CN104897905B - 一种c反应蛋白胶体金检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体‑1,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。本发明所提供的C反应蛋白胶体金检测试剂盒兼具灵敏性和特异性,具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是由肝脏合成的一个相对分子质量为1.15×103的五环结构,在它的每一边都有亲钙性结合位点,且其分子代谢周期的半衰期仅为5-7小时,因此在补体系统的免疫调节中扮演了一个重要的生物学角色。CRP是公认的最有价值的典型急性时相蛋白,正常血浆水平小于5mg/L,机体受到感染、外伤、肿瘤及理化因素刺激后5-8小时迅速升高,24小时内峰值可为正常值的数百倍。若感染得到控制CRP可在24-48小时内迅速下降,1周内恢复正常。CRP可与凋亡细胞、坏死细胞膜磷脂或细菌、真菌、寄生虫的细胞壁磷酸胆碱结合,激活补体,调理吞噬功能,促使内源性或外源性配体物质的清除。
目前,CRP的测定广泛地应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断,特别是快速定量CRP检测在儿科疾病的诊断中得到较好的应用。在细菌感染急性期CRP水平显著升高,而在病毒感染时CRP水平正常或轻微升高,因此CRP水平可作为细菌感染或病毒感染首选鉴别诊断指标;在鉴别呼吸道感染时,细菌性肺炎常导致CRP水平升高到60mg/L以上,而急性支气管炎很少导致CRP水平的显著升高,所以测定CRP水平有助于鉴别肺炎和支气管炎,减少对非细菌性急性支气管炎患者予抗生素治疗;外科手术后若病人继发细菌感染特别是化脓性感染时,CRP明显升高(大于50mg/L),手术第2天达到高峰,72小时后开始逐步下降,恢复时间因手术部位和组织损伤程度而异,故CRP还可以作为诊断感染和手术后并发症的一项指标;此外,研究还表明CRP还可能与风湿性疾病、系统性红斑狼疮、外科学、妇产科学、胃肠病学、血液学和肿瘤学等密切相关,应用范围还将不断扩大。
超敏C反应蛋白(hypersensitive-CRP,hs-CRP)与普通CRP就是同一种蛋白,只是由于其测定方法更敏感而得名。采用临床常规方法测定CRP时,检测的线性范围一般为3-200mg/L,因检测方法缺乏足够的敏感性,无法测出血液中含量更低的CRP。近年来相继采用胶乳增强的免疫散射比浊法、免疫投射比浊法、免疫发光法等技术使检测的灵敏度得到了很大提高,检测低限延伸为0.005~0.10mg/L,使得低浓度CRP(如0.15~10mg/L)的测定更加准确。
近年来关于CRP、hs-CRP的研究越来越多,应用越来越广泛。在感染、心脑血管性疾病、糖尿病、代谢综合征、外周血管病、慢性阻塞性肺病、哮喘、肿瘤等多种疾病中用于指导临床诊疗。目前已经知道,CRP和hs-CRP的临床意义并不完全相同。CRP在感染性疾病和结缔组织病中有较高的应用价值,而hs-CRP近年来在心脑血管疾病、糖尿病中越来越受到关注。
人类C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用,从而清除入侵机体的病原微生物和损伤,坏死,凋亡的组织细胞,在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有70多年的历史,传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物,但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病,并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
作为急性时相反应的一个极灵敏的指标,血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高,可达正常水平的2000倍。结合临床病史,有助于随访病程。特别在炎症过程中,随访风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等。
C反应蛋白测试可以鉴别细菌或病毒感染,监测病情,监控术后感染,抗生素疗效观察,预测心血管病危险等,C反应蛋白对诊断和治疗都很有价值,因此其测定速度就有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明采用以下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。
优选的,所述底板为PVC底板。
优选的,所述硝酸纤维素膜上,检测线位于离加样端较近一侧,质控线位于离加样端较远一侧。
优选的,所述检测线包括检测线T1和检测线T2,所述检测线上包被有抗C反应蛋白单克隆抗体-2。
优选的,所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1和抗C反应蛋白单克隆抗体-2可以是相同的单克隆抗体,也可以是不同的单克隆抗体。
优选的,所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1为Anti-C Reactive Proteinantibody[CRP135],所述抗C反应蛋白单克隆抗体-2为Anti-C Reactive Proteinantibody[CRP-8](ab13426),或所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1为Anti-CReactive Protein antibody[CRP-8](ab13426),所述抗C反应蛋白单克隆抗体-2为Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]。
优选的,所述样品垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为50-100mM。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为10-40mM。
更优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,所述缓冲液还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
更优选的,NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
优选的,所述试剂盒还包括卡壳,所述卡壳包括背卡和上盖,所述背卡设有试纸卡卡槽,所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内,所述上盖设有测试窗和加样孔,所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合,所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
更优选的,所述卡壳为塑料卡壳。
优选的,所述检测试剂盒用于检测样品中的C反应蛋白,所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
本发明第二方面提供所述C反应蛋白胶体金检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1)用胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1溶液喷涂金标垫,制得包含抗C反应蛋白单克隆抗体-1的金标垫;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗C反应蛋白单克隆抗体-2及羊抗鼠IgG,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上,切裁制得检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为10-40mM。
更优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,所述缓冲液还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
更优选的,NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0.5mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为4-8mg/ml。
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
本发明第三方面提供所述C反应蛋白胶体金检测试剂盒在C反应蛋白检测领域的用途。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的C反应蛋白胶体金检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性,能够快速检测C反应蛋白。此外,所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987 and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1本发明试纸卡的制备
1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理,预处理缓冲液为:18-冠醚-66mg/ml氯化钠0.3mg/ml,甘氨酸2.0mg/ml的水溶液,pH=7.4,预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡2h,取出放于37℃烘干;然后用胶体金标记的Anti-C ReactiveProtein antibody[CRP135]溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被Anti-CReactive Protein antibody[CRP135]的金标垫,溶液中胶体金与单克隆抗体的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线(检测线T1和检测线T2)和质控线上分别喷涂1mg/ml的Anti-C Reactive Protein antibody[CRP-8](ab13426)溶液和羊抗鼠IgG(购自MAXMED LABORATORIES INC.)溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
实施例2对比试剂盒的制备
对比例试纸卡的制备:采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,其他试剂及实验方法均同实施例1。
1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,然后用胶体金标记的Anti-CReactive Protein antibody[CRP135]溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]的金标垫,溶液中胶体金与单克隆抗体的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的Anti-CReactive Protein antibody[CRP135]溶液和羊抗鼠IgG溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
实施例3检测试剂盒的灵敏度实验
取实施例1制得的C反应蛋白胶体金检测试剂盒,将试剂盒放置在水平台面上,分别检测0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml的C反应蛋白标准品,每个浓度重复5次,以0pg/ml作为空白对照。用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中,在滴加样品后8-15分钟判读结果。用金标读数仪对试剂盒检测线上的显色结果进行判读定量分析。以C反应蛋白浓度为横坐标,金标读数仪检测信号(每个样品的检测结果为检测线T1和检测线T2显色结果的平均值,每个浓度的检测结果为该浓度下5个样品的平均值)为纵坐标,建立标准曲线。在标准曲线上,随着标准品浓度的升高,测得的信号值也随之升高。
根据标准曲线计算可知,本试剂盒对0.5pg/ml、0.8pg/ml的样品可以部分检出,对1.0pg/ml的样品全部检出,其最低检出限≤1.0pg/ml,并在5-1000pg/ml的范围具有良好的线性,T线颜色的深浅与样品中CRP浓度成正比。
各浓度的批内最大CVs为4.9%,平均CVs为3.8%(每个浓度的样品同批进行测试),各浓度的批间最大CVs为5.3%,平均CVs为4.6%(每个浓度的样品分5批进行测试)表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
选择未检测出C反应蛋白的小牛血清进行加标回收实验,加入C反应蛋白标准品,将C反应蛋白的浓度分别调整至20pg/ml、100pg/ml、300pg/ml、500pg/ml、800pg/ml,空白对照及每个浓度的样品均重复测定5次。各浓度的批内最大CVs为4.6%,平均CVs为3.9%,各浓度的加标回收率为97.9%-99.8%,表明本发明所提供的试剂盒具有良好的准确度。
取实施例2的检测试剂盒进行灵敏度测试得知,实施例2的检测试剂盒灵敏度为≥50pg/ml。
实施例4检测试剂盒的稳定性实验
试剂盒的稳定性实验
1.实验目的:
将C反应蛋白胶体金检测试剂盒密封保存,并存放于4℃及室温(25℃左右)下,观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。
2.实验方法:
保存于4℃的试剂盒每周取出4盒,分别检测0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.2pg/ml、1.6pg/ml的C反应蛋白标准品;保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒,分别检测0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.2pg/ml、1.6pg/ml的C反应蛋白标准品。
3.实验结果:
经验证,试纸盒在4℃下可保存20个月,在室温下可保存16个月;在可保存的期限内,试剂盒均可达到1.0pg/ml的检测灵敏度。
综上所述,本发明所提供的检测试剂盒具有很好的灵敏性,阴性本底更低,有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒,包括试纸卡,试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线;
所述金标垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合;
所述缓冲液中还包括NaCl和冠醚,所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。
2.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述硝酸纤维素膜上,检测线位于离加样端较近一侧,质控线位于离加样端较远一侧。
3.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述检测线包括检测线T1和检测线T2,所述检测线上包被有抗C反应蛋白单克隆抗体-2。
4.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,质控线上包被有羊抗鼠IgG。
5.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述样品垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为50~100mM。
6.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,缓冲液的浓度为10~40mM。
7.根据权利要求6所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,NaCl在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml,冠醚在缓冲液中的浓度为0.1-20mg/ml。
8.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,还包括卡壳,所述卡壳包括背卡和上盖,所述背卡设有试纸卡卡槽,所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内,所述上盖设有测试窗和加样孔,所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合,所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
9.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒用于检测样品中的C反应蛋白,所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求1~9任一权利要求所述的胶体金检测试剂盒的制备方法,具体包括如下步骤:
1)用胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包含抗C反应蛋白单克隆抗体-1的金标垫;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗C反应蛋白单克隆抗体-2及羊抗鼠IgG,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上,切裁制得检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
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