CN104865390A - 一种c反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明提供一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人全血、血清或血浆中的C反应蛋白。

Description

一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种C反应蛋白(CRP)近红外荧光检测试剂盒及其用途。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是由肝脏合成的一个相对分子质量为1.15×103的五环结构，在它的每一边都有亲钙性结合位点，且其分子代谢周期的半衰期仅为5-7小时，因此在补体系统的免疫调节中扮演了一个重要的生物学角色。CRP是公认的最有价值的典型急性时相蛋白，正常血浆水平小于5mg/L，机体受到感染、外伤、肿瘤及理化因素刺激后5-8小时迅速升高，24小时内峰值可为正常值的数百倍。若感染得到控制CRP可在24-48小时内迅速下降，1周内恢复正常。CRP可与凋亡细胞、坏死细胞膜磷脂或细菌、真菌、寄生虫的细胞壁磷酸胆碱结合，激活补体，调理吞噬功能，促使内源性或外源性配体物质的清除。
目前，CRP的测定广泛地应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，特别是快速定量CRP检测在儿科疾病的诊断中得到较好的应用。在细菌感染急性期CRP水平显著升高，而在病毒感染时CRP水平正常或轻微升高，因此CRP水平可作为细菌感染或病毒感染首选鉴别诊断指标；在鉴别呼吸道感染时，细菌性肺炎常导致CRP水平升高到60mg/L以上，而急性支气管炎很少导致CRP水平的显著升高，所以测定CRP水平有助于鉴别肺炎和支气管炎，减少对非细菌性急性支气管炎患者予抗生素治疗；外科手术后若病人继发细菌感染特别是化脓性感染时，CRP明显升高(大于50mg/L)，手术第2天达到高峰，72小时后开始逐步下降，恢复时间因手术部位和组织损伤程度而异，故CRP还可以作为诊断感染和手术后并发症的一项指标；此外，研究还表明CRP还可能与风湿性疾病、系统性红斑狼疮、外科学、妇产科学、胃肠病学、血液学和肿瘤学等密切相关，应用范围还将不断扩大。
超敏C反应蛋白(hypersensitive-CRP，hs-CRP)与普通CRP就是同一种蛋白，只是由于其测定方法更敏感而得名。采用临床常规方法测定CRP时，检测的线性范围一般为3-200mg/L，因检测方法缺乏足够的敏感性，无法测出血液中含量更低的CRP。近年来相继采用胶乳增强的免疫散射比浊法、免疫投射比浊法、免疫发光法等技术使检测的灵敏度得到了很大提高，检测低限延伸为0.005～0.10mg/L，使得低浓度CRP(如0.15～10mg/L)的测定更加准确。
近年来关于CRP、hs-CRP的研究越来越多，应用越来越广泛。在感染、心脑血管性疾病、糖尿病、代谢综合征、外周血管病、慢性阻塞性肺病、哮喘、肿瘤等多种疾病中用于指导临床诊疗。目前已经知道，CRP和hs-CRP的临床意义并不完全相同。CRP在感染性疾病和结缔组织病中有较高的应用价值，而hs-CRP近年来在心脑血管疾病、糖尿病中越来越受到关注。
人类C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病史，有助于随访病程。特别在炎症过程中，随访风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等。
C反应蛋白测试可以鉴别细菌或病毒感染，监测病情，监控术后感染，抗生素疗效观察，预测心血管病危险等，C反应蛋白对诊断和治疗都很有价值，因此其测定速度就有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的C反应蛋白近红外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人血清、血浆、全血中全程C反应蛋白(超敏C反应蛋白(hsCRP)和常规C反应蛋白(CRP))的浓度，供临床机构作辅助诊断用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
优选的，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。
硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可以为相同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可以为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-CReactive Protein antibody[CRP135]，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C Reactive Protein antibody[CRP-8](ab13426)，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C Reactive Protein antibody[CRP-8](ab13426)，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-CReactive Protein antibody[CRP135]。
更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
近红外光(NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。
本发明第二方面提供所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。
优选的，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。
更优选的，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。
优选的，所述步骤1中，缓冲液为磷酸盐(PBS)缓冲液。
更优选的，所述PBS缓冲液为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。
优选的，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。
在本发明一实施例中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的投料量分别为1mg、100ug、100ug。
优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇胺的用量。
优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。
优选的，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。
更优选的，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。
优选的，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml。
优选的，所述步骤2中，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。
优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38℃烘箱烘干。
所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
优选的，所述步骤1中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C Reactive Proteinantibody[CRP135]，所述步骤2中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C ReactiveProtein antibody[CRP-8](ab13426)，或所述步骤1中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C Reactive Protein antibody[CRP-8](ab13426)，所述步骤2中的抗C反应蛋白单克隆抗体为Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]。
优选的，所述步骤3中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
本发明第三方面提供所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒在C反应蛋白检测领域的用途。
所述用途具体为使用所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒对样品中的C反应蛋白进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人血清、血浆、全血中全程C反应蛋白(超敏C反应蛋白(hsCRP)和常规C反应蛋白(CRP))的浓度。所述试剂盒采用免疫荧光层析法，其最小可测量可达0.5pg/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同类定量诊断试剂价格低20-30％，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中，为临床治疗提供定性依据。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外荧光检测仪，由上海凯创生物技术有限公司开发提供。
实施例1
1.免疫荧光抗C反应蛋白抗体颗粒制备：
用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭，冠醚的终浓度为6mg/ml。
2.试剂盒的制备：
用0.01M pH7.2的PBS缓冲液稀释Anti-C Reactive Protein antibody[CRP-8](ab13426)至浓度2.0mg/ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按1ul/cm的量进行喷膜，37℃烘箱烘干备用。
用制备好的探针(步骤1制得的标记有Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]的近红外荧光乳胶微球)溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。
将包被抗C反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。
实施例2
C反应蛋白近红外荧光检测法实验：
试剂盒检测：
以C反应蛋白标准品和PBS缓冲液分别配置浓度为0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml的C反应蛋白标准溶液，以0pg/ml作为空白对照，空白对照及每个浓度的标准品均重复测定5次。标准品及试剂盒均平衡至室温开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本(约120-150ul)。15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000。以C反应蛋白浓度为横坐标，近红外荧光检测仪检测荧光信号(平均值)为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的荧光信号值也随之升高。
根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0.5pg/ml、0.8pg/ml的样品可以部分检出，对1.0pg/ml的样品全部检出，其最低检出限≤1.0pg/ml，并在2-1000pg/ml的范围具有良好的线性。
各浓度的批内最大CVs为4.1％，平均CVs为3.6％(每个浓度的样品同批进行测试)，各浓度的批间最大CVs为4.8％，平均CVs为4.2％(每个浓度的样品分5批进行测试)表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
选择未检测出C反应蛋白的小牛血清进行加标回收实验，加入C反应蛋白标准品，将C反应蛋白的浓度分别调整至20pg/ml、100pg/ml、300pg/ml、500pg/ml、800pg/ml，空白对照及每个浓度的样品均重复测定5次。各浓度的批内最大CVs为4.1％，平均CVs为3.3％，各浓度的加标回收率为98.9％-101.5％，表明本发明所提供的试剂盒具有良好的准确度。
将本发明所提供的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于4℃的试剂盒每周取出4盒，分别检测0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.5pg/ml的C反应蛋白标准品；保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0.5pg/ml、0.8pg/ml、1.0pg/ml、1.5pg/ml的C反应蛋白标准品。经验证，试纸盒在4℃下可保存20个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可保存16个月，且最低检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到1.0pg/ml的检测灵敏度。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可以为相同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可以为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
和/或，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
和/或，所述步骤1中，缓冲液为PBS缓冲液；
和/或，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；
和/或，所述封闭液为乙醇胺。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
和/或，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
和/或，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
和/或，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm；
和/或，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
7.如权利要求1-3任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒在C反应蛋白检测领域的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述用途具体为使用所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒对样品中的C反应蛋白进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
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