CN112321710A - 一种猫n-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体及制备和应用 - Google Patents

一种猫n-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体及制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种猫N‑端脑利钠肽前体蛋白抗体，所述抗体用含猫N‑端脑利钠肽前体蛋白的氨基酸多肽做抗原免疫小鼠获得；并提供了一种猫N‑端脑利钠肽前体蛋白抗体的制备方法，主要包括猫N‑端脑利钠肽前体蛋白片段的合成和猫N‑端脑利钠肽前体蛋白片段的抗体的制备。制备方法简单易于实现，所制备的抗体可以快速识别猫N‑端脑利钠肽前体蛋白，且特异性高、效价高、灵敏度高；将抗体应用于制备检测试纸条，使用时间分辨免疫荧光定量方法进行定量检测，同时可提高检测的灵敏度和检测结果的准确性，本发明以创新性的技术改进，取得了突出的技术效果，同时成本低、设备要求低、可操作性强、具有良好的社会推广应用价值。

Description

一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体及制备和应用
技术领域
本发明涉及生物免疫抗体及检测领域，尤其涉及一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体及制备和应用。
背景技术
根据对宠物市场的监测数据显示，截至2019年1月底，2018年中国养宠用户达到9978万户，比例攀升至22％，2018年宠物猫数量为6700万只。中国宠物市场规模进一步扩容至1722亿元，其中宠物猫的市场规模则在602亿元左右。从细分市场的规模来看，602亿元的宠物猫市场中医疗服务市场、宠物猫用品、服务和活体销售的规模位居第二，均在85亿元左右。
猫心脏病是临床很常见的一种疾病，可多年发病而不表现任何临床症状给临床诊断上带来困难，对于猫心脏病的诊断，我国小动物临床上一般使用X线拍摄、心电图、心动超声图等进行诊断，心脏病的实验室检查在我国宠物心脏病的诊断上应用非常少。N末端签B型利尿钠肽(NTproBNP)作为人多种类型的心肌病和全身疾病中已经报道了生物标记物的测量。
NT-proBNP是BNP激素原(proBNP)分裂后无活性的N末端片段，由108个氨基酸构成的多肽，主要在心肌细胞受新容量负荷和压力负荷增高时由左心室分泌，以应对心肌上的拉伸或应变，然后被裂解为具有生物活性的BNP和NT-proBNP。一旦proBNP从心肌细胞释放，被切割成2部分，活性C末端BNP和无活性NT-proBNP。NT-proBNP与脑利钠肽(BNP)相比，其半衰期更长、更稳定，操作的重复性好，检测早期和(或)轻度心力衰竭时的敏感度更高。由于NT-proBNP可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP的释放，因此更能反映BNP通路的激活。生理状态下，心室、心房分泌少量BNP，因此健康血液循环中仅有低浓度BNP。病理状态下，如心室负荷及室壁张力增加时，引起心室尤其是左心室BNP大量分泌。近年来BNP、NT-proBNP在心力衰竭诊断、呼吸困难的鉴别诊断、心力衰竭疗效评价及心力衰竭患者预后评估方面日益受到关注。在心功能受损时，NT-proBNP增高的比例及绝对值均超过BNP，因此，作为早期心功能损害的标志，NT-proBNP可能更为敏感。血清或血浆中的脑利钠肽前体(NT-proBNP)可作为疑诊为心力衰竭个体的辅助诊断工具，NT-proBNP是评价心功能的敏感指标，是反映心衰的一个重要指标，在临床上主要用来检测是否合并心衰及心衰的严重程度，并且脑利钠肽前体在急性心衰时反映较灵敏，是急性心衰检查中最具有敏感性的指标，可以早期发现心衰症状。
NTproBNP是犬猫临床上最常用于心脏病实验室检查的生物标记物，NT-proBNP有助于诊断充血性心力衰竭，筛查潜在性疾病及心脏病的治疗和预后。而作为猫NTproBNP的抗体在市面上尚未有商品化的产品在售。
现有的诊断工具使用起来都较为繁琐，需要专业的仪器和专业的检测人员，检测成本高，且需要较苛刻的实验条件，因此对于其推广应用存在一定的局限性
最近几年，时间分辨免疫荧光定量检测技术正处于快速发展阶段。使用NT-proBNP抗体进行标记建立猫心脏病筛查的时间分辨免疫荧光定量方法，现有市场上还尚未有开发成功的先例。近年来针对特定病原微生物的检测试剂盒得到了广泛的应用，多数基于抗原抗体反应，再配合荧光信号检测仪器，因此检测较快且结果判别容易。而时间分辨免疫荧光定量检测技术的质量很大程度上由抗体性能所决定，一种敏感性强、结合速度快的抗体将有助于提升检测的准确性和检测速度。
因此，发明一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的抗体及其制备方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在的缺陷提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体及其制备方法，以及这种抗体的应用，以此来快速准确地检测猫心脏病，以便及时制定治疗方案。
本发明的第一个目的是提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的抗体，所述抗体用含猫N-端脑利钠肽前体蛋白的氨基酸多肽做抗原免疫小鼠获得；所述氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。
优选的，所述抗体为时间分辨免疫荧光定量标记的Fab单克隆抗体。
本发明的第二个目的是提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的合成，挑选单克隆菌液进行分子克隆，将含SEQ ID NO：1序列的核酸插入到pcDNA3载体，经测序鉴定、克隆扩增，提取DNA后转化大肠杆菌，表达并纯化该蛋白的片段；
S2：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的抗体的制备，动物免疫后建立杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体腹水并进行纯化、鉴定。
本发明的第三个目的是提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体在制备检测试纸条中的应用。
优选的，所述试纸条包括撑底板及粘贴在撑底板上表面的样品垫、标记物垫、捕获膜、吸水垫，相邻的每一部分均在边接处交叠边接；所述捕获膜上含有控制线和检测线。
本发明的有益效果：
1.本发明的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体能识别猫N-端脑利钠肽前体蛋白，从而识别猫N-端脑利钠肽前体蛋白的水平高低，进一步通过检测试纸来反映检测样品中该标志物水平的高低；本发明的抗体可以快速识别猫N-端脑利钠肽前体蛋白，进一步缩短了猫心脏病检测标志物的检测时间，同时基于荧光免疫层析技术的检测，其检测灵敏度高。
2.本发明单克隆抗体分泌的抗体为只针对猫，与人、犬N-端脑利钠肽前体蛋白均不发生反应，从而保证了单抗体能够专门针对猫类疾病。
3.本发明制备的单克隆抗体特异性高、效价高、灵敏度高，从而增强了检测的特异性和检测结果的准确性，也提高了检测速度，尤其适用于进一步制备猫N-端脑利钠肽前体蛋白诊断试纸条。
4.本发明以创新性的技术改进，取得了突出的技术效果，同时成本低、设备要求低、可操作性强、易于实现，具有良好的社会推广应用价值。
附图说明
图1为本发明单克隆抗体简易制备流程图；
图2为本发明猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体免疫层析检测试纸示意图。
图中，1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-支撑底板；6-控制线；7-检测线。
具体实施方式
下面将结合附图与实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
实施例1
结合图1所示的流程图，本发明所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体按照如下步骤制备：
S1：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的合成；
(101)选取如SEQID NO：1所示的猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的氨基酸序列：
HHHHHHHPLGGPGPASEASAIQELLDGLRDTVSELQEAQMALGPLQQGHSPAESWEAQEEPPARVLAPHDNVLRALRRLG；
(102)通过PCR扩增、纯化、酶切和酶连等方法挑选单克隆菌液进行分子克隆的方法将含SEQ ID NO：1序列的核酸插入到pcDNA3载体，测序鉴定后选正确克隆扩增，提取DNA后转化至大肠杆菌BL21，表达并纯化猫N-端脑利钠肽前体蛋白的片段；
S2：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的抗体的制备；
(201)动物免疫：将S1中纯化的猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段与等体积的福氏佐剂混合制成油包水乳剂，每只小鼠腹腔注射0.5ml上述混合液(含蛋白片段100μg)，共注射6只BALB/c小鼠；两周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂加强免疫，7天后以间接ELISA检测小鼠血清头部蛋白多抗的效价，效价高者头静脉再冲击免疫1次，每只20μg，3天后进行细胞融合；
(202)杂交瘤细胞株的建立：将免疫小鼠的脾细胞悬液和SP2/0骨髓瘤细胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合，用HAT完全1640培养基筛选培养；以猫N-端脑利钠肽前体蛋白(1μg/mL)作为抗原包被酶标96孔板，间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，对所测的OD490(490nm处的吸收)比阴性对照高10倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存；经过3次有限稀释克隆化，将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定；
(203)单克隆抗体腹水的制备：BALB/c小鼠腹腔内分别注射0.5ml不完全福氏佐剂，5～7天后每只小鼠腹腔内注射0.5mL含2×106个杂交瘤细胞的溶液，7～10天后观察小鼠腹部膨胀程度，收集腹水；
(204)单克隆抗体的纯化：将识别猫N-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体腹水先后用50％(质量体积比)饱和硫酸铵盐析和Protein G亲和层析的方法进行纯化，得到的单克隆抗体用蛋白电泳法鉴定纯度。
本实施例中，所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
实施例2
结合图2，本发明的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体在制备定量检测试纸条中的应用，具体包括如下步骤：
S1：荧光微球与猫N-端脑利钠肽前体蛋白的单克隆抗体的偶联：
(101)将200μL 20mM PBS，pH7.4，固含量1％的荧光微球与6毫克碳化二亚胺混合，室温振荡30分钟，12000rpm离心10min，用0.1M硼酸盐缓冲液清洗2次，获得活化后的荧光微球；
(102)将活化的荧光微球重悬于300μL硼酸盐缓冲液中，在微球悬液中加入200μL1mg/ml的抗体，在室温下振荡反应过夜；将反应后的溶液于12000rpm离心10min，加入400μL0.25M乙醇胺在室温再振荡30min；将反应后的溶液离心后再用PBS缓冲液洗2次；
(103)离心沉淀后加入300μL 2mg/ml的BSA重悬，常温振荡30min后用PBS洗3次，再用200μL 50mM PBS，pH7.4，0.1％Tween 20，5％蔗糖重悬荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体；
S2：荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体处理标记物垫2，猫N-端脑利钠肽前体蛋白捕获抗体以及羊抗鼠抗体处理捕获膜3：
(201)将荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体溶液用喷膜仪喷到标记物垫2上，喷速为10μL/cm；
(202)将1mg/ml猫N-端脑利钠肽前体蛋白捕获抗体以及1mg/ml羊抗鼠抗体用喷膜仪划线捕获膜3，划线速度为3μL/cm；然后将喷好的标记物垫2和捕获膜3置于37℃恒温箱中干燥1-2小时；
(203)再将标记物垫2上含有荧光微球标记的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体的部分切割下来，得到4-5mm宽，30cm长的条带；
S3：试纸条大卡的组装与切割：按照图2中试纸条的结构所示，将捕获膜3首先粘贴在支撑底板5上，在靠检测线7一侧先后粘贴标记物垫2以及样品垫1，在靠控制6线一侧粘贴吸水垫4，然后用切割机切割成4-5mm宽的试纸条，于铝箔袋中封闭保存备用。
在本实施例中，提供一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白的抗体在检测猫心脏疾病健康标志物中的应用，采用时间分辨免疫荧光定量检测技术检测猫心脏病健康标志物的方法，检测方法中时间分辨免疫荧光定量标记的抗体为TproBNP的抗体，测试线上固定的抗体为NTproBNP蛋白的抗体；所述羊抗鼠抗体作为阳性对照抗体处理捕获膜3，其购买于美国Sigma公司；所述喷膜仪购买于BioDot公司，所述样品垫、标记物垫、捕获膜、吸水垫、支撑底板均购买于MiLLipore公司。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体，其特征在于：所述抗体用含猫N-端脑利钠肽前体蛋白的氨基酸多肽做抗原免疫小鼠获得；所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体，其特征在于：所述抗体为时间分辨免疫荧光定量标记的Fab单克隆抗体。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的合成，挑选单克隆菌液进行分子克隆，将含SEQ IDNO：1序列的核酸插入到pcDNA3载体，经测序鉴定、克隆扩增，提取DNA后转化大肠杆菌，表达并纯化该蛋白的片段；
S2：猫N-端脑利钠肽前体蛋白片段的抗体的制备，动物免疫后建立杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体腹水并进行纯化、鉴定。
4.一种猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体在制备检测试纸条中的应用。
5.如权利要求4所述的猫N-端脑利钠肽前体蛋白抗体在制备检测试纸中的应用，其特征在于：所述试纸条包括撑底板(5)及粘贴在撑底板(5)上表面的样品垫(1)、标记物垫(2)、捕获膜(3)、吸水垫(4)，相邻的每一部分均在边接处交叠边接；所述捕获膜(3)上设有控制线(6)和检测线(7)。
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