JP2005024323A

JP2005024323A - 免疫検査用検体前処理液及び処理方法

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Publication number: JP2005024323A
Application number: JP2003188065A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Imoarai; 毅一口
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: JP4199606B2

Abstract

【課題】免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザウイルスを検査する際に、より正確かつ簡便に検査を行うために必要な検体の前処理液及び前処理方法を提供することである。
【解決手段】インフルエンザ検査用の生体から採取した検体、例えば鼻汁、痰、咽頭ぬぐい液等を少なくとも非イオン界面活性剤及び０．３Ｍのアルカリ金属イオンを含むを含む前処理液で処理することによる。非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレン系界面活性剤を使用することができ、アルカリ金属イオンとしては、ナトリウムイオンを使用することができる。

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、免疫クロマトグラフィー検査用の前処理液に関する。より詳しくは、インフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザウイルスは、直径８０〜１２０ｎｍのＲＮＡウイルスであり、外皮を有し、ＨＡ（赤血球凝集素）とＮＡ（ノイラミニダーゼ）の２種の酵素タンパク質の突起で覆われている。ＨＡは血球凝集性の抗原で、ヒトの細胞に吸着・侵入する際に細胞表面にあるシアル酸と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときの重要な役割を果たしている。一方、ＮＡは、ウイルス粒子が感染後期で細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを示し、感染性を獲得するのに役立っている。抗原性は、ＨＡとＮＡの組合せで決まり、Ａ、Ｂ、Ｃの３型に大別される。Ａ型はさらに香港型などの亜種が知られている。Ａ型では１０余年の周期で異なった亜型が登場し不連続変異大流行を起こしている。また、同じ亜型でも毎年少しずつ抗原性が変異する。このため、インフルエンザウイルスを検査する場合には、インフルエンザ抗原の変異の有無に関わらず、共通して検査可能な部位を検出することが必要である。
【０００３】
また、インフルエンザは罹患してから数日で治癒することが多いため、インフルエンザの的確な診断及び治療方法を提供するためには、迅速に検査結果が得られることが望ましい。現在では抗原検出のために組織培養を行う方法や、抗体検査として赤血球凝集阻止（ＨＩ）、補体結合試験（ＣＦ）及び間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）などの検査方法が実用化されている。
【０００４】
従来から、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く報告されている。例えば、特許文献１、２等に開示されている免疫クロマトグラフィーを利用した測定方法は、採取した検体を、目的とする抗体を含む検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無や量を知ることができる。この方法は、ニトロセルロースなどの多孔質膜の一端に、目的とする特定の抗原に対する特異抗体を含み、多孔質膜の中程には同様に特定の抗原のみに結合する別の特異抗体が帯状に多孔質膜に固定されているものを使用する。一端に含む特異抗体は、予め着色されており、その特異抗体が存在している多孔質膜の一端上にサンプル液を染み込ませるとサンプル液中に特異抗体と反応する抗原があれば、その抗原は特異抗体と結び付いて着色粒子を付けた状態で多孔質膜を毛細管現象によってサンプル液を染み込ませた側と反対の片端へ向かって移動する。移動の途中で帯状に固定されている別の特異抗体の個所を通過する際に、抗原は多孔質膜上の特異抗体に捕捉され、多孔質膜上に帯状の染みが現れる。このことにより目的の抗原がサンプル中に存在していること及びその量を知ることができる。
【０００５】
このような技術を応用すれば、インフルエンザの検査を迅速に行うことができ、有用である。インフルエンザの検査は、通常鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液を検体として行われる。上記免疫クロマトグラフィーの手法を利用できる検体は、原理上、多孔質膜中を毛細管現象によって通過できなければならない。しかし、鼻汁や咽頭ぬぐい液は、これらに存在する高粘性物質であるムチンが多孔質膜の孔を塞ぎ、またムチンは生体から剥がれ落ちた上皮付着細胞を凝集させるため、これらの物質により多孔質膜の孔が塞がれて検査を行うことができない。
【０００６】
例えば、ヒト唾液試料中のミュータンス連鎖球菌を免疫クロマトグラフィーによって同定・定量する際に、水酸化ナトリウムを含有する水溶液、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液と、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤とから構成され、界面活性剤が水溶液及び／又は緩衝液に予め混合されているか、又は水溶液及び緩衝液とは別になっている唾液の前処理用キットを用いることが既に開示されている（特許文献３）。しかしながら、インフルエンザの検査については全く開示されていない。
【０００７】
一方、インフルエンザの検査用試料の前処理方法として、界面活性剤、還元性物質から選ばれた少なくとも１種と有機酸もしくはその塩を含む検体前処理液による処理については特許文献４に開示されている。
【０００８】
【先行文献】
【特許文献１】特開昭６１−１４５４５９号公開公報
【特許文献２】特開平６−１６０３８８号公開公報
【特許文献３】特開２００２−３５７５９９号公開公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ０２／１０７４４号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザウイルスを検査する際に、より正確かつ簡便に検査を行うために必要な検体の前処理液及び前処理方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、界面活性剤がウイルス膜を破壊する点に着目し、鋭意検討を重ねた結果、免疫クロマトグラフィーによりインフルエンザの検査を行う場合において、生体からの検体を少なくとも非イオン性界面活性剤及び０．３Ｍ以上のアルカリ金属イオンを含む前処理液で処理すると、より簡便かつ正確にインフルエンザの検査が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち本発明は、
１．免疫クロマトグラフィーによる、インフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンみ、このアルカリ金属イオンを少なくとも０．３Ｍ含むことを特徴とする検体前処理液、
２．前記非イオン性界面活性体がポリオキシエチレン系界面活性剤である前項１に記載の前処理液。
３．前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体から選択される前項２に記載の前処理液、
４．非イオン性界面活性剤の濃度が０．０５〜２（ｖ／ｖ）％である前項１に記載の前処理液、
５．上記検体が、鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液である前項１〜４のいずれか１に記載の前処理液、
６．前項１〜４のいずれか１に記載の前処理液を使用するインフルエンザウイルスの検査用検体の処理方法、
７．前項１〜４のいずれか１に記載の前処理液を含む免疫クロマトグラフィー用検査キット、からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において測定の対象となるインフルエンザウイルスは、一般的に定義されているものであれば良く、特に限定されない。具体的には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれであっても良い。また、インフルエンザウイルスに属するウイルスであれば、変異されたウイルス又は将来出現する変異ウイルスであっても良い。
【００１３】
（検体）
本発明において、測定対象物となる検体は生体から取得でき、インフルエンザウイルスを混入しうるものであれば良く特に限定されないが、好ましくは鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液などが挙げられる。こららの検体を採取する方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、綿棒を用いて、鼻汁、痰及び／又は咽頭ぬぐい液を採取することができる。
【００１４】
（検体前処理液）
本発明の検体前処理液に含まれる非イオン性界面活性剤は、特に限定されないが、好ましくはポリオキシエチレン系のものを使用することができより好ましくはエーテル型のものを使用することができる。具体的には、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物が好ましく用いられる。
【００１５】
非イオン性界面活性剤は、０．０５〜２（ｖ／ｖ）％、好ましくは０．１〜０．５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは０．３（ｖ／ｖ）％付近の濃度で前処理液に含ませることができる。
【００１６】
本発明の検体前処理液に含まれるアルカリ金属イオンは、リチウム^＋（Ｌｉ^＋）、ナトリウム^＋（Ｎａ^＋）、カリウム^＋（Ｋ^＋）、ルビジウム^＋（Ｒｂ^＋）、セシウム^＋（Ｃｓ^＋）、フランシウム^＋（Ｆｒ^＋）等が例示されるが、好ましくはナトリウム、カリウムを使用することができる。又アルカリ金属イオンは一種又は二種以上使用することができる。このようなアルカリ金属イオンを生じうる化合物は特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、アジ化ナトリウムからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物を使用することができる。本発明の検体前処理液には、アルカリ金属イオンは、少なくとも０．３Ｍ含まれていることが必要であり、好ましくは０．４Ｍ、より好ましくは０．４５Ｍ以上含まれてていれば良い。一方、２Ｍ以上のアルカリ金属イオンを加えると、免疫クロマトグラフィーの感度に悪影響を及ぼすおそれがある。好ましくは１．５Ｍ以下、より好ましくは１．０Ｍ以下の濃度が適用される。
【００１７】
本発明の検体前処理液には、上記非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンの他、一般的に当業者が使用しうる成分を含ませることができる。具体的には、反応に至適なｐＨである５〜９に保持うる緩衝液を構成する成分や、その他の適切な有機酸などを含ませることができる。検体の処理は、通常の方法に従えば良く、例えば検体前処理液０．５〜１．０ｍＬに対して検体を０．１〜０．２ｍＬを加え、よく振り混ぜて混和することにより行うことができる。同様に鼻汁などの検体を採取した綿棒を検体前処理液に浸し、検体前処理液と検体をよく混和することにより行うことができる。本明細書では検体を前処理液で処理したものを、便宜上「試料」という。
【００１８】
本発明に係る検体前処理液及び処理方法によって処理して得られた試料について、従来の免疫クロマトグラフィーを用いた抗原抗体反応によりインフルエンザの同定・定量等の検査が可能である。
【００１９】
（免疫クロマトグラフィー）
免疫クロマトグラフィーの手法は既に公知であるが、その原理を模式的に図１に示す。
図１の標識部材（２）に抗インフルエンザ抗体標識着色粒子を保持させ、インフルエンザウイルス検出部位（４）に抗インフルエンザ抗体を固定する。
図１の試料添加部材（１）に上記の処理した検体を試料として滴下し、クロマト膜担体（３）を介して吸収部材（５）の方向に試料を展開させる。検体中に対象とするインフルエンザウイルスが混入している場合には、インフルエンザウイルスと抗インフルエンザ抗体標識着色ラテックス粒子が反応し、これらの複合体が、抗インフルエンザ抗体を固定したインフルエンザウイルス検出部位（４）に補足され、着色のバンドが現れる。（４）に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれるインフルエンザウイルスの量を概略的に把握することができる。
【００２０】
標識部材（２）及びインフルエンザウイルス検出部位（４）に使用する抗体は、インフルエンザの異なる部位を認識する抗体であれば良い。これらの抗体は、通常用いられる方法によって得ることができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（ＫｏｈｌｅｒＧ，Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｆｕｓｅｄｃｅｌｌｓｓｅｃｒｅｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７．１９７５）による細胞融合によるハイブリドーマの樹立法によっても良く、単に抗原を動物に免疫してその血清を精製したものであっても良い。標識部材（２）の標識着色粒子として、免疫クロマトグラフィーに使用される公知のものを使用することができる。例えば、金コロイドや着色ラテックス粒子が挙げられる。クロマト用膜担体（３）は、免疫クロマトグラフィーにおいて一般的に使用される膜であればよく、通常多孔質膜であり、具体的にはニトロセルロース膜を使用することができる。
【００２１】
（キット）
また、本発明は、上記前前処理液を含むインフルエンザ検出のための免疫クロマトグラフィー用検出キットにも及ぶものである。具体的には、前処理液、免疫クロマトグラフィー用デバイス、各種抗体等が含まれるもの等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
本発明の理解のために、以下に実施例を示して説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）非イオン界面活性剤（ＮＰ４０）の効果
本実施例は、検体前処理液中の各濃度の非イオン界面活性剤（ＮＰ４０）のクロマト膜担体上のバックグランドに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００２４】
１）検体前処理液の組成
１００ｍＭクエン酸−０．４ＭＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトールを含有する溶液（ｐＨ６．０）に、ノニデットＰ−４０（ＮＰ４０）（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニールエーテルの商品名）の濃度が０，０．０５，０．１，０．２，０．４及び０．８（ｖ／ｖ）％の各濃度となるように加え、検体前処理液とした。
【００２５】
２）検体及びその処理
鼻汁を綿棒にて採取したもの検体とした。
綿棒に含ませた鼻汁を、上記前処理液約０．８ｍＬを含む容器内に浸し、検体前処理液と混和したものを試料とした。その後、静置した試料液をメンブレンフィルター（孔径１μｍ）でろ過し、測定用試料とした。鼻汁検体は、ＭＤＣＫ細胞による培養法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．２８（６）１３０８−１３１３（１９９０）によりインフルエンザＡ及びＢが陽性と判定されたものを用いた。
【００２６】
３）免疫クロマトグラフィー
免疫クロマトグラフィー用ストリップ（図１）の材料として、試料添加用部材（１）はガラス繊維ろ紙、標識保持部材（２）は、市販の抗インフルエンザ抗体を感作し、青色に着色したラテックスを保持したポリビニル処理ガラス繊維ろ紙、クロマト用膜担体（３）はニトロセルロース膜、吸収部材（５）はガラス繊維とセルロースの混合ろ紙を使用した。また検出部位（４）には、市販の抗インフルエンザ抗体を感作した。培養法によりインフルエンザ陽性と確認された検体について、通常の方法で前処理したものを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、クロマトグラフィーを行った。
各濃度のＮＰ４０を含む検体前処理液で前処理した測定用試料液を０．２０ｍＬを免疫クロマトグラフィー用デバイスに滴下し、免疫クロマトグラフィーを２０分行った。
【００２７】
その結果を表１に示した。ＮＰ４０を全く含まない場合は、クロマト用膜担体が、ラテックス粒子の青色に染まった状態でバックグラウンドが不適合であるため、免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザＡ及びＢについて判定することはできなかった。一方、ＮＰ４０を０．０５（ｖ／ｖ）％以上含む検体前処理液で処理した場合には、クロマト用膜担体が着色しておらず、バックグラウンドが良好であり、インフルエンザＡ及びＢについて容易に判定することができた。
【００２８】
【表１】

【００２９】
（実施例２）各種の非イオン界面活性剤の効果（バックグラウンド）
本実施例は、検体前処理液中の各種非イオン界面活性剤のクロマト膜担体上のバックグランドに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００３０】
検体前処理液は、１００ｍＭクエン酸−０．４ＭＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトールを含有する溶液（ｐＨ６．０）に、表２に示す各種非イオン界面活性剤を０．１（ｖ／ｖ）％となるように加え、検体前処理液とした。
検体及びその処理、免疫クロマトグラフィーは実施例１と同様に行った。
【００３１】
その結果、表２に示す各種の非イオン性界面活性剤を使用するとバックグランドの発色が低減化され、正確に判定することができた。
【００３２】
【表２】

【００３３】
（実施例３）各種の非イオン界面活性剤の効果（インフルエンザ測定）
本実施例は、実施例２と同様に、検体前処理液中の各種非イオン界面活性剤の免疫クロマトグラフィーに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
検体前処理液は、検体及びその処理、免疫クロマトグラフィー用ストリップの使用並びに免疫クロマトグラフィーは実施例２と同様に行った。
【００３４】
その結果、表３に示す各種の非イオン性界面活性剤を使用すると、すべての界面活性剤において陽性と判定された。
【００３５】
【表３】

【００３６】
（実施例４）各濃度のＮａＣｌを加えたときの効果（インフルエンザＡ及びＢ測定）
本実施例は、検体前処理液中の各濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）のクロマトグラフィーに及ぼす効果を確認することを目的として行った。
【００３７】
１）検体前処理液の組成
０．１（ｖ／ｖ）％ＮＰ４０、１００ｍＭクエン酸、１０ｍＭジチオトレイトール及び１０ｍＭＥＤＴＡを含む液（ｐＨ６．０）に、ＮａＣｌ濃度が表４に示す各濃度となるように加え、検体前処理液とした。
２）検体及びその処理
検体は、培養法においてインフルエンザＡ及びＢ陰性と判定された３検体の鼻腔吸引液を実施例１に記載の方法で前処理した。
３）免疫クロマトグラフィー用ストリップについては、実施例１と同様行った。
【００３８】
その結果を表４及び５に示した。ＮａＣｌを全く含まない場合は陰性試料であっても陽性と判定されたが、ＮａＣｌの添加により非特異反応が抑制されることが確認された。
【００３９】
【表４】

【００４０】
【表５】

【００４１】
【発明の効果】
以上詳述したように、免疫クロマトグラフィーにより検査する場合において、本発明の検体の前処理液を用いて検体を前処理することにより、より正確かつ簡便にヒトの検体中のインフルエンザウイルスを検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫クロマトグラフィー用ストリップの概略を示す図である。
【符号の説明】
１試料添加部材
２標識部材（抗インフルエンザ抗体標識着色粒子保持部）
３クロマト用膜担体
４検出部位（抗インフルエンザ抗体固定部）
５吸収部材

Claims

免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンみ、このアルカリ金属イオンを少なくとも０．３Ｍ含むことを特徴とする検体前処理液。
前記非イオン性界面活性体が、ポリオキシエチレン系界面活性剤である請求項１に記載の前処理液。
前記ポリオキシエチレン系界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体から選択される請求項２に記載の前処理液。
非イオン性界面活性剤の濃度が０．０５〜２（ｖ／ｖ）％である請求項１に記載の前処理液。
上記検体が、鼻汁、痰又は咽頭ぬぐい液である請求項１〜４のいずれか１に記載の前処理液。
請求項１〜４のいずれか１に記載の前処理液を使用するインフルエンザウイルスの検査用検体の処理方法。
請求項１〜４のいずれか１に記載の前処理液を含む免疫クロマトグラフィー用検査キット。