CN113702644A - 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒 - Google Patents

建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113702644A
CN113702644A CN202110985156.XA CN202110985156A CN113702644A CN 113702644 A CN113702644 A CN 113702644A CN 202110985156 A CN202110985156 A CN 202110985156A CN 113702644 A CN113702644 A CN 113702644A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mxa
colloidal gold
kit
establishing
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110985156.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李晓全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Original Assignee
BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD filed Critical BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Priority to CN202110985156.XA priority Critical patent/CN113702644A/zh
Publication of CN113702644A publication Critical patent/CN113702644A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明是建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，属于体外诊断试剂盒技术领域。其特征为运用胶体金免疫层析技术、重悬技术、封闭技术、标记技术等制备出的一种MxA诊断试剂盒，适用范围宽，可应用于临床，操作简单便捷，对操作人员要求较低，精密度高，作用安全，可快速确定是否为病毒性感染。

Description

建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断试剂盒技术领域，具体涉及一种胶体金免疫层析法检测黏病毒抗性蛋白A(MxA)试剂盒的建立。
背景技术
感染性疾病是指由致病微生物(细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、真菌等)通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病，其中最常见的是细菌和病毒的感染。临床中需快速判别出细菌或病毒感染，指导临床治疗方向。病毒感染时，机体内源性IFN明显增高。MxA蛋白由IFN-α/β诱导产生，能够反映体内IFN表达的情况，有助于鉴别细菌性感染和病毒性感染，其次检测MxA蛋白水平有利于对IFN疗效进行评估。
Mx蛋白的分子量约为70～80kD，其蛋白结构至少由N-末端结构域、中间结构域、C-末端结构域等3个区域组成，约300个氨基酸组成的N-末端结构域是GTP酶的活性区，约100个氨基酸组成的C-末端结构域是GTP酶的效应区，中间结构域是由约150个氨基酸组成。MxA蛋白在细胞质中与滑面型内质网相连接，与病毒的核衣壳相结合后构型发生改变，结合MxA蛋白的核衣壳以纤维状复合物的形式沉积在细胞核周围，活化的MxA蛋白使病毒失去核衣壳，病毒核酸从而被释放出来，又很快被存在于细胞质中的核酸内切酶所降解，因此达到抗病毒作用。MxA具有广谱的抗病毒活性，对多种RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用，并且MxA水平是代表病毒诱导机体产生IFN状态指标。
许多病毒种类，包括呼吸道合胞病毒、腺毒毒、轮状病毒、流感病毒、疱疹病毒、EB病毒等，可诱导细胞表达MxA增高，表明MxA不是鉴定病毒感染类型的指标。急性感染病人，儿科病人，重症病人，ICU病人，大创伤及休克病人都需要简单，快速鉴别细菌感染或病毒感染，指导药物治疗，并监测病性进展。
目前测定MxA的主要方法包括酶联免疫法和化学发光法，均需专用仪器，且操作繁琐，操作时间长，本发明建立了一种胶体金免疫层析的方法检测MxA，灵敏度高，操作简便，迅捷，10min即可通过免疫层析分析仪得出定量结果。可快速，准确地检测出样品中MxA浓度，用于诊断急性病毒感染发生。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种胶体金免疫层析方法快速、准确对黏病毒抗性蛋白A(MxA)进行定量检测。
本发明的技术方案如下：
一种胶体金免疫层析方法检测MxA试剂盒包含以下主要组分：试纸条(底板作为支撑结构，经处理的样品垫、喷涂有MxA抗体①-胶体金复合物的金垫、包被有MxA抗体②与抗IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接而成)、塑料卡壳、样本处理液(以磷酸盐缓冲液为基质，含有NP-40，作用主要为破碎细胞，释放细胞内蛋白质)。
一种胶体金免疫层析方法检测MxA试剂盒检验原理：如果样本中含有MxA，则MxA首先与胶体金颗粒吸附的MxA抗体①形成MxA-MxA抗体①-胶体金复合物，而后复合物通过毛细管作用继续向上层析至检测线部位，与检测线包被的MxA抗体②形成MxA抗体②-MxA-MxA抗体①-胶体金复合物，从而显示出颜色(胶体金为红色)，而颜色的深浅可以展示出MxA量的多少。如果样本中不含有MxA，则无法形成MxA-MxA抗体①-胶体金复合物，继而检测线部位也不会留有胶体金，从而检测线部位不展现颜色。而不管样本中是否含有MxA，MxA抗体①-胶体金复合物都会向上层析至质控线位置，与质控线预先包被的抗IgG抗体形成抗IgG抗体-MxA抗体①-胶体金复合物，从而显出颜色。
本发明构建了胶体金免疫层析方法对样本中MxA进行测定的试剂盒建立方法。
喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫制备：
将氯金酸用超纯水稀释至万分之一浓度，煮沸后立即加入一定量1％的柠檬酸三钠，继续加热5min，冷却后的胶体金可暂存4℃备用。将冷却后的胶体金在磁力搅拌器上以固定转速进行搅拌，逐滴加入一定量的碳酸钾溶液，待混匀后逐滴加入MxA抗体①，继续搅拌1小时，加入一定量的BSA溶液，继续搅拌1小时。将标记后的胶体金以固定转速离心，弃上清，以10％蔗糖、20％海藻糖、10mM PBS(pH＝7.4)配制的复溶液进行重悬。利用XYZ大平台三维划膜喷金仪固定喷量、固定速度喷涂于聚酯纤维垫上，制备出喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫。37℃烘干，干燥封存，备用。
包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜制备：
用10mM PBS(pH＝7.4)含10％蔗糖，将MxA抗体②、抗IgG抗体稀释至需要浓度。将硝酸纤维素膜与吸水垫顺次粘贴在底板上，将粘贴好的硝酸纤维素膜置于XYZ大平台三维划膜喷金仪上，以固定喷量将MxA抗体②与抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上，两线间隔3-8mm，37℃烘干，干燥封存，备用。
处理样品垫：
配制样品垫处理液：15mM PBS(pH7.4)含有1％BSA、0.5％吐温-20、5％蔗糖。将玻璃纤维垫置于处理液中浸泡1小时，37℃烘干，干燥封存，备用。
组装MxA试剂卡：
在底板上顺次粘贴好喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫、预处理的样品垫，形成试剂板，再切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料卡壳中形成试剂卡。
裂解液配制：
配制磷酸盐缓冲液，盐浓度低于10mM，含0.05-2％NP-40。
质控品制备：
将MxA纯品稀释至不同浓度，利用以上构建的试剂卡进行检测，免疫层析分析仪读取每个浓度所对应的T-GOD值，以质控品浓度为横坐标，T-GOD值为纵坐标，做标准曲线。将标准曲线输入仪器，仪器即可以自动读出样本中MxA浓度。
试剂卡使用：
外周血经裂解液处理后，滴加在样品孔中，经毛细管作用向上层析，10min后，将试剂卡放入免疫层析仪进卡处，仪器自动读出样本中MxA浓度。
本发明方案中所涉及的术语如无特殊说明，均以国家技术质量监督管理局、中国药典、国家药品监督管理局颁布的标准和相关规范解释为准。
上述发明方案中所述的浓度如没有单位说明，均指质量浓度。
上述发明方案中设备的功率选择根据所生产样品量的大小确定，按生产厂家设备说明书规定即可实现本发明。
上述实施方案中提到的物质名称如下：
MxA：人体内由干扰素(IFN)诱导产生的一种78kD抗病毒蛋白；
氯金酸：CAS号：10294-30-1
柠檬酸三钠：CAS号：68-04-2
碳酸钾：CAS号：584-08-7
BSA：CAS号：9048-46-8；
蔗糖：CAS号：57-50-1；
海藻糖：CAS号：99-20-7
PBS：磷酸二氢钠：CAS号：13472-35-0；磷酸氢二钠：CAS号：10039-32-4；氯化钠：CAS号：7647-14-5
吐温-20：CAS号：9005-64-5；
硝酸纤维素膜：Sartorius CN95：上海杰一生物技术有限公司；
玻璃纤维垫：玻璃纤维素薄膜GF2-II：上海杰一生物技术有限公司；
聚酯纤维垫：聚酯纤维素膜ZCJ1：上海杰一生物技术有限公司；
吸水垫：H5076：上海杰一生物技术有限公司；
底板：胶体金专用底板DB-4：上海杰一生物技术有限公司；
MxA抗体①：购自珠海博美生物科技有限公司，纯度≥95％。
MxA抗体②：购自珠海博美生物科技有限公司，纯度≥95％。
抗IgG抗体：购自南京京达生物技术有限公司，纯度≥90％。
MxA纯品：购自珠海博美生物科技有限公司，纯度≥95％。
以上胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒所用到的物质无特殊要求，市场均有销售，只要满足质量标准均可用来实施本发明。
上述实施方案所提到的关键设备如下：
高速离心机：型号：Avanti J-E美国贝克曼库尔特有限公司
XYZ大平台三维划膜喷金仪：型号：HM3230上海金标生物科技有限公司
智能数显磁力搅拌器：型号：SP-18杭州米欧仪器有限公司
免疫层析分析仪：型号：VI-P101、VI-P112北京贝尔医疗设备有限公司
以上胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒所用到的设备无特殊要求，市场均有销售，只要满足参数范围均可用来实施本发明。
附图说明
图1是胶体金免疫层析法试纸条侧面图；
图2是试剂卡示意图
图1和图2中1是样品垫，2是喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫，3是包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜，4是检测线，5是对照线，6是吸水垫，7是底板，8是样品孔，9是测试窗，10是试剂卡。
图3是MxA浓度标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
本发明的具体实施1
喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫制备
将氯金酸0.1ml稀释至1000ml超纯水中，煮沸后立即加入20ml 1％的柠檬酸三钠，继续加热5min，待冷却后将胶体金溶液在磁力搅拌器上以200rpm转速进行搅拌，逐滴加入10ml 5％的碳酸钾溶液，待混匀后逐滴加入MxA抗体①20ug，继续搅拌1小时，加入20ml10％BSA，继续搅拌1小时。将标记后的胶体金以8000rpm转速离心40min，弃上清，以10％蔗糖、20％海藻糖、10mM PBS配制的复溶液进行重悬，重悬至5ml。利用XYZ大平台三维划膜喷金仪以2ul/cm的喷量、1cm/s的速度喷涂于聚酯纤维垫上。37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜制备
用10mM PBS(pH＝7.6)含10％蔗糖，稀释MxA抗体②、抗IgG抗体稀释至0.8mg/ml。将硝酸纤维素膜与吸水垫顺次粘贴在底板上，将粘贴好的硝酸纤维素膜置于XYZ大平台三维划膜喷金仪上，以1ul/cm的喷量将MxA抗体②与抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上，两线间隔4mm，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
处理样品垫：
配制500ml样品垫处理液：15mM PBS(pH7.4)含有1％BSA、0.5％吐温-20、5％蔗糖。将玻璃纤维垫置于处理液中浸泡1小时，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
组装MxA试剂卡：
在底板上顺次粘贴好喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫、预处理的样品垫，形成试剂板，再切割成4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料卡壳中形成试剂卡。
裂解液配制：
配制磷酸盐缓冲液500ml，盐浓度5mM，含0.05-2％NP-40。
质控品制备：
将MxA纯品稀释至不同浓度(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml)，利用以上构建的试剂卡进行检测，免疫层析分析仪读取每个浓度所对应的T-GOD值，以质控品浓度为横坐标，T-GOD值为纵坐标，做标准曲线。将标准曲线输入仪器，仪器即可以自动读出样本中MxA浓度。
本发明的具体实施2
喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫制备
将氯金酸0.1ml稀释至1000ml超纯水中，煮沸后立即加入10ml 1％的柠檬酸三钠，继续加热5min，待冷却后将胶体金溶液在磁力搅拌器上以200rpm转速进行搅拌，逐滴加入10ml 5％的碳酸钾溶液，待混匀后逐滴加入MxA抗体①20ug，继续搅拌1小时，加入20ml10％Casein，继续搅拌1小时。将标记后的胶体金以8000rpm转速离心40min，弃上清，以10％蔗糖、20％海藻糖、10mM PBS配制的复溶液进行重悬，重悬至5ml。利用XYZ大平台三维划膜喷金仪以2ul/cm的喷量、1cm/s的速度喷涂于聚酯纤维垫上。37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜制备
用10mM PBS(pH＝7.6)含10％蔗糖，稀释MxA抗体②、抗IgG抗体稀释至1.0mg/ml。将硝酸纤维素膜与吸水垫顺次粘贴在底板上，将粘贴好的硝酸纤维素膜置于XYZ大平台三维划膜喷金仪上，以1ul/cm的喷量将MxA抗体②与抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上，两线间隔4mm，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
处理样品垫：
配制500ml样品垫处理液：15mM PBS(pH7.4)含有1％BSA、0.5％吐温-20、5％蔗糖。将玻璃纤维垫置于处理液中浸泡1小时，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
组装MxA试剂卡：
在底板上顺次粘贴好喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫、预处理的样品垫，形成试剂板，再切割成4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料卡壳中形成试剂卡。
裂解液配制：
配制磷酸盐缓冲液500ml，盐浓度5mM，含0.05-2％NP-40。
质控品制备：
将MxA纯品稀释至不同浓度(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml)，利用以上构建的试剂卡进行检测，免疫层析分析仪读取每个浓度所对应的T-GOD值，以质控品浓度为横坐标，T-GOD值为纵坐标，做标准曲线。将标准曲线输入仪器，仪器即可以自动读出样本中MxA浓度。
本发明的具体实施3
喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫制备
将氯金酸0.1ml稀释至1000ml超纯水中，煮沸后立即加入20ml 1％的柠檬酸三钠，继续加热5min，待冷却后将胶体金溶液在磁力搅拌器上以200rpm转速进行搅拌，逐滴加入10ml 5％的碳酸钾溶液，待混匀后逐滴加入MxA抗体①30ug，继续搅拌1小时，加入20ml10％BSA，继续搅拌1小时。将标记后的胶体金以8000rpm转速离心40min，弃上清，以10％蔗糖、20％海藻糖、10mM PBS配制的复溶液进行重悬，重悬至5ml。利用XYZ大平台三维划膜喷金仪以2ul/cm的喷量、1cm/s的速度喷涂于聚酯纤维垫上。37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜制备
用10mM PBS(pH＝7.6)含10％蔗糖，稀释MxA抗体②、抗IgG抗体稀释至1.0mg/ml。将硝酸纤维素膜与吸水垫顺次粘贴在底板上，将粘贴好的硝酸纤维素膜置于XYZ大平台三维划膜喷金仪上，以1ul/cm的喷量将MxA抗体②与抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上，两线间隔4mm，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
处理样品垫：
配制500ml样品垫处理液：15mM PBS(pH7.4)含有1％BSA、0.5％吐温-20、5％蔗糖。将玻璃纤维垫置于处理液中浸泡1小时，37℃烘干12小时，干燥封存，备用。
组装MxA试剂卡：
在底板上顺次粘贴好喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫、预处理的样品垫，形成试剂板，再切割成4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料卡壳中形成试剂卡。
裂解液配制：
配制磷酸盐缓冲液500ml，盐浓度5mM，含0.05-2％NP-40。
质控品制备：
将MxA纯品稀释至不同浓度(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml)，利用以上构建的试剂卡进行检测，免疫层析分析仪读取每个浓度所对应的T-GOD值，以质控品浓度为横坐标，T-GOD值为纵坐标，做标准曲线。将标准曲线输入仪器，仪器即可以自动读出样本中MxA浓度。
以上实施例说明，采用本发明实施方案的各种可变条件均能制成胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒。
利用定量体外诊断试剂盒常规考察指标(空白限、抗干扰性、精密度、准确度、稀释线性)对实施例1制得的胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒来进行实际效果考察。
空白限：检测20个空白样本，计算平均值与标准差，平均值加2倍的标准差即为空白限。结果见表1。
抗干扰性：检测500mg/dL的血红蛋白、30mg/L的胆红素、3000mg/dL的甘油三酯和500IU/mL的抗类风湿因子(RF)样本各3次，取其测定浓度的均值，结果见表1。
精密度：检测80ng/ml的MxA质控品20次，计算平均值、标准差及变异系数(CV)，结果见表1。
准确度：检测160ng/ml的MxA质控品3次，计算平均值，与标定值相对偏差，结果见表1。
稀释线性：将1280ng/ml的MxA质控品进行倍比稀释至5ng/ml，，每个样本测定3次取平均值，以标定浓度为横坐标，以测定浓度为纵坐标，计算线性拟合方程，结果见表1。
表1 实施1考察结果
性能 结果
空白限 0.3ng/ml
抗干扰性1(500mg/dL的血红蛋白) 0.25ng/ml
抗干扰性2(30mg/L的胆红素) 0.22ng/ml
抗干扰性3(3000mg/dL的甘油三酯和) 0.38ng/ml
抗干扰性4(500IU/mL的抗类风湿因子) 0.49ng/ml
精密度(CV) 4.36％
准确度(相对偏差) 5.59％
稀释线性 Y＝1.0103x-0.1556 r＝0.9984
经考察，胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒各项指标表现优异，参数范围内制备的试剂盒均具备较好的空白限、抗干扰性、精密度、准确度、稀释线性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：包括试纸条和低渗溶液；在底板上顺次搭接预过处理的样品垫、喷涂有MxA抗体①-胶体金颗粒的金垫、包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，而后切割为3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试剂卡。
2.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：硝酸纤维素膜上按照一定浓度包被MxA抗体②形成的检测线和抗IgG抗体形成的质控线。
3.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：胶体金为氯金酸经还原后所得，粒径为10-150nm。
4.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：胶体金标记前选用碳酸钾或碳酸钠等缓冲液对胶体金的pH值进行调节。
5.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：胶体金标记抗体结束后选用一定浓度的BSA、PEG、Casein等惰性物质进行封闭。
6.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：标记结束后采用高速离心或冷冻风干等技术对胶体金溶液进行浓缩。
7.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：按照一定喷量、一定速度将浓缩后的胶体金标记物喷涂于预先处理的聚酯纤维结合垫上，干燥后封存备用。
8.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：低渗溶液是磷酸盐，磷酸盐缓冲液，盐浓度低于10mM，含0.05-2％NP-40，用于裂解细胞，释放细胞内蛋白质。
9.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：测定样本为外周血，采取外周血经裂解液进行裂解，而后在试剂卡样品孔加入一定量经裂解的样本。
10.根据权利要求1所述的建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：利用免疫层析分析仪对不同浓度MxA测试结果条带颜色的深浅进行算法计算，制备出MxA浓度标准曲线，并将该曲线信息输入仪器，建立免疫层析分析仪自动显示样品中MxA浓度检测系统。
CN202110985156.XA 2021-08-26 2021-08-26 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒 Pending CN113702644A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110985156.XA CN113702644A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110985156.XA CN113702644A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113702644A true CN113702644A (zh) 2021-11-26

Family

ID=78654922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110985156.XA Pending CN113702644A (zh) 2021-08-26 2021-08-26 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113702644A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130196311A1 (en) * 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
US20130196310A1 (en) * 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
CN109239334A (zh) * 2018-09-10 2019-01-18 吉林大学 建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒
CN211061561U (zh) * 2019-05-19 2020-07-21 王哲 一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测试纸条及试剂盒
CN111896750A (zh) * 2020-08-07 2020-11-06 杭州都林生物科技有限公司 牛免疫球蛋白（IgG）双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130196311A1 (en) * 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
US20130196310A1 (en) * 2008-05-20 2013-08-01 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections
CN109239334A (zh) * 2018-09-10 2019-01-18 吉林大学 建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒
CN211061561U (zh) * 2019-05-19 2020-07-21 王哲 一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测试纸条及试剂盒
CN111896750A (zh) * 2020-08-07 2020-11-06 杭州都林生物科技有限公司 牛免疫球蛋白（IgG）双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111398603B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用
Fraley et al. Liposome-mediated delivery of deoxyribonucleic acid to cells: enhanced efficiency of delivery by changes in lipid composition and incubation conditions
CN109900913A (zh) 一种甲型和乙型流感病毒抗原胶体金法联合检测试剂盒及其制备方法
CN111610335B (zh) 时间分辨荧光免疫层析试纸条、包含其的试剂盒及其应用
CN112198316A (zh) 一种检测新型冠状病毒n蛋白的适配体胶体金试纸及其制备方法
CN111351927A (zh) 针对病原体抗原的抗体矩阵检测法（mega法）及多联检测卡
CN102662059A (zh) 一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用
CN112485445A (zh) 一种定量检测gfap的试剂盒及其应用
CN110818800B (zh) 一种通过构建桥连复合物间接检测目的分析物的检测方法
Abramson et al. Characterization of the effect of influenza virus on polymorphonuclear leukocyte membrane responses
KR101922234B1 (ko) 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출용 키트, 및 이를 이용하여 돼지열병바이러스에 대한 항체 유무 및/또는 항체 역가를 측정하는 방법
WO2021147453A1 (zh) 一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒
CN101363859B (zh) 布鲁氏菌抗体快速检测试纸条
CN113281523A (zh) 一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒
CN101100673A (zh) 一种结核分枝杆菌重组融合蛋白及其应用
CN112334481A (zh) 用于快速乙型流感诊断测试的抗体对
CN112881708B (zh) 用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备
CN113702644A (zh) 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒
CN107271692B (zh) 一种标记特异性高亲和力重组抗体的荧光微球及其应用
CN219201611U (zh) 一种多靶标试纸条及多靶标检测卡
WO2012021741A2 (en) Lateral flow assays for non-diagnostic analytes
CN109975541B (zh) 一种快速检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法
CN115166239A (zh) 牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条
CN108226514A (zh) 一种新城疫病毒抗体快速定量检测试剂盒及其应用
JP7144039B2 (ja) 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination