CN104897892B - 一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体‑1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。本发明所提供的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

Description

一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，简称HP)是一种生活在人胃黏膜的多鞭毛、螺旋形的革兰氏阴性细菌。1983年澳大利亚科学家Marshall和Warren首次从慢性活动性胃炎患者胃粘膜活检标本中成功分离到幽门螺旋杆菌，并因他们在幽门螺旋杆菌研究领域做出的贡献，而获得2005年诺贝尔生理学医学奖。幽门螺旋杆菌专性微需氧，生长营养要求高，且生长缓慢，通常需要3～5天才形成菌落，对低PH比一般细菌有较强耐受力。HP对胃上皮细胞有特殊的亲和性，自然条件下，大量HP主要出现在胃上皮细胞表面、细胞间隙及胃小凹中。

HP感染具有世界范围性，流行病学研究表明人类对HP易感，HP感染与年龄、地区、人种、社会经济状况(SES)、卫生状况、人口密集度、饮食习惯等多种因素有关。社会经济状况越好，GDP越高的国家和地区，HP感染率越低；人口密集程度越大，HP感染率越高。发展中国家普遍高于发达国家，可达80～90％，发达国家感染率为38～40％；发展中国家儿童感染率可高达80％以上，感染的年龄多在3～5岁以前；发达国家相应年龄儿童感染率较低，不足10％，但随着年龄增长，HP感染呈上升趋势。

据报道，世界上超过1/3的人口感染该菌。我国20岁以上的成年人感染率达32％～75％。关于HP的确切来源和传播途径至今仍不完全清楚。从HP感染的地区流行病学调查结果显示，粪－口传播的可能性最大。

幽门螺旋杆菌具有很强的活性与繁殖能力，是一种严重影响公众健康的细菌。自从1983年Warren等人首次发现HP以来，HP现已被公认为是上消化道疾病的重要因素。大量研究资料表明，HP是慢性活动性胃炎的病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，也是胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的重要致病因子。研究人员在对HP与胃癌相关性的研究中还发现，感染了HP的人群中患胃癌的比例明显比对照组高，从而提示HP可能是导致胃癌的致癌因子。在非溃疡性的消化不良患者中，亦有40-70％可检出HP，但两者之间的关系还有待进一步确证。另一方面，HP的治疗方案复杂，短期效果好，但仍有复发的可能性。因此，及早诊断HP，对防治上消化道疾病有重要意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。

优选的，所述底板为PVC底板。

优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。

优选的，所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2。

优选的，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1和抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2可以是相同的单克隆抗体，也可以是不同的单克隆抗体。

优选的，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1为Anti-Helicobacter pyloriantibody[51-13](ab8081)，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2为Anti-Helicobacterpylori antibody[SPM526],prediluted(ab82084)，或所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1为Anti-Helicobacter pylori antibody[SPM526],prediluted(ab82084)，所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2为Anti-Helicobacter pylori antibody[51-13](ab8081)。

优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为50-100mM。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10-40mM。

更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。

更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。

更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。

优选的，所述检测试剂盒用于检测样品中的幽门螺旋杆菌抗原，所述样品选自人粪便。

本发明第二方面提供所述幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1溶液喷涂金标垫，制得包含抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1的金标垫；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2及羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10-40mM。

更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。

更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

本发明第三方面提供所述幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒在幽门螺旋杆菌抗原检测领域的用途。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性，能够快速检测幽门螺旋杆菌抗原。此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1本发明试纸卡的制备

1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，预处理缓冲液为：18-冠醚-66mg/ml氯化钠0.3mg/ml，甘氨酸2.0mg/ml的水溶液，pH＝7.4，预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡2h，取出放于37℃烘干；然后用胶体金标记的Anti-Helicobacter pyloriantibody[51-13](ab8081)溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被Anti-Helicobacterpylori antibody[51-13](ab8081)的金标垫，溶液中胶体金与单克隆抗体的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的Anti-Helicobacterpylori antibody[SPM526],prediluted(ab82084)溶液和羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自MAXMED LABORATORIES INC.)溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

实施例2对比试剂盒的制备

对比例试纸卡的制备：采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，其他试剂及实验方法均同实施例1。

1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，然后用胶体金标记的Anti-Helicobacter pylori antibody[51-13](ab8081)溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被Anti-Helicobacter pylori antibody[51-13](ab8081)的金标垫，溶液中胶体金与单克隆抗体的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的Anti-Helicobacterpylori antibody[SPM526],prediluted(ab82084)溶液和羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

实施例3检测试剂盒的灵敏度实验

取实施例1、2制得的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上，分别检测60pg/ml、80pg/ml、100pg/ml、120pg/ml、160pg/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品，每个浓度重复5次。用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，在滴加样品后8-15分钟判读结果。

表1试剂盒灵敏度结果

表1结果证实，本发明制得的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒灵敏度≤100pg/ml，具有很高的灵敏度。进一步对实施例2的检测试剂盒进行灵敏度测试得知，实施例2的检测试剂盒灵敏度为≥1ng/ml。

实施例4检测试剂盒的重复性和稳定性实验

一、试剂盒的批内和批间重复性实验

1.实验方法：

将同批和不同批次的幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒分别检测0pg/ml、80pg/ml、100pg/ml、120pg/ml、160pg/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品，每个浓度重复5次，观察试剂盒的重复性。

2.实验结果：

经验证，幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。

二、试剂盒的稳定性实验

1.实验目的：

将幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。

2.实验方法：

保存于4℃的试剂盒每周取出4盒，分别检测80pg/ml、100pg/ml、120pg/ml、160pg/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品；保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测80pg/ml、100pg/ml、120pg/ml、160pg/ml的幽门螺旋杆菌抗原标准品。

3.实验结果：

经验证，试纸盒在4℃下可保存28个月，在室温下可保存21个月；在可保存的期限内，试剂盒均可达到100pg/ml的检测灵敏度。

实施例5检测试剂盒的特异性实验

检测方法：

1.取实施例1制备的本发明试剂盒和实施例2的对比试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

2.待测样品的制备：按表1的四类实验对象，用专用取样棒随机从检测者粪便的不同部位取样，取样量以沾满专用取样棒前端的小圆环为准；准备一个样品处理管，竖直放于处理管支架上，并在样品管里加入0.6ml蒸馏水；将专用取样棒上取好的样品插入样品管中的蒸馏水充分搅拌均匀作为待测样品。

3.每类实验对象为100人，对比实验所用的样品相同，检测结果如表1：

表2检测试剂盒特异性试验结果

实施例6胃幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒的临床试验

通过专用取样棒对病人粪便进行取样，共采集150份粪便样本，其中90份为感染了胃幽门螺旋杆菌的样本，60份为正常人的粪便样本，使用本发明的胃幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒分别对样本进行检测。分别在试剂盒加样孔滴加2-3滴样品(取样方法同实施例5)，滴加样品后8-15分钟判读结果。结果显示89份患者的粪便样本呈阳性，60份正常人的检测结果全部为阴性，未出现无显色的试剂盒。

以尿素呼气试验的检测结果为参照对临床试验结果进行统计，统计数据见表3：

表3临床试验结果汇总表

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有且具有很好的灵敏性，阴性本底更低，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测样品中的幽门螺旋杆菌抗原，所述样品具体为人粪便，所述检测试剂盒包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；

所述金标垫采用缓冲液预处理，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液；

所述甘氨酸缓冲液中添加的成分为NaCl和冠醚，所述冠醚为18-冠醚-6，所述NaCl在所述缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml，冠醚在所述缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。

2.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。

3.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2。

4.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

5.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为50～100mM。

6.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，缓冲液的浓度为10～40mM。

7.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。

8.根据权利要求1～7任一权利要求所述的胶体金检测试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包含抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1的金标垫，预处理时所使用的缓冲液为甘氨酸缓冲液，所述甘氨酸缓冲液中添加的成分为NaCl和冠醚，所述冠醚为18-冠醚-6，所述NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-2及羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。