatttattac ttttttttca 8340 tgtagtactc gttgcgcaat catataaaat gttacctcta attgcgagat atggcaagat 8400 acaaataact aagtctacta caaaatcttt tctttcaata acttatactt ttgaaattac 8460 ttctacttct actgctgcta ctaataacaa catttagaca aaatctactt cttctactgc 8520 gcgatttcat atgataccaa tgtttcatat tcagatatga tgattaccgc tgaacacgtt 8580 cttccatatc atatcacttt tacaacaatc taatactaat actttttggt ttatttagtc 8640 taggtataga tttccataga ggaaacgtgt attaaagtag ataaggatca aatcttatga 8700 aaagtaatat aaacaaatgt cgacttctgc tttttttata tagctattat cttctaatac 8760 aattgagacg attattctac tttaacttac tcagacactg acgtcggttc gaaccgtgac 8820 cggcagcaaa atgttgcagc actgaccctt ttgggaccgc aatgggttga attagcggaa 8880 cgtcgtgtag ggggaaagcg gtcgaccgca ttatcgcttc tccgggcgtg gctagcggga 8940 agggttgtca acgcgtcgga cttaccgctt accgcggact acgccataaa agaggaatgc 9000 gtagacacgc cataaagtgt ggcgtatacc acgtgagagt catgttagac gagactacgg 9060 cgtatcaatt cggtcggggc tgtgggcggt tgtgggcgac tgcgcgggac tgcccgaaca 9120 gacgagggcc gtaggcgaat gtctgttcga cactggcaga ggccctcgac gtacacagtc 9180 tccaaaagtg gcagtagtgg ctttgcgcgc tctgctttcc cggagcacta tgcggataaa 9240 aatatccaat tacagtacta ttattaccaa agaatctgca gtccaccgtg aaaagcccct 9300 ttacacgcgc cttggggata aacaaataaa aagatttatg taagtttata cataggcgag 9360 tactctgtta ttgggactat ttacgaagtt attataactt tttccttctc atactcataa 9420 gttgtaaagg cacagcggga ataagggaaa aaacgccgta aaacggaagg acaaaaacga 9480 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Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr 85 90 95 Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110 Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125 Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140 Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile 145 150 155 160 Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 210 215 220 Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro 225 230 235 240 Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly 245 250 255 Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg 260 265 270 Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 275 280 285 <210> 15 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val 1 5 10 15 Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln 20 25 30 Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn 35 40 45 Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala 50 55 60 Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg 65 70 75 80 Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr 85 90 95 Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp 100 105 110 Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr 115 120 125 Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile 130 135 140 Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp 145 150 155 160 Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys 165 170 175 Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro 180 185 190 Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser 195 200 205 Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala 210 215 220 Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys 225 230 235 240 Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn 245 250 <210> 16 <211> 532 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ala Leu Pro Ala Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Phe Pro Gly Pro Gly Asn Ala Gln Thr Ser Val Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Val Ile Leu Pro Arg Gly Gly Ser Val Leu Val Thr Cys 35 40 45 Ser Thr Ser Cys Asp Gln Pro Lys Leu Leu Gly Ile Glu Thr Pro Leu 50 55 60 Pro Lys Lys Glu Leu Leu Leu Pro Gly Asn Asn Arg Lys Val Tyr Glu 65 70 75 80 Leu Ser Asn Val Gln Glu Asp Ser Gln Pro Met Cys Tyr Ser Asn Cys 85 90 95 Pro Asp Gly Gln Ser Thr Ala Lys Thr Phe Leu Thr Val Tyr Trp Thr 100 105 110 Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Ser Trp Gln Pro Val Gly 115 120 125 Lys Asn Leu Thr Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Gly Ala Pro Arg Ala 130 135 140 Asn Leu Thr Val Val Leu Leu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Lys Arg Glu 145 150 155 160 Pro Ala Val Gly Glu Pro Ala Glu Val Thr Thr Thr Val Leu Val Arg 165 170 175 Arg Asp His His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu Asp Leu 180 185 190 Arg Pro Gln Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Thr Ser Ala Pro Tyr Gln 195 200 205 Leu Gln Thr Phe Val Leu Pro Ala Thr Pro Pro Gln Leu Val Ser Pro 210 215 220 Arg Val Leu Glu Val Asp Thr Gln Gly Thr Val Val Cys Ser Leu Asp 225 230 235 240 Gly Leu Phe Pro Val Ser Glu Ala Gln Val His Leu Ala Leu Gly Asp 245 250 255 Gln Arg Leu Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Ser Ala 260 265 270 Lys Ala Ser Val Ser Val Thr Ala Glu Asp Glu Gly Thr Gln Arg Leu 275 280 285 Thr Cys Ala Val Ile Leu Gly Asn Gln Ser Gln Glu Thr Leu Gln Thr 290 295 300 Val Thr Ile Tyr Ser Phe Pro Ala Pro Asn Val Ile Leu Thr Lys Pro 305 310 315 320 Glu Val Ser Glu Gly Thr Glu Val Thr Val Lys Cys Glu Ala His Pro 325 330 335 Arg Ala Lys Val Thr Leu Asn Gly Val Pro Ala Gln Pro Leu Gly Pro 340 345 350 Arg Ala Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Pro Glu Asp Asn Gly Arg Ser 355 360 365 Phe Ser Cys Ser Ala Thr Leu Glu Val Ala Gly Gln Leu Ile His Lys 370 375 380 Asn Gln Thr Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Gly Pro Arg Leu Asp Glu 385 390 395 400 Arg Asp Cys Pro Gly Asn Trp Thr Trp Pro Glu Asn Ser Gln Gln Thr 405 410 415 Pro Met Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Leu Pro Glu Leu Lys Cys Leu 420 425 430 Lys Asp Gly Thr Phe Pro Leu Pro Ile Gly Glu Ser Val Thr Val Thr 435 440 445 Arg Asp Leu Glu Gly Thr Tyr Leu Cys Arg Ala Arg Ser Thr Gln Gly 450 455 460 Glu Val Thr Arg Glu Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu 465 470 475 480 Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met Gly Thr Ala 485 490 495 Gly Leu Ser Thr Tyr Leu Tyr Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr 500 505 510 Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln 515 520 525 Ala Thr Pro Pro 530 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg His His 1 5 10 15

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  20. CD80, ICAM-1, LFA-3, gp100M, MART-1 및 MAGE1/3 미니유전자를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터 및 CD80, ICAM-1, LFA-3, TRP-2 및 NY-ESO-1를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터를 주요 성분으로서 포함하는, 포유동물에서 흑색종 다중 항원에 대하여 면역반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
  21. CD80, ICAM-1, LFA-3, gp100M, MART-1 및 MAGE1/3 미니유전자를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물과 CD80, ICAM-1, LFA-3, TRP-2 및 NY-ESO-1를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 혼합함을 포함하여, 제20항의 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  22. 종양 다중 항원에 대하여 면역반응을 유도하기 위해 포유동물에게 별도로 투여되는 제1 약제학적 조성물과 제2 약제학적 조성물의 배합물로서, 상기 제1 약제학적 조성물이 CD80, ICAM-1, LFA-3, gp100M, MART-1 및 MAGE1/3 미니유전자를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터를 포함하고, 상기 제2 약제학적 조성물이 CD80, ICAM-1, LFA-3, TRP-2 및 NY-ESO-1를 암호화하는 ALVAC(2) 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 배합물.
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