TWI457442B - 用以生產第ii型膠原片段抗體的融合瘤細胞株、及以尿液檢測退化性關節炎之方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種融合瘤細胞株，特別是關於一種用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體之融合瘤細胞株，及以該抗體檢測尿液中第Ⅱ型膠原片段之方法。
關節軟組織位於硬骨交接處，係用以保護硬骨，緩衝硬骨間的磨擦，避免硬骨因運動而發生磨損的現象。關節軟組織的合成作用與裂解作用係存在一平衡關係，以維持該關節軟組織於硬骨間的正常作用。
退化性關節炎(Degenerative arthritis)，又稱骨關節炎(Osteoarthritis，簡稱OA)，主要係起因於關節軟組織之合成作用與裂解作用的失衡，以致該關節軟組織的彈性降低、組織萎縮，造成關節間隙變窄，硬骨間的受力與磨擦增加而導致骨關節處發生劇烈疼痛，嚴重時會造成骨頭變形、萎縮。
習用退化性關節炎的檢測方法主要係針對體液中所存在的軟組織裂解片段(如蛋白多醣和膠原片段)進行偵測。該軟組織裂解物係於關節磨損及受力過度時產生，係具有高度專一的胜肽序列，因此，該軟組織裂解物可作為退化性關節炎的生物標誌。習用退化性關節炎的生物標誌包含第Ⅱ型膠原片段的C端裂解片段-CTX Ⅱ，變性膠原蛋白之裂解片段-HELIX-Ⅱ、C2C及Coll 2-1，以及膠原裂解酶(Collagenase)之辨認位-C2C1及T Ⅱ NE等，該
習用退化性關節炎的生物標誌已廣泛用以檢測退化性關節炎的高風險族群。
一種習用退化性關節炎之偵測方法係利用C2C抗體，以針對血液或其他體液進行檢測，惟C2C係屬於大片段的生物標誌(通常係由20個以上胺基酸所組成之胜肽片段)，該C2C雖然易於誘導動物體產生免疫反應，有利於抗體的製備，在實際檢測上，C2C抗體的效價較低且靈敏度較差，僅適合針對侵入性採檢的檢體(如血液、關節液等)進行偵測，不適於作為一般居家檢測的方式。
為改善以大片段之生物標誌作為偵測標的之習知檢測方法，其靈敏度較差，且僅能應用於侵入性採檢而得之檢體等缺點，請參照美國公告第6642007號專利案「尿液樣本第Ⅱ型膠原片段之檢測方法」，該專利案係揭示另一種習用退化性關節炎之檢測方法，該檢測方法係製備複合式的抗體以尿液樣本進行退化性關節炎的檢測手段，該複合式抗體係分別針對第Ⅱ型膠原片段上的兩個抗原表位(Type Ⅱ collagen neoepitope，簡稱T Ⅱ NE)設計一捕獲抗體(Capture antibody)及一偵測抗體(Detection antibody)，以該複合式抗體加以辨識第Ⅱ型膠原片段，其中，該專利案必須以帶有標誌之偵測抗體提高該捕獲抗體偵測第Ⅱ型膠原片段之靈敏度。
更詳言之，該專利案必須藉由該複合式抗體進行三明治式酵素連結免疫吸附試驗(Sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbet Assay)，才能夠有效提高該複合式抗體對於尿液樣本的偵測極限，該專利案無法僅藉由一個抗體達到
檢測第Ⅱ型膠原片段之目的，因此，該專利案為了維持適當的檢測靈敏度及效價，必須耗費較多人力、資源及時間去製備兩種以上的抗體，造成成本上的負擔。
此外，由於將小片段的胜肽序列(約10~15個胺基酸)進行免疫反應以得到抗體的實驗操作並不容易，因此，如能提供單一種更具專一性的抗體係不與第I型膠原片段抗原表位及第Ⅲ型膠原片段抗原表位結合，則能夠更專一性地達到偵測第Ⅱ型膠原片段抗原表位的目的，又能夠簡化該第Ⅱ型膠原片段之製備成本，實為目前臨床診斷退化性關節炎的一大進步。
本發明之主要目的係提供一種用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體的融合瘤細胞，該融合瘤細胞所生產之抗體能夠與該第Ⅱ型膠原片段有效地結合以檢測退化性關節炎，降低用以檢測退化性關節炎抗體之製作成本。
本發明之次一目的係提供一種以尿液檢測退化性關節炎之方法，該抗體能夠以單一種抗體偵測到尿液樣本中微量的第Ⅱ型膠原片段，簡化檢測退化性關節炎之步驟。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：一種用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體的融合瘤細胞株，該融合瘤細胞株係寄存於新竹食品科學工業發展研究所，寄存編號為BCRC 960423，該抗體係專一性結合於第Ⅱ型膠原片段，該第Ⅱ型膠原片段係包含如SEQ ID NO：
1所示之胜肽片段。
一種以尿液檢測退化性關節炎之方法，係利用如申請專利範圍第1項所述之融合瘤細胞株所生產的抗體，針對一尿液檢體進行退化性關節炎的檢測，該抗體係作為一級抗體專一地與尿液中之第Ⅱ型膠原片段結合，該第Ⅱ型膠原片段係包含如SEQ ID NO：1所示之胜肽片段。
其中，該抗體係來自如上所述之融合瘤細胞株，該抗體之效價係5×103
至1×106
倍。
其中，該抗體係與該第Ⅱ型膠原片段進行西方墨點法，舉例而言，取一尿液檢體滴於一樣品承置片，待該尿液檢體風乾後，以該抗體偵測該尿液檢體中之第Ⅱ型膠原片段，該抗體與該第Ⅱ型膠原片段反應發生凝集作用而產生一沉澱物。
其中，該尿液檢體風乾後，較佳係以一阻隔試劑與該尿液檢體之蛋白質反應，使該蛋白質固定於該樣品承置片上，再與該抗體反應。
其中，該抗體係固定於一檢測試紙上，將該尿液檢體與該檢測試紙之抗體接觸，該檢測試紙呈色越深係與軟骨退化狀況呈正相關。
另外，亦可以選擇將該抗體與該第Ⅱ型膠原片段進行石英晶體微天秤試驗。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，
作詳細說明如下：本發明係提供一種用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體的融合瘤細胞株，係利用一段第Ⅱ型膠原片段(Type Ⅱ collagen fragment)作為抗原，對BALB/cJ母系實驗鼠進行腹腔免疫注射，使該實驗鼠產生高效價抗體反應，進一步取出實驗鼠之脾臟細胞與骨髓瘤細胞(SP/o-Ag14)進行融合，並以酵素連結免疫分析法篩選出對該第Ⅱ型膠原片段具有特異反應之融合瘤細胞，藉由該融合瘤細胞所生產之抗體對該第Ⅱ型膠原片段具專一性結合反應，以檢測退化性關節炎之生物標記。
更詳言之，本發明係能夠由該融合瘤細胞株所生產之第Ⅱ型膠原片段之單一個抗體來偵測液體樣本中的第Ⅱ型膠原片段之生物標記；舉例而言，本實施例可以選擇以西方墨點法(Western blotting)或酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbet Assay，簡稱ELISA)偵測該液體樣本中第Ⅱ型膠原片段之生物標記，特別係能夠以西方墨點法偵測到該第Ⅱ型膠原片段之生物標記，而不需以其他螢光偵測系統放大其偵測訊號，即可得到偵測結果，且該偵測結果之專一性跟靈敏度高。
為證實本發明之融合瘤細胞株所生產之第Ⅱ型膠原片段抗體確實能夠僅以單一抗體進行偵測，進行下列試驗：「以第Ⅱ型膠原片段進行動物免疫試驗」、「用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體之融合瘤細胞株之製備方法」、「本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體的製備」，取得本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體後，遂進行「該第Ⅱ型膠原片段抗體辨識該第Ⅱ型
膠原片段T Ⅱ NE之專一性檢測」及「石英晶體微天秤(Quartz crystal microbalance，簡稱QCM)偵測試驗」。
「以第Ⅱ型膠原片段進行動物免疫試驗」
本發明係將第Ⅱ型膠原片段進行動物免疫後，取得一對第Ⅱ型膠原片段抗原表位具有專一性之抗體，該抗體可精確檢驗出液體樣本中所含之第Ⅱ型膠原片段。本實施例之第Ⅱ型膠原片段係委由生技公司合成一段如SEQ ID NO：1所示之胜肽片段，該胜肽片段僅具有11個胺基酸，並配製成濃度為50 mM之注射液，該注射液係包含該第Ⅱ型膠原片段及弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)，其中該第Ⅱ型膠原片段及弗氏完全佐劑的體積比為1：1，且該第Ⅱ型膠原片段之濃度為100 μg/ml。
本發明之實驗動物係選自國家實驗研究院之BALB/cJ mice母系實驗鼠(約六至八週齡)進行動物免疫試驗，請參照第1表所示之施打時間與施打劑量列表，並依照下述方式進行動物免疫：將該注射液以腹腔注射之方式施打至實驗鼠體內完成第一次免疫，且於第一次免疫後第3、5、7、9週，同樣以腹腔注射方式進行實驗鼠之補強免疫，並於第9週補強免疫後10天，於尾巴靜脈進行施打，以眼窩採血之方式採集實驗鼠血液，並由該血液中取得實驗鼠進行免疫試驗後之血清，確認該血清帶有抗T Ⅱ NE之抗體(約於第6針施打後第3天)，進一步利用該實驗鼠進行後續之抗體製作。
「用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體之融合瘤細胞株之製備方法」
本發明之融合瘤細胞株的製備方法係利用polyethylene glycol(PEG)進行實驗鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞(SP/o-Ag14)的融合，再經過篩選與單株化的過程，製得可生產第Ⅱ型膠原片段之抗體的融合瘤細胞株，並寄存於台灣新竹食品科學工業發展研究所，寄存編號為BCRC 960423，該融合瘤細胞株係用以生產一抗體，該抗體係專一性結合於一第Ⅱ型膠原片段，該第Ⅱ型膠原片段係如SEQ ID NO：1所示之胜肽片段。
本發明之製備該融合瘤細胞的第一步驟：係取出經過上述免疫試驗後之實驗鼠的骨髓瘤細胞及脾臟細胞。將該骨髓瘤細胞以適當的培養基(含5%胎牛血清及L-glutamine的RPMI-1640溶液)進行培養，並培養至該骨髓瘤細胞數達5×106
cell/ml以上。將該免疫試驗後之實驗鼠的脾臟細胞壓碎，並以RPMI-1640溶液洗滌2次後，將該脾臟細胞與該骨髓瘤細胞以3：1的體積比混合均勻進行融合。
本發明之製備該融合瘤細胞的第二步驟：係將該融合
瘤細胞經PEG-1500(polyethylene glycol-1500)細胞融合劑處理後，並以含20%胎牛血清的HAT培養液進行培養，且在此培養液內唯有骨髓瘤與脾臟細胞融合的細胞才能存活，以篩選出融合成功之細胞，並將該融合成功之細胞以西方墨點法檢測其免疫專一性，以由該融合成功之細胞中再篩選出對第Ⅱ型膠原片段具有特異反應的融合瘤細胞。
本發明之製備該融合瘤細胞的第三步驟：係進一步進行該融合瘤細胞的單株化以獲得單株融合瘤細胞株，而該融合瘤細胞株所產製的抗體對第Ⅱ型膠原片段具專一性結合反應，且該抗體也可專一性辨識退化性關節炎患者之尿液所含之微量的第Ⅱ型膠原片段。
「本發明之第Ⅱ型膠原片段之抗體的製備」與「該抗體辨識該第Ⅱ型膠原片段T Ⅱ NE之專一性檢測」
將上述所篩選出之融合瘤細胞株經腹腔注射入12週大的BALB/c品系的公鼠，事前需先打入0.5 ml的pristane(Sigma,St.Louis,MO,USA)，再取出腹水以Econo-Pac Protein A kit(Bio-Rad Laboratories,CA,USA)純化單株抗體，，進一步取得一抗體溶液並稀釋至適當濃度(5×103
倍至1×106
倍)做為一級抗體與該第Ⅱ型膠原片段結合，並以抗-鼠之HRP-IgG、IgA或IgM做為二級抗體與該抗體結合，以進行第Ⅱ型膠原片段的西方墨點法，確認該抗體具有專一性結合該第Ⅱ型膠原片段之功能。
本實施例之西方墨點法係經由下列步驟所述：於一樣品承置片滴上一預定體積之液體樣本，並等待該液體樣本
風乾，以一阻隔試劑與該液體所包含之蛋白質反應20~24小時，使該蛋白質固定於該樣品承置片上，取一預定濃度之第Ⅱ型膠原片段抗體與該固定後之液體樣本反應2±0.25小時，再與抗-鼠之HRP-IgG之二級抗體反應1±0.25小時，得到該樣品承置片之顯色結果，更詳言之，該樣品承置片上產生沉澱而顯色者即為陽性反應(未顯色者為陰性反應)，且該沉澱顏色越深，代表該液體樣本中所包含之第Ⅱ型膠原片段量越多。
本實施例係選擇以硝化纖維紙(Nitrocellulose paper)作為該樣品承置片，該液體樣本係選擇為罹患退化性關節炎病患之尿液，將該尿液濃縮乾燥後，稀釋成10、50、100、150及200 ng/μl，測試本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體所能偵側之最低尿蛋白濃度，本實施例之第Ⅱ型膠原片段抗體及二級抗體皆係以稀釋5000倍之濃度為測試濃度。
請參照第1圖所示，本實施例係以不同濃度10、50、100、150及200 ng之液體樣本(分別為第A1~A5組)滴於一硝化纖維紙上，待風乾後以5%之脫脂牛奶做為該阻隔試劑，覆蓋於該風乾後之液體樣本上，並經過4小時後，以PBS緩衝溶液沖洗該風乾後的液體樣本3次(每次5分鐘)，以稀釋5000倍之第Ⅱ型膠原片段抗體與該固定後之液體樣本反應1小時後，以PBS緩衝溶液沖洗該固定後的液體樣本3次(每次10分鐘)，再以稀釋5000倍之抗-鼠之HRP-IgG二級抗體反應1小時，以西方墨點法之商用套組(Western Blotting Detection System，Millipore,Temecula,CA,USA)對各濃度之液體樣本與抗體雜合之結果進行顯
影；由圖中可知，本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體能夠偵測到濃度僅為50 ng/μl之液體樣本，並且能夠偵測得到不同液體樣本之濃度差異。
「本發明之第Ⅱ型膠原片段之抗體效價測試」
本發明之融合瘤細胞株之抗體效價測試，係取該融合瘤細胞株注射於該實驗鼠腹腔，使該實驗鼠產生腹水，根據免疫反應，該腹水中內含有第Ⅱ型膠原片段之抗體，以protein A管柱純化該腹水中的第Ⅱ型膠原片段之抗體，將經純化之抗體溶於PBS緩衝液(Phosphate Buffered Saline,137 mM之NaCl,2.7 mM之KCl,10 mM之Na2
HPO4
,2 mM之KH2
PO4
)中，得到一抗體溶液，並使該抗體溶液之濃度調整為1毫克/毫升(mg/ml)，進行適當序列稀釋後以上述西方墨點法測試不同稀釋倍數之抗體效價。
請參照第2a至2c圖所示，本實施例係取稀釋倍數為5×103
、4×104
、及1×106
倍之第Ⅱ型膠原片段抗體(濃度為1 mg/ml)，與病患(編號為S44、S45及S49)及正常人(編號為N7、N2及N10)尿液檢體濃縮之尿蛋白500 ng進行西方墨點法。本實施例之第Ⅱ型膠原片段抗體能夠在稀釋1×106
倍仍具有偵側效果，並且，該第Ⅱ型膠原片段抗體對該第Ⅱ型膠原片段之偵測效果最佳係稀釋可達1×106
倍；由此可知，本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體的效價為5×103
至1×106
倍，本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體確實能夠用以偵測尿液樣本中的第Ⅱ型膠原片段。
「石英晶體微天秤偵測試驗」
本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體亦可以配合已知第Ⅱ
型膠原片段抗原表位之抗體進行偵測試驗。更詳言之，本實施例係將本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體覆於(Coating)該QCM之偵測電極上，將該電極上的抗體與抗原反應，以QCM的振動頻率作為偵測該抗原/抗體間鍵結反應的參數值。
本實施例以QCM偵測該第Ⅱ型膠原片段抗體之操作步驟如下：先以0.5 M的硫酸溶液清洗QCM之偵測電極後，再利用循環伏特法(cyclic voltammetry)以100 mV/s掃描5個循環後，以去離子水清洗後以氮氣吹乾。
將此偵測電極浸於含有2.5 mM之硫辛酸(thioctic acid，簡稱TA)之酒精溶液中，避光置於室溫24小時，以酒精清洗後用氮氣吹乾置於室溫備用。將該偵測電極浸泡於0.2 M之偶合劑(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，簡稱EDC)，於室溫中進行活化3小時，再以酒精清洗後以氮氣吹乾。於該偵測電極表面滴上20 μl的第Ⅱ型膠原片段抗體(濃度為1 mg/ml)，置於4℃，使該第Ⅱ型膠原片段抗體與該偵測電極之表面接合。再將該偵測電極以PBS浸潤，再浸於5%之胎牛血清(bovine serum albumin，簡稱BSA)1.5小時進行無抗體鍵結區之覆蓋，再以PBS浸潤該偵測電極後以氮氣吹乾。
該QCM之測量方法如下：該QCM之頻率設定為10MHz進行實驗，將製備好的偵測電極放於偵測槽中，再注入PBS溶液(pH 7.4)以穩定設備。待共振的頻率穩定後
，將稀釋好的不同濃度之第Ⅱ型膠原片段標準蛋白溶液分批注入偵測槽中進行測量振動頻率，為避免非專一性的鍵結，頻率記錄器紀錄25分鐘內的振動頻率，當抗體與抗原鍵結越多則振動頻率越強。不同濃度之抗原皆進行三個重複試驗，再利用偵測的頻率與已知的蛋白濃度建立一偵測抗原之迴歸曲線。
請參照第3圖所示，抗原濃度與震動頻率呈現正相關，該迴歸方程式為Y=1.6424X-0.1709(R2
=0.9952)，是可信度相當高的線性關係，証實本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體確實能夠以QCM裝置偵測該抗體及抗原的鍵結反應，且該反應係與該抗原之濃度具有正相關。
本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體係能夠用來作為一種快速檢測退化性關節炎之試劑，確實能夠偵測到尿液樣本中的第Ⅱ型膠原片段。本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體可進一步用以開發生產一快速檢測試劑，將本發明之第Ⅱ型膠原片段抗體固定於一檢測試紙上，即可直接針對尿液樣本進行檢測，並由檢測試紙呈色之深淺，判定軟骨退化狀況，該檢測試紙呈色越深係與軟骨退化情形呈正相關，藉此可以隨時於家中進行檢測軟骨之退化情形，進而能早期發現、早期治療，使可能罹患退化性關節炎之高危險族群能夠預先防範。
由上述可知，本發明之生產第Ⅱ型膠原片段抗體之融合瘤細胞，該融合瘤細胞所生產之抗體能夠與該第Ⅱ型膠原片段有效地結合以檢測退化性關節炎，具有降低用以檢測退化性關節炎抗體製備成本之功效。
本發明之以尿液檢測退化性關節炎之方法，能夠以單一種抗體偵測到尿液樣本中微量之第Ⅱ型膠原片段，使該抗體能夠作為一種居家檢測用試劑，具有簡化檢測步驟之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖：本實施例不同稀釋濃度之抗體與500 ng之尿液樣本濃縮蛋白之西方墨點法結果圖。
第2a圖：本實施例稀釋倍數為5×103
倍之第Ⅱ型膠原片段抗體之西方墨點法結果圖。
第2b圖：本實施例稀釋倍數為4×104
倍之第Ⅱ型膠原片段抗體之西方墨點法結果圖。
第2c圖：本實施例稀釋倍數為1×106
倍之第Ⅱ型膠原片段抗體之西方墨點法結果圖。
第3圖：本實施例以QCM偵測第Ⅱ型膠原片段抗體與不同濃度之第Ⅱ型膠原片段之迴歸曲線。
<110> 義守大學
<120> 用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體的融合瘤細胞株、及以尿液檢測退化性關節炎之方法
<160> 1
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該胜肽片段係根據人類第Ⅱ型膠原片段所設計
<400> SEQ ID NO：1
Claims (8)
- 一種用以生產第Ⅱ型膠原片段抗體的融合瘤細胞株，該融合瘤細胞株係寄存於新竹食品科學工業發展研究所，寄存編號為BCRC 960423，該抗體係專一性結合於第Ⅱ型膠原片段，該第Ⅱ型膠原片段係包含如SEQ ID NO：1所示之胜肽片段。
- 一種以尿液檢測退化性關節炎之方法，係利用如申請專利範圍第1項所述之融合瘤細胞株所生產的抗體，針對一尿液檢體進行退化性關節炎的檢測，該抗體係作為一級抗體專一地與尿液中之第Ⅱ型膠原片段結合，該第Ⅱ型膠原片段係包含如SEQ ID NO：1所示之胜肽片段。
- 如申請專利範圍第2項所述之以尿液檢測退化性關節炎之方法，其中，該抗體係來自如申請專利範圍第1項所述之融合瘤細胞株，該抗體之效價係5×103 至1×106 倍。
- 如申請專利範圍第2項所述之以尿液檢測退化性關節炎之方法，其中，該抗體係與該第Ⅱ型膠原片段進行西方墨點法。
- 如申請專利範圍第4項所述之以尿液檢測退化性關節炎之方法，其中，該西方墨點法係取一尿液檢體滴於一樣品承置片，待該尿液檢體風乾後，以該抗體偵測該尿液檢體中之第Ⅱ型膠原片段，該抗體與該第Ⅱ型膠原片段反應發生凝集作用而產生一沉澱物。
- 如申請專利範圍第5項所述之以尿液檢測退化性關節 炎之方法，其中，該尿液檢體風乾後，以一阻隔試劑與該尿液檢體之蛋白質反應，使該蛋白質固定於該樣品承置片上，再與該抗體反應。
- 如申請專利範圍第2項所述之以尿液檢測退化性關節炎之方法，其中，該抗體係固定於一檢測試紙上，將該尿液檢體與該檢測試紙之抗體接觸，該檢測試紙呈色越深係與軟骨退化狀況呈正相關。
- 如申請專利範圍第2項所述之以尿液檢測退化性關節炎之方法，其中，該抗體係與該第Ⅱ型膠原片段進行石英晶體微天秤試驗。
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