CN103869086B - 一种血清自身抗体检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测哺乳动物血清自身抗体的检测试剂盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白选自p53、Annexin1、CAGE、NY‐ESO‐1、HuD、Cyclin？D、PGP9.5、GBU4‐5、MDM2、GAGE7、XAGE1b、SOX2、MAGE？A1和MAGE？A4中的五种或以上的组合。本发明的检测试剂盒采用一组新型癌症相关生物标志物的自身抗体所对应的抗原组合，利用生物素形成多聚体的特征进行抗原蛋白包被，以人抗标签肽作为定量检测的标准品，从而提高了血清自身抗体检测的敏感性和准确性，为以自身抗体来进行癌症诊断提供了优化的检测方法。

Description

一种血清自身抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于抗体检测领域，具体地说，是关于一种新的血清自身抗体检测试剂盒。
背景技术
根据中国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》，每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，每分钟就有6人确诊为癌症。居全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤的76.39%。居全国恶性肿瘤死亡第一位的仍是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤的84.27%。同时，癌种也呈现地域化特点，食管癌高发区主要集中河南、河北等中原地区；胃癌高发区主要集中在西北及沿海各省，如上海、江苏、甘肃、青海等较为突出；肝癌高发区集中在东南沿海及东北吉林等地区。肺癌在所有的肿瘤死亡率中高居首位。世界卫生组织在2001年曾经发布警告说，在过去的10年中，全球肺癌的发病率每年以22％的速度在飞快上升，每年全球新增肺癌患者达120万人，死亡110万人。据北京市卫生局提供的统计数据显示，2010年肺癌位居北京市户籍人口男性恶性肿瘤发病的第一位，在女性中居第二位，仅次于乳腺癌。2001至2010年，北京市肺癌发病率增长了56%。全市新诊断出的癌症中有五分之一为肺癌。据流行病学专家预测，如果不控制吸烟和空气污染，到2025年，我国每年肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。肺癌的预后与其发展阶段紧密相关，局限性肺癌五年存活率为53%，而在出现转移的情况下五年存活率仅为4%。肺癌的早期发现和及时防治能显著提高患者的存活率和生活质量。
肿瘤早期筛查的目的在于准确地诊断出在显著症状出现之前的、尚处于发展早期的癌症。各种癌症都有各自适合的检测方法，但都存在相应的优缺点，检测中一个尤其普遍的问题是很难在癌症发生的早期检测到肿瘤的存在，而且检测结果的特异性不高从而导致过度诊断的问题。以肺癌为例，随着医学影像学的发展，低剂量螺旋CT被广泛用于检测肺部早期结节。但是低剂量螺旋CT的问题在于其检测结果的假阳性，CT不能区分肿瘤和其他的阴影比如肺部组织瘢痕化或良性肿块。这样的检测方法不仅不能有效地降低肺癌患者的死亡率，多次CT检测还有可能加速肺癌的恶化。其他的检查方法包括正电子发射断层扫描、经皮细针支气管针吸活检和经支气管壁针吸活检、痰细胞病理学检查以及支气管内镜检查，则存在各方面的、如价格昂贵、无法早期筛查、有创伤、或可靠性差的问题。因此，真正的非介入性诊断方法成为医生和患者共同期待的、用于及早确认肺癌的辅助手段。
20世纪初，PaulEhrlich在动物个体之间进行肿瘤移植的研究，发现移植瘤能在被移植动物体内萎缩消除，第一次提出了肿瘤抗原和肿瘤免疫的概念。1966年，Baldwin首次证实了机体免疫系统对自发肿瘤的鉴别和排斥反应，从而奠定了肿瘤抗原研究的理论基础。20世纪70年代初免疫监控的概念被正式提出，该理论认为在肿瘤发生的早期，机体的免疫系统可以及时识别癌细胞，并抑制癌细胞的生长甚至清除癌细胞，为癌症的早期检测和治疗提供了新的思路。癌症的抗原检测用于辅助诊断的方法被大量采用，但是抗原检测的一个问题是，其在血清中含量非常低，到其浓度增加到利用现有技术即可检测出来的水平时，癌症已经发展到晚期了。因此，要达到早期准确检测肿瘤相关抗原的目的，必须显著提高检测的灵敏度。利用机体免疫应答反应的特点，极低浓度的抗原即可激发放大的免疫反应从而产生相应的抗体，而且由于B细胞的记忆功能，免疫反应可以持续存在。因此有一个切实可行的、采用检测血清自身抗体滴度来推断机体对相应肿瘤相关抗原的免疫反应。
关于自身抗体产生的机理还不是很清楚。近年来癌症领域的研究进一步证实，在正常情况下正常细胞表达的野生型蛋白质不会导致机体的免疫应答。癌症研究领域一个广泛接受的观点是，在肿瘤发展的早期肿瘤细胞产生基因突变、异位或重组，相关的抗原释放后被免疫系统识别为“异体蛋白”而发生免疫应答反应，因而产生针对该抗原的抗体，即肿瘤自身抗体。自身抗体以游离的形式或与相关抗原结合成抗原抗体复合物的形式存在于体内循环中。由于免疫系统的敏感性和稳定性，且体液免疫反应具有放大作用，癌症自身抗体可以比影像学诊断出癌细胞前5年在血液中被检测出。与血清中的其他多肽和蛋白质不同，抗体可以非常稳定地存在而不易被降解。加上人体免疫系统的记忆功能，肺癌自身抗体可以在体内长期存在，其浓度不随肿瘤的发展而变化。多篇中外文献研究表明，在多种肿瘤包括肺癌患者的血清中均可检测到肿瘤相关抗原的自身抗体的存在。对肿瘤早期抗原和抗体的免疫检测正逐渐成为诊断领域的一个研究热点。
抗体的检测在生物学上是一种很成熟的技术，这使得自身抗体的精确检测成为可能。虽然已经有大量证据证实在癌症发展的早期人体免疫系统可以产生自身抗体，但是由于技术的限制，很多自身抗体在癌症发展的早期很难被检测到。根据报道，迄今为止已有超过40种自身抗体和癌症有相关性，哪些组合具有临床意义，尤其在中国人中有临床意义还不清楚。即使有些自身抗体的检测被认为与某一种癌症具有相关性，也只是停留于小范围的研究阶段。由于缺乏切实可行的大规模、可重复的检测方法，在中国人中采用自身抗体进行大规模临床试验尚属空白。这方面的临床研究在国外已经相继有报道，例如采用EarlyCDT‐Lung酶联免疫法来检测血清自身抗体以进行肺癌的早期诊断，迄今已检测了12万名患者，验证了这种检测方法的可靠性，目前已成为一种有效的辅助检测手段。虽然自身抗体的检测拥有广阔的前景，但要精确且高敏感性地检测血清中的自身抗体，推广上还是有一定的难度。
肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，根据肺癌的发展又可分为I、II、III和IV期。不同类型的肺癌其发生机理还不是很清楚，但该领域最近的临床研究结果证实了人体对肿瘤细胞的免疫反应。在过去的几十年中，已有多种肿瘤抗原被鉴定，其中有些肿瘤抗原已经被用于肿瘤诊断，但这些肿瘤抗原在部分良性病变或者妊娠期的病人的血液中也会明显增加，缺乏对肺癌的特异性和敏感性。自身抗体作为肿瘤标记物，使用单个的自身抗体很难准确推测所有肺癌的发病情况。即使对于同样的肺癌，不同的患者免疫系统的反应也是不一样的，因此需要结合多个自身抗体的表达特征综合分析，以确定符合特定患者群体的抗体标记物。事实上，近年来的研究和实际操作倾向于采用一系列的抗体同时检测来进行癌症诊断和辅助诊断。如Chapman等使用酶联免疫法比较了采用6个（p53、NY‐ESO‐1、CAGE、GBU4‐5、AnnexinI和SOX2）和7个（p53、NY‐ESO‐1、CAGE、GBU4‐5、SOX2、HuD和MAGEA4）自身抗体来检测肺癌患者和健康对照组血清中相应自身抗体的含量。结果显示单一抗体检出阳性率在5～36%之间，特异性为96～100%。相比之下，采用6个抗体联合检测得到的敏感性和特异性分别为39%和89%，而采用7种抗体联合检测的敏感性达到41%，特异性为91%（ChapmanCJ,etal.(2012)EarlyCDT(R)‐Lungtest:improvedclinicalutilitythroughadditionalautoantibodyassays.TumourBiol33(5):1319‐1326）。这充分说明肿瘤标志物的单项检测，虽然特异性很高，但检出敏感性和准确性较低；而联合多个抗原检测后，虽然特异性相对降低，但敏感性和准确性均有显著的提高。
以肿瘤抗原的自身抗体作为肿瘤诊断的标志物，利用肿瘤抗原来检测肿瘤自身抗体，与其他的诊断方法相比具有很高的特异性和敏感性，为真正在临床上对肿瘤进行早期筛查提供可能。更为重要的是，这些抗原所激发的免疫反应在肺癌患者体内浓度升高刺激自身抗体的产生，此过程早在肺癌出现可检出的肿块前就已经发生。由于自身抗体的产生大大早于肿瘤的出现，检测到自身抗体的存在比影像学方法检出肿块要早一至五年。随着我国肿瘤发病率的逐年攀升，对高敏感性的、高通量的、可推广使用的自身抗体的检测方法成为业界急需解决的一个问题。
发明内容
本申请的发明人采用基因重组的办法筛选出一组与癌症特异相关的抗原，采用固定抗原或抗体与固相载体的方法，发展出一套适合在中国患者中相对准确预测癌症的抗体标记物。
因此，本发明的目的在于提供一种新的血清自身抗体检测试剂盒。
为了达到以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
一种用于检测哺乳动物血清自身抗体的检测试剂盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白选自p53、Annexin1、CAGE、NY‐ESO‐1、HuD、CyclinD、PGP9.5、GBU4‐5、MDM2、GAGE7、XAGE1b、SOX2、MAGEA1和MAGEA4中的五种或以上的组合。
根据本发明，所述p53包含如SEQID:1所示的氨基酸序列、所述Annexin1包含如SEQID:2所示的氨基酸序列、所述CAGE包含如SEQID:3所示的氨基酸序列、所述CyclinD包含如SEQID:4所示的氨基酸序列、所述NY‐ESO‐1包含如SEQID:5所示的氨基酸序列、所述GBU4‐5包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述HuD包含如SEQID:7所示的氨基酸序列、所述PGP9.5包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述MDM2包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述GAGE7包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述XAGE1b包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述SOX2包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述MAGEA1包含如SEQID:6所示的氨基酸序列、所述MAGEA4包含如SEQID:6所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述抗原蛋白固定于固相载体上，优选的，所述固相载体包括:酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片。
根据本发明，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和间接包被法，其中，直接包被法是将抗原蛋白直接固定于固相载体上，间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。
根据本发明，所述抗原蛋白上接有标签肽，优选的，所述标签肽包括:His标签、GST标签、c‐Myc标签、Flag标签、HA标签和生物素标签。
根据本发明，不同抗原对应的血清自身抗体的相对滴度定量采用统一的标签肽和标签肽抗体之间的特异性反应及与标准曲线的回归来进行计算。
根据本发明，所述抗原蛋白表达于大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞中。
根据本发明，所述抗原蛋白经Ni柱、分子筛、离子柱、疏水柱纯化。
根据本发明，所述检测试剂盒还包括阳性质控品和标准品。根据一个优选实施例，所述阳性质控品和标准品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段。
根据本发明，所述检测试剂盒还包括显色剂、血清稀释缓冲液、洗液和终止液。
根据本发明的优选实施例，所述显色剂为TMB、AMPPD、4‐MUP、或吖啶酯；所述血清稀释缓冲液为NaCl300mM，KCl2.7mM，Na2HPO48.1mM，KH2PO41.5mM，酪蛋白1g/L，牛血清白蛋白10g/L，硫柳汞0.2g/L，pH7.6；所述洗液为NaCl0.137M，KCl2.7mM，Na2HPO48.1mM，KH2PO41.5mM，pH7.6；所述终止液为2M硫酸或1M盐酸。
根据本发明，所用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。
根据本发明，所述哺乳动物为人类。
本发明的有益效果可归纳如下:
1、新的抗原组合提高检测的敏感性。本发明相关的检测试剂盒与国外同类产品相比加入了新的相对于恶性肿瘤的抗原标志物，因而更能有效鉴别出非恶性/良性疾病和恶性肿瘤的情况。同时，本发明的检测试剂盒中使用了在肿瘤中产生的抗原异位剪接形成新的异构体。新的异构体可能在癌症细胞发生发展的过程中特异性表达，它的序列与野生型不一样，可能会与新的癌症特异性抗体反应，从而增加检测的敏感性。
2、新的标准品的使用提高检测的准确性。本发明的检测试剂盒包含一组多个抗原蛋白，可以同时检测多个自身抗体。本发明采用重组人抗c‐Myc标签的免疫球蛋白作为统一标准品，可特异性的识别所有带有c‐Myc标签的检测试剂盒中的抗原。每个抗原蛋白都带有一个c‐Myc标签，可以与标准品中的重组人抗c‐Myc标签的免疫球蛋白特异性结合，同时与之相连接的癌症特异性抗体也可以与血清中的相关自身抗体结合，其自身抗体的滴度通过与人抗c‐Myc标签的免疫球蛋白标准品的滴度相比较计算出来。其对c‐Myc标签的相对滴度不随测量的条件变化而改变，从而使相对c‐Myc标签的滴度准确反映出癌症特异性抗体滴度。由于每个抗原蛋白都带有一个c‐Myc标签,重组人抗c‐Myc标签的免疫球蛋白标准品对每个抗原蛋白的c‐Myc标签的亲合力固定不变，而且不同的抗原蛋白的c‐Myc标签得出的滴度成线性关系，所以在实际的试剂盒中只需要使用一个抗原蛋白的c‐Myc标签作为标准品，即可推算出其他抗原对应的自身抗体的相对滴度。
3、本发明的检测试剂盒使用的抗原采用间接包被的方法，提高检测的敏感性和特异性。间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。链霉亲和素是四聚体，通过生物素使抗原形成四聚体，而抗体为二聚体，从而使抗体抗原反应产物更稳定，而且由于多聚体的形成可以起到放大信号的作用。
附图说明
图1为包含p53抗原蛋白外源片段的重组质粒示意图。
图2为不同抗原蛋白在鉴别中国正常人、肺癌患者和良性肺部患者的有效性的结果图，其中，图2A为p53；图2B为Mdm2；图2C为CAGE；图2D为MAGEA1；图2E为MAGEA4；图2F为GAGE7；图2G为Pgp9.5；图2H为GBU4‐5；图2I为SOX2；图2J为HuD；图2K为CyclinD；图2L为NY‐ESO‐1；图2M为Annexin1；图2N为XAGE‐1b。
图3为标准品的剂量‐效应曲线。
图4为标准品倍比稀释后的线性曲线。
图5为不同抗原倍比稀释后的线性曲线与c‐Myc的比较结果，其中，图5A为c‐Myc；图5B为p53；图5C为MAGEA1；图5D为GAGE7；图5E为Pgp9.5；图5F为MAGEA4。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明提供了一种用于检测哺乳动物血清自身抗体的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含一组经过优化重组的抗原蛋白p53、Annexin1、CAGE、NY‐ESO‐1、HuD、CyclinD、PGP9.5、GBU4‐5、MDM2、GAGE7、XAGE1b、SOX2、MAGEA1和MAGEA4中的任意五种或以上的抗原蛋白组合；抗原蛋白的氨基酸序列为全长或经异位剪切的序列；抗原蛋白均经过生物素标记，接有标签肽，所述标签肽可以选自：His标签、GST标签、c‐Myc标签、Flag标签、HA标签和生物素标签，阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段。
本发明中，所述用于检测哺乳动物血清自身抗体的检测试剂盒可以采用固定抗原或者固定抗体两种检测方法，通过对血清中多种抗体的联合检测，对肺癌的检测准确性高。
间接固定抗原的检测方法如下:将经过基因重组改良并纯化的抗原采用生物素和链霉亲和素之间的特异性反应包被在微孔板或吸附于磁珠、亲和膜、液相芯片上，制成固相载体，向包被抗原的固相载体中加入待测血清样本，当待测血清样本中含有特异性抗体（一抗）时，该抗体与固相载体上的抗原特异性结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗人c‐Myc免疫球蛋白G抗体（二抗），形成抗原‐抗体‐酶标抗体复合物，经显色剂TMB显色后，用酶标仪在450纳米波长下测定其吸光度，吸光度值与待测血清样本中的自身抗体浓度呈线性正相关，采用抗人c‐Myc免疫球蛋白G抗体片段作为标准品来计算出待测样本中的自身抗体的滴度。
直接固定抗原的检测方法如下:纯化的抗原蛋白吸附在微孔板、磁珠、亲和膜、液相芯片上，制成固相载体，向包被抗原的固相载体中加入待测血清样本，当待测血清样本中含有特异性抗体（一抗）时，该抗体与固相载体上的抗原特异性结合，然后加入经辣根过氧化物酶标记的抗原蛋白，抗原抗体反应形成抗原抗体复合物，经洗液清洗三次后，直接加入显色剂TMB测定样本的吸光度，与标准品的标准曲线进行比较从而推算出样本中自身抗体的滴度。
本发明中，所述用于检测哺乳动物血清自身抗体检测试剂盒的检测原理，以间接包被的酶联免疫试剂盒为例，链霉亲和素被包被在酶标板上，利用生物素和链霉亲和素之间反应的高亲和力和高特异性的特征，将生物素标记的抗原蛋白包被在酶标板上。抗原蛋白能够特异地与相应的肺癌血清中的抗体结合并俘获相应的抗体，辣根过氧化物酶标记的抗c‐Myc人免疫球蛋白G能够特异地与被俘获的抗体结合，最终形成针对肺癌血清抗体的“链霉亲和素+生物素‐抗原蛋白+血清抗体+二抗+辣根过氧化物酶”的复合物，辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺反应生成黄色产物，通过酶标仪检测450纳米波长的吸光度值，与标准曲线换算，用于检测酶标板上结合的血清中肺癌自身抗体的含量。
以下实施例中使用的试剂和溶液的组分及配制方法如下:
1、PBS:NaCl137mM；KCl2.7mM；Na2HPO48.1mM；KH2PO41.5mM；pH7.6，0.22μm滤膜负压过滤；
2、血清/抗体稀释缓冲液:NaCl300mM；KCl2.7mM；Na2HPO48.1mM；KH2PO41.5mM；酪蛋白1g/L；牛血清白蛋白10g/L；硫柳汞0.2g/L；pH7.6；0.22μm滤膜负压过滤。
3、20×洗液:NaCl2.74M；KCl54mM；Na2HPO4162mM；KH2PO430mM；pH7.6；0.22μm滤膜负压过滤；
4、TMB显色剂:50mM咪唑缓冲液pH5；7.5mMPEG3350；2.94mM过氧化氢尿素；1.6mMTMB；
5、终止液:2M硫酸；
6、抗体稀释液/血清稀释缓冲液:NaCl300mM；KCl2.7mM；Na2HPO48.1mM；KH2PO41.5mM；牛血清白蛋白10g/L；硫柳汞0.2g/L；pH7.6；0.22μm滤膜负压过滤；
7、封闭液:1×PBSpH7.4；163mMNaCl；0.5%酪蛋白；0.05%NaN3；
8、抗原稀释液:1×PBSpH7.4；163mMNaCl；1%TritonX‐100；
9、抗原洗涤液:1×PBSpH7.4；163mMNaCl；1%TritonX‐100；10%甘油。
实施例1、重组抗原蛋白表达及纯化
以人类cDNA文库（购自Invitrogen公司）为模板，采用PCR扩增的方法制备所需的重组抗原蛋白片段，其中，重组抗原蛋白的氨基酸序列信息如表1所示，PCR扩增的引物信息如表2所示。
表1、重组抗原蛋白的氨基酸序列信息
重组抗原蛋白 氨基酸序列编号
p53 SEQ ID NO:1
Annexin1 SEQ ID NO:2
CAGE SEQ ID NO:3
Cyclin D SEQ ID NO:4
NY‐ESO‐1 SEQ ID NO:5
GBU4‐5 SEQ ID NO:6
HuD SEQ ID NO:7
PGP9.5 SEQ ID NO:8
MDM2 SEQ ID NO:9
GAGE7 SEQ ID NO:10
XAGE1b SEQ ID NO:11
SOX2 SEQ ID NO:12
MAGE A1 SEQ ID NO:13
MAGE A4 SEQ ID NO:14
表2、引物信息
将上述扩增获得的PCR产物纯化后用BamHI和EcoRI酶切，载体质粒pET‐28a（+）同样用BamHI和EcoRI酶切，然后将经同样酶切的PCR产物和载体质粒连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得的重组质粒采用菌落PCR、酶切和测序鉴定确认包含正确的外源片段。以p53抗原蛋白为例，重组质粒的图谱如图1所示。
将上述获得的包含抗原片段的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经异丙基硫代‐β‐D‐半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获得的重组抗原蛋白经Ni‐NTA柱和分子筛两步纯化后用Bradford法定量，采用SDS‐PAGE鉴定确认抗原蛋白表达、纯化和定量结果。
纯化的抗原蛋白采用快速生物素标记试剂盒（购自ThermoFisher,USA公司）按照产品说明进行生物素标记，通过生物素和链霉亲和素之间的高特异性结合将抗原蛋白吸附于固相载体上。
实施例2、用于检测自身抗体的酶联免疫试剂盒的制备
2.1、用于检测自身抗体的酶联免疫试剂盒的组成
用于检测自身抗体的酶联免疫试剂盒（固定抗原）包括以下成分:
1、包被不同抗原蛋白组合的酶标板；
2、酶结合物‐辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白，浓度为0.1μg/ml；
3、阳性质控品（标准品）:人抗c‐Myc标签免疫球蛋白G（购自Tribioscience公司）；
4、阴性质控品；
5、血清稀释缓冲液；
6、TMB显色剂；
7、20×抗原洗涤液；
8、终止液；
9、封口膜。
2.2、酶标板制备及血清样本的ELISA检测
酶标板制备及ELISA检测步骤如下:
1、用含有5μg/ml的链霉亲和素（Thermo）稀释到PBS，4℃包被过夜，每孔各50μl；
2、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBS，pH7.4洗一次；
3、倒掉溶液，把板拍干，加入250μl封闭液，室温封闭1hr（室温～25度）并置于微孔板振荡仪振荡；
4、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBS，pH7.4洗一次；
5、倒掉溶液，把板拍干后，加入相应的抗原50μl（用抗原稀释液稀释抗原到终浓度150nM），室温孵育1.5hr置于微孔板振荡仪振荡；
6、倒掉溶液，把板拍干后，用抗原洗涤液放置5分钟洗一次；
7、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBS，pH7.4洗两次；
8、倒掉溶液，把板拍干，加入封闭液250μl，室温封闭1hr并置于微孔板振荡仪振荡；
9、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBS，pH7.4洗一次；
10、倒掉溶液，把板拍干后，加入血清稀释缓冲液稀释的血清样本（稀释度1:110），每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡1hr；
11、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBST（含0.05%Tween‐20）洗涤三次；
12、加入辣根过氧化物酶标记的重组抗人免疫球蛋白G抗体（1:20000用抗体稀释液稀释），每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡0.5hr；
13、倒掉溶液，把板拍干后，用250μlPBST（含0.05%Tween‐20）洗涤三次；
14、加入TMB室温显色15min，每孔加50μl；
15、加入终止液，每孔加50μl；
16、酶标仪于450nm波长下读板，根据标准曲线计算相应抗体浓度。
实施例3、抗原组合及临床意义
3.1、候选的抗原蛋白在中国肺癌患者中的有效性的检测
将实施例1中重组表达和纯化的抗原蛋白按照实施例2所述的方法检测其在中国肺癌患者中的有效性，包括p53、Annexin1、CAGE、NY‐ESO‐1、HuD、CyclinD、PGP9.5、MDM2、GAGE7、GBU4‐5、XAGE1b、SOX2、MAGEA1,P62和MAGEA4。
结果如图2所示，其中:
1、p53对应的自身抗体在肺癌患者中的OD450显著高于正常人和良性肺病，其中良性肺病患者中有2例阳性；
2、Mdm2对应的自身抗体在肺癌患者中的OD450显著高于正常人和良性肺病，其中良性肺病患者中有部分样本高于正常人中的水平，通过设置阈值可以调节正常人、良性肺病和肺癌患者阳性比率；
3、CAGE、MAGEA4、GAGE7和PGP9.5的表现类似于p53和Mdm2的情况；
4、相比之下，GBU4‐5、SOX2、HuD、CyclinD、NY‐ESO‐1、Annexin1、MAGEA1、和XAGE‐1b相对应的滴度在中国正常人和肺癌患者中几乎没有区别，因此无法区分正常人和肺癌患者，不适于在中国人中用作早期或辅助诊断的生物标志物，这与国外产品在其他人种中报道的检测结果有差距，这样的差距有可能是由于检测人种的不同造成的差异。
3.2、抗原组合及临床表现
选取不同的抗原组合如下:
1.p53,NY‐ESO‐1,AnnexinI,CAGE,GBU4‐5,SOX2
2.p53,NY‐ESO‐1,CAGE,GBU4‐5,SOX2,HuD,MAGEA4
3.p53,NY‐ESO‐1,P62,CAGE
4.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4
5.p53,HuD,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4
6.p53,MAGE‐A1,CAGE,PGP9.5,MAGE‐A4
7.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,SOX2,MAGE‐A4
8.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,GBU4‐5
9.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4,NY‐ESO‐1,XAGE‐1b
10.p53,MAGE‐A1,NY‐ESO‐1,PGP9.5,MAGE‐A4,Annexin1,GBU4‐5
11.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4,NY‐ESO‐1,Annexin1
12.p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4,Annexin1,SOX2,GBU4‐5
检测上述抗原组合在肺癌患者和健康对照者中的临床表现，结果如以下表3所示:
表3、不同抗原组合的敏感性及特异性
以上抗原组合的敏感性和特异性为在40个肺癌样本和55个健康和良性肺病患者中得到的检测结果。抗原组合为4‐8个，可以看出4个抗原的敏感性最低，为27.5%。而p53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4,Annexin1,SOX2,GBU4‐5的敏感性最高，达到62.5%。抗原组合P53,MAGE‐A1,GAGE‐7,PGP9.5,MAGE‐A4,NY‐ESO‐1,Annexin1检测得到的特异性达到92.7%。这些不同组和的敏感性和特异性存在一些差异，但国外同类产品的组合（组合1和组合2）的表现都不是最好的，因此要达到适合中国人的检测组合还需要选择适应这个人群的特异性抗原组合。
实施例4、标准品检测及定量方法
标准品的剂量‐效应曲线
将标准品抗c‐Myc标签人免疫球蛋白G抗体进行倍比稀释，标准品的起始浓度为570μg/ml，倍比稀释为1:100、1:300、1:1000、1:3000、1:10000、1:30000、1:100000、1:300000。链霉亲和素包被在固相载体如酶标板微孔上，生物素化的带有c‐Myc标签的抗原蛋白间接包被在微孔，采用如前所述的方法进行孵育、洗脱和显色。如图3所示，OD450的值呈现典型的S形曲线，说明形成了抗原抗体复合物。
根据所得的剂量‐效应曲线，将本发明的检测试剂盒中用于标准曲线的抗c‐Myc标签人免疫球蛋白G抗体浓度倍比稀释到60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.875ng/ml、0.9375ng/ml，得到一条线性的曲线。如图4所示，在线性范围内的样本均可以通过OD450的值来计算相对应的抗体滴度或浓度。
根据本发明所利用的原理，每个抗原蛋白都带有c‐Myc标签，理论上讲，每一个抗原蛋白都具有相同或类似的与抗c‐Myc标签人免疫球蛋白G抗体结合的亲和力和特异性。但由于不同蛋白的表位暴露不一样，而且不同蛋白的二级和三级结构各异会影响到其中c‐Myc标签与抗c‐Myc标签人免疫球蛋白G抗体的结合。对比了部分抗原倍比稀释后得到的标准曲线与c‐Myc的比较结果（其他抗原检测结果类似，此处未显示），如图5所示，五种不同的抗原均显示与抗c‐Myc标签人免疫球蛋白G抗体结合较好的线性结果，说明抗原蛋白的结构差异并未影响抗原蛋白上的c‐Myc标签与抗c‐Myc人免疫球蛋白G抗体的结合。因此，本发明的检测试剂盒中的人抗c‐Myc标签免疫球蛋白G抗体可用于定量本发明的检测试剂盒中所有的抗原蛋白对应的血清自身抗体的相对滴度。
虽然以上实施例的检测试剂盒采用加入显色剂TMB测定吸光度的方法来进行信号检测，但本领域的技术人员容易理解，其它已知的信号检测方法，如可见光显色法、化学发光法、荧光发光法等，同样可以适用于本发明的检测试剂盒，因此同样属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种用于检测哺乳动物血清自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白选自p53、Annexin1、CAGE、NY-ESO-1、HuD、CyclinD、PGP9.5、GBU4-5、MDM2、GAGE-7、XAGE-1b、SOX2、MAGE-A1和MAGE-A4中的五种或以上的组合，其中所述组合为下述中的一种：
p53，MAGE-A1，GAGE-7，PGP9.5，MAGE-A4；
p53，HuD，GAGE-7，PGP9.5，MAGE-A4；
p53，MAGE-A1，CAGE，PGP9.5，MAGE-A4；
p53，MAGE-A1，GAGE-7，SOX2，MAGE-A4；
p53，MAGE-A1，GAGE-7，PGP9.5，GBU4-5；
p53，MAGE-A1，GAGE-7，PGP9.5，MAGE-A4，NY-ESO-1，XAGE-1b；
p53，MAGE-A1，NY-ESO-1，PGP9.5，MAGE-A4，Annexin1，GBU4-5；
p53，MAGE-A1，GAGE-7，PGP9.5，MAGE-A4，NY-ESO-1，Annexin1；
p53，MAGE-A1，GAGE-7，PGP9.5，MAGE-A4，Annexin1，SOX2，GBU4-5。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述p53包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、所述Annexin1包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、所述CAGE包含如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、所述CyclinD包含如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、所述NY-ESO-1包含如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列、所述GBU4-5包含如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列、所述HuD包含如SEQIDNO:7所示的氨基酸序列、所述PGP9.5包含如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列、所述MDM2包含如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列、所述GAGE-7包含如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列、所述XAGE-1b包含如SEQIDNO:11所示的氨基酸序列、所述SOX2包含如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列、所述MAGE-A1包含如SEQIDNO:13所示的氨基酸序列、所述MAGE-A4包含如SEQIDNO:14所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白固定于固相载体上。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括：酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白的固定方法包括直接包被法和间接包被法，其中，直接包被法是将抗原蛋白直接固定于固相载体上，间接包被法是通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。
6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白上接有标签肽。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标签肽包括:His标签、GST标签、c-Myc标签、Flag标签、HA标签和生物素标签。
8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，不同抗原对应的血清自身抗体的相对滴度定量采用统一的标签肽和标签肽抗体之间的特异性反应及与标准曲线的回归来进行计算。
9.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白表达于大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞中。
10.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白经Ni柱、分子筛、离子柱、疏水柱纯化。
11.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性质控品和标准品。
12.如权利要求11所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品和标准品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段。
13.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括显色剂、血清稀释缓冲液、洗液和终止液。
14.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所用的信号检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。
15.如权利要求13所述的检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为TMB、AMPPD、4-MUP、或吖啶酯；所述血清稀释缓冲液为NaCl300mM，KCl2.7mM，Na2HPO48.1mM，KH2PO41.5mM，酪蛋白1g/L，牛血清白蛋白10g/L，硫柳汞0.2g/L，pH7.6；所述洗液为NaCl0.137M，KCl2.7mM，Na2HPO48.1mM，KH2PO41.5mM，pH7.6；所述终止液为2M硫酸或1M盐酸。
16.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述哺乳动物为人类。
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