CN107449914A

CN107449914A - 泛素羧基端酯酶l1自身抗体的应用

Info

Publication number: CN107449914A
Application number: CN201710560713.7A
Authority: CN
Inventors: 栗占国; 孙晓麟; 李雪
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2017-12-08

Abstract

本发明提供了泛素羧基端酯酶L1的自身抗体在神经精神性狼疮诊断中的应用，包括分析对象的生物样品以检测生物标志物的存在；基于样品中生物标志物的比例诊断神经精神性狼疮。提供了诊断神经精神性狼疮的具体方法和标准。

Description

泛素羧基端酯酶L1自身抗体的应用

技术领域

本发明涉及标志物的鉴定和使用，具体是涉及泛素羧基端酯酶L1自身抗体的应用，更具体的，涉及用于神经精神性狼疮诊断的方法。本发明涉及利用Luminex液相芯片分析技术、酶联免疫吸附测定(ELISA)检测NPSLE患者脑脊液、血清中的泛素羧基端酯酶L1(Ubiquitin Carboxyl Hydrolase L1，UCH-L1)自身抗体。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种由自身免疫机制介导的弥漫性结缔组织病，以产生针对细胞成分的多种自身抗体并导致多系统、多器官受累为特征。神经精神性狼疮(Neuropsychiatric Systemic Lupus Erythematosus，NPSLE)主要包括19种SLE神经精神损害类型，是重型SLE的常见系统受累表现和严重预后不良因素。NPSLE患者可死于各种神经系统损害或精神行为异常，包括颅内血栓或出血、脑炎、癫痫持续状态等引起的脑组织坏死；颅内压严重升高引起的脑疝以及精神损害患者的自伤、自杀行为等等，造成了沉重的社会经济负担。NPSLE患者病情难以缓解、预后极差，与目前该病的临床诊断困难、缺乏特异性的辅助检查方法有关。UCH-L1自身抗体有望填补NPSLE在诊断学标志物方面的空白，提高临床诊断的准确度，并协助评估病情、指导治疗，从而降低该病的致残率与死亡率。

发明内容

本申请提供了一种用于诊断和治疗对象中系统性红斑狼疮的发明方法，包括分析对象的生物样品以检测一个或更多生物标志物的存在；基于样品中一个或更多生物标志物的比例诊断神经系统疾病；和对对象施用治疗物以改变一个或更多生物标志物的比例。本发明诊断方法在诊断神经精神性系统性红斑狼疮中是有用的。

我们通过Luminex液相芯片分析技术比较了多种神经元相关蛋白在重型NPSLE患者(sNPSLE)、轻型NPSLE(mNPSLE)患者及对照组脑脊液中的浓度，发现UCH-L1在sNPSLE患者脑脊液中显著升高，并且与NPSLE的临床严重程度及SLE疾病活动指数呈显著正相关。进一步研究发现，UCH-L1的脑脊液自身抗体有望用于NPSLE的临床诊断，其敏感性和特异性分别达到53％和91％，明显优于此前报道的少数标志物(阳性率6-46％，敏感性及特异性均未报道)，对于提高NPSLE的诊断准确性很有帮助。

本发明的目的之一是提供能够有效诊断NPSLE的标志物——UCH-L1自身抗体。

其中，所述的泛素羧基端酯酶L1自身抗体(anti-UCH-L1)为NPSLE患者体内产生的结合UCH-L1蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物的自身内源性抗体；

本发明同时提供一种用于区分神经精神性狼疮和非神经精神性狼疮以及其他神经损伤的组合物，包括：从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品，和泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物，以上述泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物为抗原的自身抗体。

另外的，本发明同时提供一种用于诊断和治疗神经精神性狼疮可能性的试剂盒，该试剂盒包括：用于连接检测从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品中的生物标志物的抗原成分的基体；作为抗原的泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物；用于检测UCH-L1自身抗体的其他抗体或检测试剂；和用于将抗体与生物样品或一部分生物样品反应以检测生物样品中标志物的存在或量的操作指南。

附图说明

图1：脑脊液UCH-L1浓度在sNPSLE组、mNPSLE组、非NPSLE的SLE对照组、其它CTD组和其他神经疾病组(NSD组)中的比较；

图2：UCH-L1与SLEDAI(系统性红斑狼疮疾病活动指数)和NPSLE累积类型数的关系；

图3：anti-UCH-L1在NPSLE及对照组脑脊液中的比较及反映诊断效率的ROC曲线图

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下例实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。

实施例：泛素羧基端酯酶L1及其自身抗体在神经精神性狼疮诊断及疾病严重程度评估中的应用

一、病例及对照样本入选标准

脑脊液标本选自36例NPSLE患者、19例除外NPSLE的SLE患者(SLE对照组)、4例其它结缔组织病对照组和10例其它神经系统疾病对照患者(见图3)。血清标本选自与脑脊液标本匹配的21例NPSLE患者和6例SLE对照组。所有NPSLE患者符合1999年美国风湿病学会制定的NPSLE诊断标准，并分为符合2001年NPSLE修订标准(severe NPSLE，简称sNPSLE)组和不符合2001年NPSLE修订标准(mild NPSLE，简称mNPSLE)组。SLE患者符合1997年美国风湿病学会制定的SLE诊断标准。所有对照组患者均出现神经精神表现，并由有经验的风湿免疫科医生除外NPSLE。脑脊液及血清均来源于临床检验的剩余标本。患者的病例资料采集如下：

1、临床资料：包括年龄、NPSLE神经精神受累表现和SLE疾病活动性评分。

NPSLE神经精神受累表现：根据1999年美国风湿病学会制定的NPSLE标准进行分类。

SLE疾病活动度评分(Systemic lupus erythematosus disease activityindex，SLEDAI)：为经典的SLE疾病活动度评估方法，根据有无癫痫发作、器质性脑病综合征、视力受损、脑神经异常等表现及实验室异常进行评分。

2、实验室指标：

包括常规化验、免疫学非特异性指标、血清自身抗体、脑脊液压力及化验，记录其原始检测数据，并根据正常范围转换为正常、升高、降低或阳性、阴性。自身抗体的检测方法分别为：间接免疫荧光法(ANA)、ELISA法(抗dsDNA抗体、ACL、β2-GPI、ANuA)、免疫斑点法(抗Ro/SSA抗体、抗La/SSB抗体、抗U1RNP抗体、抗Sm抗体、抗r-RNP抗体)、凝固法(狼疮抗凝血因子试验)。

二、实验方案

1、UCH-L1的检测

使用本实验室的Luminex液相芯片分析系统及MERCK MILLIPORE(Germany)公司的UCH-L1抗体荧光微球溶液，按说明书进行规范操作，每例标准品、对照及待测样品均设置复孔，变异系数(CV)＞20％者重新进行检测。具体步骤为：在96孔滤膜板上每孔加入200ul的assay buffer，再加入25ul的待测样品原液及25ul微球溶液，混匀后4℃隔夜孵育20小时，弃去孔内液体并反复洗涤后，每孔加入25ul的detection antibody，常温孵育1小时后，每孔加入25ul显色剂(streptavidin-phycoerythrin)，常温孵育30分钟后，弃去孔内液体并反复洗涤后，每孔加入鞘液100ul。通过Luminex 200高通量检测平台读取每孔荧光值。使用Luminex系统的配套xPONENT软件进行数据分析。

2、UCH-L1自身抗体的检测

ELISA法检测合成UCH-L1蛋白与NPSLE患者血清及脑脊液抗体的反应：UCH-L1蛋白是由223个氨基酸组成的一类半胱氨酸水解酶，通过大肠杆菌原核表达该蛋白。用包被缓冲液(0.05M的碳酸盐缓冲液，pH 9.6)将蛋白溶解稀释至0.5ug/ml，包被酶标版(100ul/孔)，4℃孵育过夜。0.05％磷酸盐吐温缓冲液(PBS-T)洗板4次后，用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭3.5小时，再用0.05％PBS-T洗板4次，加入100μl待测脑脊液原液或1∶10稀释血清，37℃反应1h，0.05％PBS-T洗板6次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。洗板后加入TMB显色液反应10min，用2M硫酸终止后，测定标本在450nm处的吸光值。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照。

三、实验数据分析：

应用SPSS 20软件进行数据处理，计量资料采用独立样本t检验或非参数检验，两个以上变量相互比较采用单因素ANOVA。计数资料采用χ²检验或Fisher’s精确检验。采用Spearman秩相关分析数据间的相关性。以p＜0.05为差异有统计学意义。

四、实验结果：

(一)UCH-L1可作为反映NPSLE病情严重程度的脑脊液标志物

UCH-L1是一种主要位于轴突的神经元胞浆蛋白，具有神经系统高选择性，在脑组织中的浓度约为其它组织的50倍。该蛋白功能广泛，其中最重要的功能是作为去泛素酶成员之一，参与泛素蛋白酶体系统的调控并影响神经突触的重塑。目前已发现UCH-L1功能异常是神经退行性疾病、肾小球足突损伤、部分肿瘤、糖尿病的致病机制之一。神经元缺血坏死引起的胞浆UCH-L1进入脑脊液，并穿过血脑屏障进入血液，是脑外伤、新生儿缺氧缺血性脑病、癫痫、中毒性脑病中脑脊液或血清UCH-L1浓度升高的主要原因。本研究首次发现，UCH-L1可作为反映NPSLE病情严重程度的脑脊液标志物，具体实验结果如下：

1、sNPSLE组脑脊液UCH-L1浓度显著高于mNPSLE组和SLE对照组但缺乏诊断特异性

基于前期预实验结果，我们筛选出UCH-L1为可能的NPSLE相关蛋白，扩大例数并加入其它CTD对照组，继续进行实验(表1)。按1999年ACR NPSLE分类，本研究共纳入12类NPSLE神经精神表现患者，其中22例(61.1％)患者有1种以上表现。mNPSLE组除1例轻度抑郁状态患者外，12例(92.3％)患者均表现为单纯狼疮性头痛。SLE对照组中，非感染性器质性脑病包括重度低钠血症1例、原发性癫痫1例和肥厚性硬脑膜炎1例；颅内感染包括结核感染1例、曲霉感染2例和隐球菌脑膜炎1例；精神性疾病包括焦虑状态2例，抑郁状态1例；原因不明的非特异性症状包括头痛表现7例、晕厥1例和一过性抽搐1例。CTD对照组包括坏死性淋巴结炎1例(无神经精神表现)、CTD并发多发性周围神经病1例、CTD合并妊娠重度子痫前期1例和CTD合并头痛表现1例。NSD对照组包括多发性硬化2例、神经系统肿瘤2例、副癌综合征1例、糙皮病1例、运动神经元病1例、缺血性眼底病1例、神经源性膀胱1例和血管迷走性晕厥1例。

表1 59例患者的疾病类型及脑脊液UCH-L1浓度

sNPSLE(severe NPSLE)：符合2001年NPSLE修订标准；mNPSLE(mild NPSLE)：符合1999年ACR NPSLE标准、但2001年分类排除；SLE：合并神经精神表现，并除外NPSLE；CTD：结缔组织病；NSD：神经系统疾病。

结果显示(图1)，sNPSLE组的脑脊液UCH-L1浓度显著高于mNPSLE和SLE对照组，但SLE对照组中3例标本UCH-L1浓度较高，这三例患者患有严重低钠血症、颅内结核感染和不明原因的头痛。同时，sNPSLE组脑脊液UCH-L1浓度较其它CTD对照组及其它NSD对照组无显著差异，表明UCH-L1不具有诊断特异性。

2、脑脊液UCH-L1浓度与NPSLE病情严重程度有关

本研究发现，UCH-L1浓度与NPSLE患者的SLEDAI评分呈显著正相关(图2，r＝0.335，p＜0.05)。对不同NPSLE累计类型数患者的脑脊液UCH-L1浓度进行比较发现，重叠2种及以上NPSLE表现的患者脑脊液UCH-L1浓度明显高于仅有1种表现者(图2，p＜0.005)。结合此前研究，该指标与神经元损伤程度密切相关，已有多篇关于脑血管病变和癫痫的研究显示其具有发病后数小时内达峰、然后逐渐回落的规律，因而，对NPSLE患者脑脊液UCH-L1的浓度检测，有助于判断颅内病变严重程度。

相关因素分析还表明，UCH-L1浓度在部分脏器受累情况下浓度显著升高，包括血尿(p＝0.05)、肌酐升高(p＝0.006)、血液系统受累(p＝0.019)、抗心磷脂抗体阳性(p＝0.037)、脑脊液蛋白升高(p＝0.014)，同样提示UCH-L1与NPSLE病情严重程度相关。

(二)UCH-L1自身抗体是具备NPSLE诊断价值的脑脊液标志物

通过间接ELISA方法检测脑脊液UCH-L1抗体水平，发现UCH-L1抗体在NPSLE组中的水平显著高于SLE对照组、其它结缔组织疾病对照组和其它神经系统疾病对照组(图3)。ROC诊断曲线显示，脑脊液UCH-L1抗体在诊断NPSLE中的敏感度为53％，特异性高达91％(图3)，为NPSLE诊断的可靠且特异的标志物。而此前报道的潜在标志物，包括抗磷脂抗体、抗rRNP抗体、抗NMDA受体抗体、抗微管相关蛋白2抗体，在NPSLE中的阳性率为6-46％，敏感性及特异性均无报道，且不同研究的结果缺乏一致性，不具备特异性诊断价值，目前均无法应用于临床诊断。相关因素分析表明，脑脊液UCH-L1抗体与心脏受累(p＝0.043)、蛋白尿(p＝0.048)和血液系统受累(p＝0.016)显著相关。

在本说明书中提到的专利和出版物反映了本发明相关的领域的技术人员的水平。这些专利和出版物在这里通过参考纳入，就如每份单独申请或出版物在这里具体和单独详细表述相同的程度。

上述描述是本发明的特定具体实施例的说明，但并不意味着对其实践的限制。下面的权利要求，包括其所有等同物，用于限定本发明的范围。

Claims

1.一种生物标志物在制备用于诊断和治疗神经精神性狼疮可能性的药物中的用途，其特征在于，包括：分析对象的生物样品以检测生物标志物的存在；基于样品中生物标志物的比例诊断神经精神性狼疮；和对对象施用治疗物以改变所述的生物标志物的比例。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标志物是以泛素羧基端酯酶L1(Ubiquitin Carboxyl Hydrolase L1，UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列)或其衍生物为抗原的自身抗体；或该自身抗体的衍生物，和它们的组合的组。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗物是直接治疗物。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗物是间接治疗物。

5.一种用于区分神经精神性狼疮和非神经精神性狼疮以及其他神经损伤的组合物，其特征在于，包括：从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品；泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物；以上述泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物为抗原的自身抗体。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述对象是哺乳动物，优选的所述对象是人。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，结合所述生物标志物的抗原成分固定在基体上。

8.一种用于诊断和治疗神经精神性狼疮可能性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：用于连接从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品中的生物标志物或结合生物标志物的成分的基体；作为抗原的泛素羧基端酯酶L1(UCH-L1)蛋白或其降解产物(如蛋白中的部分序列片段、多肽)或衍生物；用于检测UCH-L1自身抗体的其他抗体或检测试剂；和用于将抗体与生物样品或一部分生物样品反应以检测生物样品中标志物的存在或量的操作指南。