JPWO2009008414A1 - Mmp13に対する中和活性を有するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
MMP13の触媒ドメインは前記したように、MMP2、MMP1、MMP8、MMP9等の触媒ドメインとアミノ酸配列が保存されていることから、MMP13の活性に関与する領域を認識し、かつMMP13特異的反応性を有する中和抗体を作製することは困難であった。実際に、MMP13あるいはそのペプチドを抗原として用いて、MMP13の酵素活性を阻害する中和モノクローナル抗体を得たという報告はない。
(1)MMP13と特異的に結合するモノクローナル抗体であって、MMP13のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体、
(2)配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする(1)記載のモノクローナル抗体、
(3)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする(1)または(2)記載のモノクローナル抗体、
(4)受領番号がFERM ABP−10968であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体の性質を有することを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
(5)受領番号がFERM ABP−10968であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体である、(1)〜(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
(6)ヒト抗体である、(1)〜(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ、
(8)受領番号がFERM ABP−10968である(7)記載のハイブリドーマ、
(9)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするMMP13の免疫学的測定方法、
(10)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするMMP13の酵素活性中和方法、
(11)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むMMP13が関与する疾患の診断薬、
(12)MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である(11)記載の診断薬、
(13)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、MMP13が関与する疾患を治療または予防するための医薬組成物、
(14)MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である(13)記載の医薬組成物、
(15)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物を投与する工程を包含する、MMP13が関与する疾患を処置または予防するための方法、
(16)MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である(15)記載の疾患を処置または予防するための方法、
(17)(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体の、MMP13が関与する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための使用、
(18)MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である(17)記載の医薬の製造のための使用、
(19)MMP13が関与する疾患の処置または予防に使用するための(1)〜(6)のいずれかに記載のモノクローナル抗体、
(20)MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である(19)記載のモノクローナル抗体、に関する。
本発明におけるMMP13、特にはヒトのMMP13は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。そのようなアミノ酸の置換、欠失、または挿入は常法に従って行うことができる(実験医学別冊・「遺伝子工学ハンドブック」(1992)など)。
本発明の「MMP13の免疫学的測定方法」は、MMP13に対するモノクローナル抗体及び固相担体用としてMMP13に対するモノクローナル抗体を用い、被検試料中のMMP13を分別定量する優れた方法及びその為の試薬キットを提供する。好ましくは、MMP13の関与する疾患の診断薬として有用である。特に好ましくは、癌、リュウマチ、または変形性関節症を診断できる診断薬として有用である。
実施例
抗体がMMP13の酵素活性を阻害するためには、酵素活性中心を認識する抗体であることが望ましいが、MMP13の酵素活性中心はタンパク質の内部に埋もれている。そのために、抗体が活性中心に結合することは困難であることが予想される。そこで、MMP13の活性中心近傍で、タンパク質の表面に露出する部分であることが望ましい。そこで、ヒトMMP13触媒ドメインの立体構造(Protein Data Bank ID:1YOU)を参考に、配列番号2記載のヒトMMP13の225位〜246位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドを免疫原として選定した。また、選定したMMP13の部分ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト・マウス・ラット・ウサギ・イヌに共通する配列であることから、本ペプチドを免疫原として作製した抗体は上記動物種由来のMMP13を認識することが予想される。
ヒトMMP13部分ペプチド(225−246)のC末端にグリシン−システインを導入したペプチド(24アミノ酸)を合成した(Greiner Bio−one社製)。合成ヒトMMP13部分ペプチド10mgを1mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、10mgのgiant keyhole limpetsのヘモシアニン(マレイミド化KLH、PIERCE社製)を1mlの50%DMSOを含む5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものとを混合し、室温にて4時間、さらに、4℃で一晩反応させた。上記の混合液を蒸留水に対して透析後に、凍結乾燥し、MMP13部分ペプチド−KLH複合体11.53mgを得た。これを免疫原とした。調製したMMP13部分ペプチド−KLH複合体100μgをフロイント完全アジュバントと共に4週齢A/J Jms Slc雌マウス7匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、21日後及び42日後にMMP13部分ペプチド−KLH複合体100μgをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに71日後にヒトMMP13部分ペプチド−KLH複合体100μgを生理食塩水0.1mlに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
合成ヒトMMP13部分ペプチド0.4mgを0.4mlの5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解したものと、160μgのPEO−Maleimide activated biotin(PIERCE社製)を80μlの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で2時間反応後に、逆相HPLCにてビオチン標識されたヒトMMP13部分ペプチドを精製した。
最終免疫の3日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞(p3×63−Ag8.U1、東京腫瘤研究所)を50%のポリエチレングリコール4000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ラットMMP13の触媒ドメイン(アミノ酸:99−262)をコードするDNA断片を、制限酵素サイトBst1107とXbaIを介して発現ベクターpTrc99AHEに挿入し、常法に従って大腸菌(XL−1 Blue)にトランスフォーメーションし、組み換え大腸菌(MMP13−XL−1 Blue)を得た。MMP13−XL−1 Blueを200mlのLB/Ampicillin液体培地中で37℃で培養し、OD600が0.5になった時に0.1MのIPTGを200μl加え、ラットMMP13触媒ドメインの発現を誘導した。さらに、37℃で2時間培養後、菌体を遠心分離し、超音波処理後の不溶性画分を1mlの8M尿素溶液で可溶化した。さらに1mlの緩衝液U(6M尿素、0.01M CaCl2、0.3M NaCl、0.005% Brij35を含む50mM トリス緩衝液、pH7.9)を加え、遠心する。遠心後の上清をNi−NTAアガロース(キアゲン社製)を用いて精製した。ラットMMP13触媒ドメインを含む溶液をNi−NTAアガロースに通した後に、20mM Imidazoleを含む緩衝液Uで洗浄し、200mM Imidazoleを含む緩衝液Uで溶出した。溶出液中のラットMMP13触媒ドメインのリフォールディングは以下の操作で行った。1mlの溶出画分あたり7.8μlの2−メルカプトエタノール(ナカライテスク社製)を添加し、19mlの緩衝液T(0.01M CaCl2、0.3M NaCl、0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.4)を撹拌しながら徐々に添加、その後4℃で16時間放置し、遠心後の上清を回収した。
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたELSIAは以下の通りである。384穴マイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに0.35μgの抗マウスIgG抗体(シバヤギ社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5)を35μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を200μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った(抗マウスIgG抗体固相化プレート)。各ウェルを90μlの洗浄液で1回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清と30nMのリコンビナントラットMMP13触媒ドメインを含む10μlの緩衝液A(0.5% ウシ血清アルブミン、0.01% Tween80、0.05% Proclin150、0.15M NaClを含む50mMトリス緩衝液、pH7.4)及び0.05ngのビオチン標識ヒトMMP13部分ペプチドと2ngのStreptavidin−HRP(PIERCE社製)を含む10μlの緩衝液Aを加え、4℃で16時間反応させた。次に各ウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、25μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、25μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、ラットリコンビナントMMP13触媒ドメインと強い親和性を示したハイブリドーマのクローンを7つ選択し、限界希釈法により2回クローニングをして、MMP13を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを獲得した。獲得した7クローンについて、MMP13に特異性の高いクローンを2つ選択し、この2クローンの内、MMP13の酵素活性を阻害する作用を強く示したクローンを1つ選択し、14D10と命名した。14D10について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングELISAキット(BDバイオサイエンス社製)を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、14D10のアイソタイプはIgG2aであった。
MMP13抗体(14D10)のエピトープを同定するために、ヒトMMP13部分ペプチドをPeptide Synthesizer Model 431A(Applied Biosystems社製)により合成した。合成したペプチドは
ペプチド−1(ヒトMMP13の239位〜246位のアミノ酸配列)、ペプチド−2(ヒトMMP13の234位〜246位のアミノ酸配列)、ペプチド−3(ヒトMMP13の231位〜246位のアミノ酸配列)、ペプチド−4(ヒトMMP13の229位〜246位のアミノ酸配列)、ペプチド−5(ヒトMMP13の227位〜246位のアミノ酸配列)、ペプチド−6(ヒトMMP13の225位〜246位のアミノ酸配列)の6種類である。抗原認識部位を決定したELISAは以下の方法で行った。96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)に1.5μgの抗マウスIgG抗体(シバヤギ社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5)を150μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を300μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った(抗マウスIgG抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で1回洗浄した後、100nMの各種MMP13部分ペプチド(1−6)を含む50μlの緩衝液Aと0.1ngのビオチン標識ヒトMMP13部分ペプチド(225−246)と4ngのStreptavidin−HRP(PIERCE社製)を含む50μlの緩衝液Aと0.5ngのMMP13抗体(14D10)を含む50μlの緩衝液Aを加え、室温で3時間反応させた。次に各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後に、100μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、100μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。その結果、MMP13抗体とビオチン標識ヒトMMP13部分ペプチド(225−246)との結合はペプチド−2で若干の阻害を受け、ペプチド3で完全に阻害されることから、MMP13抗体(14D10)の抗原認識部位はヒトMMP13の231位〜233位のアミノ酸配列を含むペプチドであることが示された(図1)。
MMP13抗体(14D10)の特異性を調べるELISAは以下の方法で行った。96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)に1.5μgの抗マウスIgG抗体(シバヤギ社製)を含むトリス緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5)を150μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を300μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った(抗マウスIgG抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で1回洗浄した後、100, 10, 1nMの各ヒトMMP触媒ドメイン(MMP−1、MMP−2、MMP−3、MMP−8、MMP−9)、または、100、20、4、0.8、0.16nMのラットMMP13触媒ドメイン、または、モルモットMMP13触媒ドメイン、または、100、10、1nMのヒトPro−MMP13(R&D SYSTEMS社製)、または20、4、0.8、0.16nMのヒトActive−MMP13(製品の添付文書に従いヒトPro−MMP13をAPMAで活性化した)を含む50μlの緩衝液Aと0.1ngのビオチン標識ヒトMMP13部分ペプチド(225−246)と4ngのStreptavidin−HRP(PIERCE社製)を含む50μlの緩衝液Aと0.5ngのMMP13抗体(14D10)を含む50μlの緩衝液Aを加え、4℃で16時間反応させた。次に各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後に、100μlのTMB+−Substrate−Chromogen(DAKO社製)を添加して室温で30分間発色させた後に、100μlの0.05Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。その結果、MMP13抗体(14D10)は、ヒト、ラット、モルモットMMP13と特異的に反応し、他のMMPsとは反応しないこと(図2)また、活性型MMP13と反応し、前駆体型MMP13とは反応しないことがわかった(図3)。また、免疫原のペプチドとは異なるアミノ酸配列を持つモルモットMMP13とも反応することがわかり、本MMP13抗体(14D10)は広範な動物種由来の活性型MMP13を認識することが示された。
384 low volume plate(コーニング社製)にMMP活性測定緩衝液(0.3M NaCl, 10mM CaCl2, 0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.6)で希釈したラットMMP13触媒ドメインを10μL加え、MMP13抗体(14D10)を含むMMP活性測定緩衝液を5μL加える。室温で1時間置いた後に、130nMのMMPペプチド基質(ペプチド研究所製)を含むMMP活性測定緩衝液を5μL加える。室温で1時間置いた後に蛍光シグナル(ex.340nm, em.405nm) をEnVision(PerkinElmer, Inc.社製)を用いて測定した。その結果、MMP13のペプチド基質切断活性はMMP13抗体(14D10)により阻害された(図4)。
5ng/mlのヒトII型コラーゲン溶液(Chondrex社製)を96ウェルマキシソーププレート(NUNC社製)に添加し、4℃で一晩インキュベート後、洗浄Buffer(50 mMトリス緩衝液, pH7.6)で2回洗浄してコーティングプレートとする。酵素反応Buffer(0.3 M NaCl、10 mM CaCl2、0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.6)にヒトリコンビナントMMP13(ヒトpro−MMP13(Calbiochem社製)をAPMA(1 mM)で37℃、2時間インキュベートして活性型に変換)とMMP13抗体(14D10)を加えて室温で2時間プレインキュベートした後、酵素反応溶液をコーティングプレートに添加して反応を開始する.37℃で4時間の反応後、停止液(EDTA,終濃度5 mM)を加えて酵素反応を停止させて反応溶液を回収する。反応溶液中に含有するCIIネオエピトープ(II型コラーゲン分解産物)を参考文献と同様の方法で作製した抗体によるELISAにより定量した。その結果、MMP13のII型コラーゲン切断活性はMMP13抗体(14D10)により阻害された(図5)。
10ng/mlのヒトII型コラーゲン溶液(Chondrex社製)を96ウェル培養プレート(住友ベークライト社製)に添加し、4℃で一晩インキュベート後、培養用培地(0.1 mg/ml BSA、ITS、 50μM L(+)−Ascorbic Acidを含むDMEM)で1回洗浄してコーティングプレートとする。正常ヒト由来軟骨細胞(Cambrex社)をコーティングプレートに4 x 104 cells/wellで播種し、培養用培地を用いて37℃、5% CO2下で培養を行う。1日後に培養液を交換してMMP13抗体(14D10)を加えた後、1ng/mlのヒトIL−1beta及び10ng/mlのOncostatin M(Sigma社製)を添加して培養する。4日後に反応停止液(EDTA、終濃度5 mM)を加えて、培養上清液を回収する。培養液中に含有するCIIネオエピトープ(II型コラーゲン分解産物)を参考文献(Osteoarthritis and Cartilage、2003年、11巻、9号、pp.673-680)と同様の方法で作製した抗体によるELISAにより定量した。軟骨細胞から産生遊離したMMPによるII型コラーゲン分解活性はMMP13抗体(14D10)により阻害された(図6)。
1.5μgのMMP13抗体(14D10)を含む150μlのDELFIA Assay Buffer(パーキンエルマー社製)を96ウェルマキシソーププレート(NUNC社製)に添加し、4℃で16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(0.01% Tween20を含む生理食塩水)で1回洗浄した後、ブロックエース(大日本製薬社製)を300μl加えて室温で2時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを300μlの洗浄液で1回洗浄した後、ヒトActive−MMP13(製品の添付文書に従いヒトPro−MMP13(R&D社製)をAPMAで活性化した)を5mM EDTAを含む緩衝液Cに希釈し、150μlを添加した。室温で2時間反応させた。次に各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後に、NHS−PEO4−Biotin(PIERCE社製)によりビオチン標識したMMP13抗体(第一ファインケミカル社製)とStreptavidin−Eu3+(パーキンエルマー社製)を150μl添加し、4℃で16時間反応させた。次に各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後に、DELFIA Enhancement Solution(パーキンエルマー社製)を150μl添加し、時間分解蛍光を測定した。その結果、活性型ヒトMMP13の検出感度は5pMであった(図7)。
384 low volume plate(コーニング社製)にMMP活性測定緩衝液(0.3M NaCl, 10mM CaCl2, 0.005% Brij35を含む50mMトリス緩衝液、pH7.6)で希釈したラットMMP13触媒ドメインを10μL加え、MMP13抗体(14D10)、市販のMMP13モノクローン抗体(CHEMICON社製、カタログ番号:MAB13426)あるいはMMP13ポリクローナル抗体(CHEMICON社製、カタログ番号:AB8120)を含むMMP活性測定緩衝液を5μL加える。室温で1時間置いた後に、130nMのMMPペプチド基質(ペプチド研究所製)を含むMMP活性測定緩衝液を5μL加える。室温で1時間置いた後に蛍光シグナル(ex.340nm, em.405nm) をEnVision(PerkinElmer, Inc.社製)を用いて測定した。その結果、MMP13のペプチド基質切断活性はMMP13抗体(14D10)により阻害された(図8)。しかし市販のMMP13モノクローン抗体(CHEMICON社製、カタログ番号:MAB13426)あるいはMMP13ポリクローナル抗体(CHEMICON社製、カタログ番号:AB8120)はMMP13のペプチド基質切断活性を阻害しなかった(図8)。
配列表の配列番号2は、ヒトMMP13の225位〜246位のアミノ酸配列からなる部分ペプチドである。
Claims (20)
- MMP13と特異的に結合するモノクローナル抗体であって、MMP13のプロテアーゼ活性を阻害することを特徴とするモノクローナル抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする請求項1記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合することを特徴とする請求項1または2記載のモノクローナル抗体
- 受領番号がFERM ABP−10968であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体の性質を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 受領番号がFERM ABP−10968であるハイブリドーマより生産されるモノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
- 受領番号がFERM ABP−10968である請求項7記載のハイブリドーマ。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするMMP13の免疫学的測定方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするMMP13の酵素活性中和方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含むMMP13が関与する疾患の診断薬。
- MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である請求項11記載の診断薬。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む、MMP13が関与する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
- MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である請求項13記載の医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物を投与する工程を包含する、MMP13が関与する疾患を処置または予防するための方法。
- MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である請求項15記載の疾患を処置または予防するための方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の、MMP13が関与する疾患を処置または予防するための医薬の製造のための使用。
- MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である請求項17記載の医薬の製造のための使用。
- MMP13が関与する疾患の処置または予防に使用するための請求項1〜6のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- MMP13が関与する疾患が、変形性関節症である請求項19記載のモノクローナル抗体。
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