CN107870239B - nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种nAChR‑α1‑ECD蛋白在医疗检测中的应用，其特征在于，该蛋白的氨基酸系列为SEQ ID 1，其中，该蛋白的分子量为28.7kDa，等电点为6.0。并且还进一步提供了使用该nAChR‑α1‑ECD蛋白通过ELISA间接法、WB蛋白免疫印迹法检测患者血清中是否存在nAChR‑Ab或进一步检测其浓度的具体方法。由于使用的是大肠杆菌表达的nAChR‑α1‑ECD蛋白，成分明确，纯度高，检测结果可靠重复性好。同时由于该蛋白是人工制备的，检测成本低。

Description

nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用
技术领域
本发明涉及nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，属于生物化学领域。
背景技术
上海长海医院神经内科1978年开始开展重症肌无力(MG)临床试验研究，曾采用电鳐及人类肌肉提取nAChR抗原，检测重症肌无力nAChR抗体(nAChR-Ab)。该方法因取材日益受限不得已停用。
然而，目前市场上还没有人体AChR-Ab的临床检测试剂盒销售，沿用老办法继续使用动物或人体肌肉提取，操作复杂、成本高，而且也无法满足现实中大量病患检测的需求。而直接根据人体nAChR的氨基酸序列人工合成后进行基因表达，虽然能得到目标蛋白，但往往因为目标蛋白的性质原因而难以分离或者分离的纯度不高、收率低。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种nAChR-α1-ECD蛋白及其制备方法和该蛋白在医疗检测中的应用。
本发明提供了一种nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，其特征在于，该蛋白的氨基酸系列为SEQ ID 1，其中，该蛋白的分子量为28.7kDa，等电点为6.0。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于：医疗检测中的应用是检测患者血清中是否存在nAChR-Ab或进一步检测其浓度。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一，将nAChR-α1-ECD蛋白用10％SDS-PAGE进行蛋白质电泳，经转膜获得结合有nAChR-α1-ECD蛋白的蛋白膜；
步骤二，将待测血清用5％BSA浓度的PBST封闭液以1:500～1:2000的倍率稀释，与制备的蛋白膜低温孵育；
步骤三，使用0.2％的PBST溶液洗膜，用抗人IgG二抗与步骤二中的蛋白膜室温孵育；
步骤四，洗膜后ECL显影或直接用蛋白膜扫描仪扫描，分析28.7kDa条带的强度，与阴性对照比较，判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤二中的稀释倍率为1：1000。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤二中的蛋白膜低温孵育的温度为0-4℃。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将nAChR-α1-ECD蛋白用PBS稀释为5μg/mL包被96孔板，每孔100μL包被，低温静置；
步骤二，弃去抗原包被液，用PBST充分洗涤包被板各孔3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤三，非特异性位点封闭，每孔加入200μL 1％BSA浓度的PBST封闭液，37℃孵育1小时；
步骤四，第一次洗板，弃去每孔中的封闭液，用PBST充分洗涤各孔多次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤五，血清抗体孵育，每孔加入1:50稀释的待测血清50μL，37℃孵育2小时；
步骤六，第二次洗板：弃去每孔中的稀释血清，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤七，酶标二抗孵育：每孔加入100μL酶标抗人IgG二抗，25℃孵育0.5小时；
步骤八，第三次洗板：弃去每孔中的酶标二抗，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤九，显色，每孔加入显色液100μL，25℃避光孵育15分钟，再加入100μL终止液；
步骤十，测光密度OD值，酶标仪检测450/630nm波长的光密度OD值，绘制曲线，与阴性对照比较判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性。
本发明提供的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤一中低温静置的温度为0-4℃时间为6-12小时。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，使用蛋白印迹法、酶联免疫吸附法对人待测血清是否为抗nAChR抗体阳性，由于使用的是大肠杆菌表达的nAChR-α1-ECD蛋白，成分明确，纯度高，检测结果可靠重复性好。同时由于该蛋白是人工制备的，检测成本低。
附图说明
图1是本发明的SEQ ID 2序列插入表达载体的过程示意图；
图2是本发明的SEQ ID 2大肠杆菌转化及表达实验的电泳检测结果照片；
图3是本发明的SEQ ID 2大肠杆菌菌株摇瓶放大发酵后经裂解的电泳实验结果照片
图4是本发明的大肠杆菌菌体裂解获取包涵体后的电泳实验结果照片；
图5是.包涵体增溶验证后的电泳实验结果照片；
图6是AChR-α1-ECD蛋白纯化后的电泳实验结果照片；
图7是AChR-α1-ECD蛋白复性后的电泳实验结果照片；
图8是AChR-α1-ECD蛋白复性后蛋白纯化后的电泳实验结果照片；
图9是大肠杆菌转化及表达结果验证实验的电泳结果照片；以及
图10是AChR-α1-ECD蛋白性质验证实验的电泳结果照片。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的nAChR-α1-ECD蛋白及其制备方法和该蛋白在医疗检测中的应用作具体阐述。
实施例中出现的试剂除特别表明来源外，均为商业购买。
IPTG，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。
LB培养基，Luria-Bertani培养基。
mM即mmol/L。
Tris即三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液。
Gua-HCl即盐酸胍。
M即mol/L。
EDTA即乙二胺四乙酸。
DTT即二硫苏糖醇。
WB，即Westernblot蛋白质印迹缩写。
Tween，吐温，聚山梨酯，后面的数值表示依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同。
BSA，牛血清白蛋白。
Triton100，即TritonX-100-100，中文名聚乙二醇辛基苯基醚。
PBS，全称Phosphate Buffered Saline，在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。
一.制备部分
1.载体构建
在AChR-α1-ECD的蛋白基础上设计以下的SEQ ID 1序列，
SEQ ID 1：
MNHKVHHHHHHMSEHETRLVAKLFKDYSSVVRPVEDHRQVVEVTVGLQLIQLINVDEVNQIVTTNVRL KQGDMVDLPRPSCVTLGVPLFSHLQNEQWVDYNLKWNPDDYGGVKKIHIPSEKIWRPDLVLYNNADGDFAIVKFTK VLLQYTGHITWTPPAIFKSYCEIIVTHFPFDEQNCSMKLGTWTYDGSVVAINPESDQPDLSNFMESGEWVIKESRG WKHSVTYSCCPDTPYLDITYHFVMQRL*
其中的划线部分AChR-α1-ECD蛋白中的第21-255位共235个氨基酸，为其胞外段，MNHKVHHHHHHM系列为其N端插入的His序列，便于后期的蛋白过柱纯化。
根据SEQ ID 1氨基酸序列，设计并体外合成相应cDNA序列SEQ ID 2，体外合成采用常规的方法完成。
将上述SEQ ID 2序列插入表达载体：pCold II，插入位点为Nde I/Hind III，如图1所示。
通过质粒转化细菌，使其表达AChR-α1-ECD，同时在其N端插入His序列，便于后期的蛋白过柱纯化。
该蛋白氨基酸数：247氨基酸(247aa)，分子量：28.7kDa，等电点：6.0。
2.大肠杆菌BL21(DE3)转化及表达验证
将pCold II-AChR-α1-ECD质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素平板过夜培养，挑选单克隆菌落，用IPTG诱导扩增做表达小试。
分别对
A：未用IPTG诱导的细菌裂解液
B：用IPTG诱导的细菌裂解液
B1-4：4个挑取的单菌落克隆分别用IPTG诱导的细菌裂解液
C：用IPTG诱导的细菌裂解液上清
D：用IPTG诱导的细菌裂解液沉淀
MK：标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图2所示，经分析表明：
1)经转化的细菌可以表达分子量为28kDa左右的蛋白，提示为目的蛋白。
2)目的蛋白存在于细菌裂解液沉淀中，提示蛋白以包涵体形式存在。
3.AChR-α1-ECD BL21(DE3)表达菌株摇瓶放大发酵
将100mL小试表达的菌液接种至1L LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/mL)，摇菌扩增细菌至波长600nm的光密度OD为1.0时，加入终浓度为0.1mM IPTG，37℃诱导表达3小时。收取菌液并裂解跑胶，验证蛋白表达情况。
分别对
A：未用IPTG诱导的细菌裂解液
B：用IPTG诱导的细菌裂解液
C：用IPTG诱导的细菌裂解液上清
D：用IPTG诱导的细菌裂解液沉淀
MK：标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图3所示，经分析表明：经放大摇菌后，目的蛋白仍存在于细菌裂解液沉淀中(即图3中的箭头指示的电泳带)，以包涵体形式存在。
4.AChR-α1-ECD蛋白纯化
4.1大肠杆菌菌体裂解获取包涵体
步骤1)，将菌体重悬于缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，PH 8.0)中，冰水浴条件下超声裂解细胞。
步骤2)，超声结束后离心，将上清(A)移至锥形瓶1储存，将沉淀(包涵体)用包涵体洗涤液(20mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton100，PH 8.0)重悬(B)，转移至250mL烧杯中超声。
步骤2)超声结束后离心，将上清(C)移至锥形瓶2储存，将沉淀(包涵体)用缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，PH 8.0)重悬，转移至250mL烧杯中超声1次。超声结束后取200μLbuffer1包涵体重悬液(D)待测。
步骤2)超声结束后离心，将上清移至锥形瓶3储存，将沉淀(包涵体)用包涵体增溶液增溶。先将沉淀用玻璃棒搅松，加包涵体增溶液(50mM Tris，6M Gua，5mM EDTA，PH 8.0，用前加1M DTT至终浓度10mM(100×))溶解搅拌。在磁力搅拌器上室温搅拌过夜。
分别对
MK：标准蛋白
上清(A)
重悬(B)
上清(C)
包涵体重悬液(D)
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图4所示，经分析表明：目的蛋白表达在包涵体中。
4.2.包涵体增溶验证
将前一天增溶过夜的包涵体溶液移至50mL离心管，12000rpm×20min离心，取上清跑胶验证。
分别对
A：前一天增溶过夜的包涵体溶液
MK：标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图5所示，经分析表明：目的蛋白存在于经增溶的包涵体溶液中。
4.3.AChR-α1-ECD蛋白纯化
上一步中获得的包涵体增溶上清上样到cOmplete His柱。采用梯度浓度咪唑溶液洗脱，以获得较纯的目的蛋白组分。
分别对
A：上样(25ml)
B：流穿液(50ml)
C：流穿液(50ml)
D：流穿液(50ml)
E：流穿液(50ml)(8M尿素)
F：20mM咪唑洗脱液(40ml)
G：50mM咪唑的洗脱液洗脱(40ml)
H：50mM咪唑的洗脱液洗脱(30ml)
I：250mM咪唑洗脱液(40ml)
J：500mM咪唑洗脱液(40ml)
MK:蛋白标准
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图6所示，经分析表明：目的蛋白主要在50mM和250mM咪唑洗脱液中洗脱获得。流穿液可以进一步挂柱纯化。收集G、H、I组分做后期蛋白透析复性。
4.4.AChR-α1-ECD蛋白复性
将上述G、H、I组分置于透析袋中，依次用4M尿素、2M尿素、500mg/L半胱氨酸溶液过夜复性。
分别对
A:复性后蛋白上清(还原)
B:复性后蛋白上清(非还原)
MK:蛋白标准Marker
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图7所示，图中的箭头处即为目标蛋白，经分析表明：经复性后，还原状态下电泳可得到目的蛋白片段。
4.5.复性后蛋白纯化
将上一步中获得的复性后蛋白上样到Ni螯合柱，依次采用梯度浓度咪唑洗脱。
分别对
A：上样(50ml)
B：流穿(50ml)
C：流穿(40ml)
D：20mM咪唑洗脱液(30ml)
E：500mM咪唑洗脱液1(30ml)
F：500mM咪唑洗脱液2(30ml)
MK:标准蛋白
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图8所示，经分析表明：目的蛋白主要存在于流穿液和500mM咪唑洗脱液中。此步可以省略，复性后的溶液可以直接透析至最终体系，不需要下一步柱回收，因为WB已经验证(流穿和挂在柱上的目的蛋白WB都呈阳性)，并且后面柱回收的时候没有纯化效果。
4.6.获取AChR-α1-ECD蛋白产品
浓缩透析上述4.5步骤中的E、F组分至20mM Tris，150mM NaCl，500mg/Lcysteine，pH 8.5溶液中跑胶验证终组分。
分别对
MK：标准蛋白
A：E组分浓缩透析液(还原)
B：E组分浓缩透析液(非还原)
C：F组分浓缩透析液(还原)
D：F组分浓缩透析液(非还原)
进行电泳检测验证大肠杆菌转化及表达结果，结果如图9所示，经计数和分析表明：
组分 E F
蛋白浓度(mg/mL) 0.5 0.28
体积(mL) 18 12
蛋白量(mg) 9 3.36
分装(mL/管) 0.2 0.2
管数(管) 90 60
5.蛋白性质验证
利用免疫印迹法，用商品化的抗体验证前述纯化的蛋白。
为验证前述纯化蛋白的性质，我们自Alomone labs公司购买了Anti-NicotinicAcetylcholine Receptor α1(extracellular)抗体(ANC-001)。该抗体是由nAChR-α1亚基的22-34氨基酸肽段免疫兔子所得，作为nAChR-α1-ECD特异性抗体验证本实验所纯化的蛋白性质，为后期筛选患者阳性血清奠定坚实基础。Western blot结果如图10所示：
1：蛋白质标准品
2：无蛋白的阴性溶液
3：纯化过柱后的E1蛋白组分(对应于前述E：500mM咪唑洗脱液1)
4：纯化过柱后的E2蛋白组分(对应于前述F：500mM咪唑洗脱液2)
5：无关蛋白
6：纯化过柱后的E1蛋白组分(对应于前述E：500mM咪唑洗脱液1)
7：纯化过柱后的E2蛋白组分(对应于前述F：500mM咪唑洗脱液2)
ANC-001与纯化的两个组分均可特异性地结合(图10中的3、4)，但不能与无关蛋白(图10中的5)结合。
本蛋白表达含His标签，为证实该蛋白为质粒转化细菌所得，我们用抗His抗体亦可与本实验纯化两个组分结合(图10中的6、7)，获得28kD附近的条带。说明该条带即为质粒转化细菌所得。
二.应用部分
应用以上制备的nAChR-α1-ECD蛋白进行患者血清nAChR-Ab阳性或者浓度检测。具有以下两个方法：
方法一：蛋白印迹法(western blot法)
将前期获得的nAChR-α1-ECD进行蛋白质电泳，制备检测膜条，建立蛋白印迹法检测患者血清的nAChR-Ab浓度。
基本步骤：
1)将前期获得的nAChR-α1-ECD用10％SDS-PAGE进行蛋白质电泳，经转膜获得结合有nAChR-α1-ECD蛋白(28.7kDa)的蛋白膜。
2)用我实验室前期实验证实为nAChR-Ab阳性血清作为一抗，与步骤1)获得的蛋白膜反应，摸索得到1:500～1:2000为合适的血清稀释比例。
3)预制蛋白膜，将其切割成宽3mm的膜条，每条上的蛋白量为5μg。冷冻备用。
4)将待测血清用5％BSA(inPBST)封闭液以1:1000稀释，与制备的膜条4℃孵育过夜。
5)次日PBST(0.2％Tween in PBS)洗膜，用抗人IgG二抗与蛋白膜室温孵育1小时。
6)洗膜后ECL显影或直接用蛋白膜扫描仪扫描，分析28.7kDa条带的强度。与阴性对照比较，判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性。
方法二：酶联免疫吸附法(ELISA法)
上述nAChR-α1-ECD蛋白经过纯化，将其作为抗原用于检测人血清中的AChR抗体。
参考涂来慧、张仁琴、沈茜研究论文“简化ELISA在检测重症肌无力烟碱型乙酰胆碱受体抗体的临床应用”(中国免疫学杂志，1993年第4期)来筛选合适的测试方法，筛选实验方法如下：
1.棋盘实验，摸索合适的抗原包被浓度和血清稀释度。
抗原：采用前期表达纯化的nAChR-α1-ECD蛋白，获得2批纯化蛋白，蛋白浓度分别为0.5mg/mL和0.28mg/mL。完整的nAChR-α1蛋白分子量为54.546kDa，nAChR-α1-ECD蛋白分子量为28.7kDa。涂来慧论文报道采用11μg/mL人肌肉提取蛋白作为抗原包被浓度，本实验拟以1～20μg/mL的nAChR-α1-ECD浓度，摸索合适的抗原包被浓度。
抗体：采用前期实验确诊的MG患者血清和健康人血清，以1:25～1:12800的血清稀释比例，摸索合适的血清稀释度。
每孔采用的蛋白浓度和血清稀释比例如下：
Figure BDA0001407590050000151
每块96孔板初步采用4个抗原浓度(1/5/10/20μg/mL)摸索条件，每孔包被100μL，每个浓度抗原需包被24个孔，各需准备3mL稀释为工作浓度的抗原溶液。
以0.5mg/mL纯化抗原包被96孔板，用PBS稀释，稀释比例如下：
Figure BDA0001407590050000161
以0.28mg/mL纯化抗原包被96孔板，用PBS稀释，稀释比例如下：
Figure BDA0001407590050000162
96孔板血清(一抗)分布如下，E～H为A～D的重复：
Figure BDA0001407590050000163
以上每种条件采用复孔检测(96孔板上下A～D行和E～H行为重复)。将检测结果OD值作图，找到线性部分，并进一步调整抗原浓度和血清稀释度，以期找到合适的反应条件。
血清nAChR-Ab检测采用ELISA间接法，实验步骤如下：
1)抗原包被(antigen incubation)：采用上表抗原浓度依次稀释纯化抗原，以每孔100μL包被板，4℃过夜。
2)洗涤(washing)：弃去抗原包被液，使用PBST充分洗涤包被板各孔，可使用洗板机洗涤3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
3)非特异性位点封闭(blocking)：各包被孔中加入200μL/孔封闭液(5％BSA)，37℃孵育30分钟。
4)洗涤(washing)：弃去每孔中的稀释血清，使用PBST充分洗涤包被板各孔，可使用洗板机洗涤3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
5)血清抗体孵育(primary antibody incubation)：用封闭缓冲液梯度稀释血清，每孔加入50μL稀释血清，37℃孵育2小时。
6)洗涤(washing)：弃去每孔中的稀释血清，使用PBST充分洗涤包被板各孔，可使用洗板机洗涤3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
7)二抗孵育(secondary antibody incubation)：每孔加入50μL酶标抗人IgG二抗，37℃孵育2小时。
8)洗涤(washing)：弃去每孔中的酶标二抗，使用PBST充分洗涤包被板各孔，可使用洗板机洗涤3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
9)显色：将显色液A和B混合后，每孔加入100μL，室温避光孵育15分钟，再加入50μL终止液。
10)测OD值：酶标仪检测OD值，绘制曲线。
2.特异抑制实验
将同一MG患者不同稀释度的nAChR-Ab阳性血清，其中一组直接加入到nAChR包被板孔中；另一组先与纯化的nAChR-α1-ECD蛋白孵育，然后再加入到nAChR包被板孔中。理想情况为，与纯化的nAChR-α1-ECD蛋白预孵育组的实测OD值应被抑制，可说明本系统中纯化的nAChR-α1-ECD蛋白与血清抗体反应是特异性结合。
3.重复性实验
3.1批内重复性：分别采用nAChR-Ab高低值标本连续重复检测20次，计算其OD值SD和CV。
3.2批间重复性：分别采用nAChR-Ab高低值标本连续检测5天，每天上下午各检测2次，共20次，计算其450/630nm波长的光密度OD值的标准差SD和变异系数(Coefficient OfVariation)CV。批内和批间重复性可反映该实验体系的稳定性。
4.确定参考值
采用100名正常人血清，检测其OD值，取其95％分位值作为正常上限。
5.重症肌无力(MG)不同亚型及其他疾病患者血清抗体检测。
5.1抗体水平及阳性率与MG临床分型的关系。
5.2抗体水平及阳性率与胸腺瘤的关系。
经上述筛选实验条件摸索，确定ELISA法实验本发明的nAChR-α1-ECD作为抗原检测nAChR-Ab的操作步骤如下：
1)采用前期实验获得的nAChR-α1-ECD蛋白，用PBS稀释为5μg/mL包被96孔板，每孔100μL包被，4℃过夜。
2)次日，弃去抗原包被液，用PBST(0.2％Tween in PBS)充分洗涤包被板各孔3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
3)非特异性位点封闭：每孔加入200μL 1％BSA(in PBST)封闭液，37℃孵育1小时。
4)洗板：弃去每孔中的封闭液，用PBST充分洗涤各孔3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
5)血清抗体孵育：每孔加入1:50稀释的待测血清50μL，37℃孵育2小时。
6)洗板：弃去每孔中的稀释血清，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
7)酶标二抗孵育：每孔加入100μL酶标抗人IgG二抗，25℃孵育0.5小时。
8)洗板：弃去每孔中的酶标二抗，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干。
9)显色：每孔加入显色液100μL，25℃避光孵育15分钟，再加入100μL终止液。
10)测OD值：Thermo MK3酶标仪检测450/630nm波长处的光密度OD值，绘制曲线。与阴性对照比较，判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性，并可对抗体浓度进行半定量分析。
实施例的作用与效果
根据本发明所涉及的nAChR-α1-ECD蛋白在医疗检测中的应用，使用蛋白印迹法、酶联免疫吸附法对人待测血清是否为抗nAChR抗体阳性，由于使用的是大肠杆菌表达的nAChR-α1-ECD蛋白，成分明确，纯度高，检测结果可靠重复性好。同时由于该蛋白是人工制备的，检测成本低。
另外本实施例还提供了两种应用本发明制备的nAChR-α1-ECD蛋白来对人体血清是否为抗nAChR抗体阳性以及抗体浓度的检测方法。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID 1，
SEQ ID 1：
MNHKVHHHHHHMSEHETRLVAKLFKDYSSVVRPVEDHRQVVEVTVGLQLIQLINVDEVNQIVTTNVRLKQGDMVDLPRPSCVTLGVPLFSHLQNEQWVDYNLKWNPDDYGGVKKIHIPSEKIWRPDLVLYNNADGDFAIVKFTKVLLQYTGHITWTPPAIFKSYCEIIVTHFPFDEQNCSMKLGTWTYDGSVVAINPESDQPDLSNFMESGEWVIKESRGWKHSVTYSCCPDTPYLDITYHFVMQRL*
其中，MNHKVHHHHHHM序列为其N端插入的His序列，便于后期的蛋白过柱纯化，
MNHKVHHHHHHM序列后的AChR-α1-ECD蛋白中的第21-255位共235个氨基酸，为其胞外段，
该蛋白氨基酸数：247氨基酸（247aa），分子量： 28.7kDa，等电点：6.0 ，
所述检测物的应用是检测患者血清中是否存在nAChR-Ab或进一步检测其浓度。
2.根据权利要求1所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于：
根据SEQ ID 1氨基酸序列，设计并体外合成相应cDNA序列SEQ ID 2，
将所述SEQ ID 2序列插入表达载体：pCold II，插入位点为Nde I / Hind III。
3.根据权利要求1所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一，将所述nAChR-α1-ECD蛋白用10% SDS-PAGE进行蛋白质电泳，经转膜获得结合有nAChR-α1-ECD蛋白的蛋白膜；
步骤二，将待测血清用5%BSA浓度的PBST封闭液以1:500～1:2000的倍率稀释，与制备的蛋白膜低温孵育；
步骤三，使用0.2% 的PBST溶液洗膜，用抗人IgG二抗与步骤二中的蛋白膜室温孵育；
步骤四，洗膜后ECL显影或直接用蛋白膜扫描仪扫描，分析28.7kDa条带的强度，与阴性对照比较，判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性。
4.根据权利要求3所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于：
其中，步骤二中的稀释倍率为1：1000。
5.根据权利要求3所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于：
其中，步骤二中的蛋白膜低温孵育的温度为0-4℃。
6.根据权利要求2所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将所述nAChR-α1-ECD蛋白用PBS稀释为5μg/mL包被96孔板，每孔100 μL包被，低温静置；
步骤二，弃去抗原包被液，用PBST充分洗涤包被板各孔3次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤三，非特异性位点封闭，每孔加入200 μL 1% BSA浓度的 PBST封闭液，37℃孵育1小时；
步骤四，第一次洗板，弃去每孔中的封闭液，用PBST充分洗涤各孔多次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤五，血清抗体孵育，每孔加入1:50稀释的待测血清50 μL，37℃孵育2小时；
步骤六，第二次洗板：弃去每孔中的稀释血清，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤七，酶标二抗孵育：每孔加入100 μL 酶标抗人IgG二抗，25℃孵育0.5小时；
步骤八，第三次洗板：弃去每孔中的酶标二抗，用PBST充分洗涤各孔5次，每次洗涤后倒扣于吸水纸上拍干；
步骤九，显色，每孔加入显色液100 μL，25℃避光孵育15分钟，再加入100 μL终止液；
步骤十，测光密度OD值，酶标仪检测450/630 nm波长的光密度OD值，绘制曲线，与阴性对照比较判断待测血清是否为抗nAChR抗体阳性。
7.根据权利要求6所述的nAChR-α1-ECD蛋白在制备检测nAChR-Ab的检测物中的应用，其特征在于：
其中，步骤一中低温静置的温度为0-4℃时间为6-12小时。
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