CN115925894A - 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 - Google Patents
一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115925894A CN115925894A CN202210897525.4A CN202210897525A CN115925894A CN 115925894 A CN115925894 A CN 115925894A CN 202210897525 A CN202210897525 A CN 202210897525A CN 115925894 A CN115925894 A CN 115925894A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- ibv
- antibody
- coronavirus
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 4
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 title description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 22
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 3
- 241000561734 Celosia cristata Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 3
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000008921 Avian coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000287127 Passeridae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000320410 Rat sialodacryoadenitis coronavirus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012459 agar diffusion assay Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229940035535 iodophors Drugs 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂。本发明针对鸡传染性支气管炎已有的不同的IBV分离株，比对分析相应的N蛋白序列，选择其中保守性较好的，并且免疫原性较强的序列，作为广谱免疫原，以该免疫原制备获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合免疫原的特性，同时能够较好的区分IBV病毒以及其他病毒，制备成为试纸条之后，也具有较好的区分效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物领域，也涉及检测领域，具体的，涉及针对一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂。
背景技术
冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，属于RNA病毒，冠状病毒仅感染脊椎动物，最早是从鸡身上分离出来的，冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是许多家畜宠物包括人类的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据系统发育树，冠状病毒可分为4个属，即α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为4个独立的亚群，分为a、b、c、d群。冠状病毒因在电镜下形似“皇冠”而得名，直径60-220nm。对人类高致病性的SARS-CoV和MERS-CoV隶属β属。我国科学家发现2019-nC oV与SARS-CoV的基因组相似度为80％，可以确认它亦属β属。
到目前为止发现能感染人类的冠状病毒有七种，感染人类的冠状病毒可以对人造成普通感冒、严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征，还有新型冠状病毒肺炎。而动物的冠状病毒又分为了哺乳动物冠状病毒和禽冠状病毒，哺乳动物冠状病毒主要为α、β属冠状病毒，可感染包括蝙蝠、猪、犬、猫、鼠、牛、马等多种动物。禽冠状病毒主要来源于γ和δ属冠状病毒，可引起多种禽鸟类，如鸡、火鸡、麻雀、鸭、鹅、鸽子等发病。如PEDV引起猪流行性腹泻，IBV引起鸡传染性支气管炎，DdCoV引起鸭急性剧烈腹泻，CCoV引起犬的急性胃肠炎，FIPV引起猫传染性腹膜炎，BCV引起犊牛腹泻，ECV引起新生幼驹水样腹泻，SDAV引起大鼠涎泪腺炎，MCoV感染可引起水貂腹泻，等等。冠状病毒虽会引起人和多种动物发病，但它们对理化因子耐受性较差，在体外仅可存活约24h，常用消毒方法如紫外线、含氯消毒剂、碘伏、0.1％过氧乙酸、75％乙醇等都可灭活病毒；该类病毒对热敏感，35℃即可使之受到抑制，但在低温下可冻存数年。
目前，尚无经证实对治疗冠状病毒感染有价值的抗病毒药物。一般治疗原则为呼吸支持及其他器官功能支持，预防并发症为主。近些年研究发现，干扰素α、干扰素γ和他克莫司在体外能够抑制SARS-CoV的生长；使用SARS患者恢复期血清对治疗可能有效。避免病毒感染的有效手段是研制出高效安全的疫苗，病毒样粒子在形态和结构上与天然病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性，是研制安全高效的候选疫苗。例如，研究人员基于冠状病毒蛋白和流感病毒蛋白的嵌合种疫苗，给小鼠注射后起到较好的保护作用。
鸡传染性支气管炎(Chicken infectious bronchitis，IB)是广泛流行的一种高度接触性传染病，传染性支气管炎病毒属冠状病毒科冠状病毒属。各种日龄的鸡群都可以发生，不但会引起鸡只死亡，而且会致使鸡群生产性能下降，饲料报酬降低。因其病原的易变性致使该病不能得到有效控制。它给现代密集型养禽业带来了严重的经济损失，因此引起世界各国的重视。鉴于该病对养鸡业造成巨大的威胁和危害，及早发现，并诊断该病是当务之急。中和试验和血凝抑制试验是目前用于传支病毒血清学分型的方法，荧光抗体技术、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验可用于鉴定传支病毒，但不能用作为传支病毒的血清学分型。分别采集病初和2～3周后的双份血清，同时检测血清中对IB病毒的中和抗体，如果第2次(康复期)血样抗体效价高于第1次血样4倍以上，即可确诊为本病。将气管上皮涂片用荧光抗体法可检出IB病毒抗原。但是以上检测方法并不能快速及时的检测相应的病毒，产业上还有待于进一步的开发更为迅速的检测试剂盒。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性用于鸡冠状病毒IBV检测的试剂盒或者试纸条。
一方面，本发明提供一种特异性针对鸡冠状病毒IBV的单克隆抗体。
进一步的，所述单克隆抗体是2D9。
进一步的，所述单克隆抗体2D9的6个CDR序列分别如下所示：
CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如WEKHY所示；
CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如VSWGIDMWSQFDILQT所示；
CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如PWWEKFM所示；
CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如GSEYSSDWNEGR所示；
CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如VFWMYFM所示；
CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如YEWCQDPWD所示。
在本申请中，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为
DIVITQRPALMAASPGEKVTITCGSEYSSDWNEGRWYQQKSGISPKPWIYVFWMYFMGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCYEWCQDPWDFGAGTKLELK
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为
EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSWEKHYWIKQRPGQGLEWIGVSWGIDMWSQFDILQTGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGPWWEKFMWGLGTTLAVSS。
进一步的，本发明的抗体其包含重链可变区和轻链可变区，其中：(a)所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优地，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列；(b)所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。
进一步的，本发明提供的抗体还可以被保守修饰但仍保持相应的结合活性。“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
进一步的，本发明提供了针对IBV N蛋白的单克隆抗体在制备用于检测IBV的试剂盒或者试纸条中的用途。
进一步的，本发明提供一种检测鸡冠状病毒IBV的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，包含包被抗体的的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
进一步的，本发明提供一种用于检测IBV的磁微粒的IBV免疫层析试纸条，该试纸条包括将本发明的单克隆抗体偶联到磁微粒上，再用移液枪吸取适量磁微粒点于结合垫上，然后分别与样品垫、NC膜和吸水垫粘贴于PVC背板上，相邻垫子部分互相重叠，组装好后用试纸条斩切机切割成3mm宽的试纸条，装入含有干燥剂的密封袋中4℃保存即可获得所述的试纸条。
有益效果
本发明针对鸡传染性支气管炎已有的不同的IBV分离株，比对分析相应的N蛋白序列，选择其中保守性较好的，并且免疫原性较强的序列，作为广谱免疫原，以该免疫原制备获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合免疫原的特性，同时能够较好的区分IBV病毒以及其他病毒，制备成为试纸条之后，也具有较好的区分效果。
附图说明
图1IBV免疫原片段筛选结果图
图2单抗亚型鉴定结果图
图3单抗特异性鉴定结果图
具体实施方式
在下面的详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有规定，否则相似的符号通常标识相似的组件。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文所呈现的主题的精神或范围的情况下，可利用其他实施方案，且可作出其他改变。将容易理解的是，如本文中一般性描述的以及在附图中示出的本公开的方面可以以各种各样的不同配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些在本文都是明确地预期的。
实施例1IBV抗原的制备
根据已有的不同的IBV分离株，针对相应的N蛋白进行序列分析，选择其中保守性较好的，并且免疫原性较强的序列，作为广谱免疫原。具体的结果如图1所示，选择多肽片段N-3：
EFTTVVPRDDPQFDNYVKICDQCVDGVGTRPKDDEPRPKS作为免疫原。委托上海生工进行多肽合成。将抗原多肽与KLH偶联备用。
实施例2IBV单克隆抗体的制备
选取四只SPF级6周龄雌性Balb/c小鼠，为使其适应环境先饲养两周。用生理盐水稀释实施例1制备的抗原多肽N-3-KLH偶联复合物，配置成1mg/ml的溶液。首次免疫以免疫原100μg与弗氏完全佐剂按照1:1的比例进行乳化后，皮下多点注射；2周后，再以免疫原100μg与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例进行乳化后，皮下多点注射；2周后，免疫原100μg用生理盐水稀释后，进行腹腔注射加强免疫，2周后，取血清检测效价。
免疫小鼠血清抗体效价测定：用包被液将免疫原多肽N-3抗原溶解，并稀释至20μg/ml，每孔100μl，4℃静置过夜；浸泡洗涤3次，每次3min；每孔加入2％BSA封闭液200μl，37℃孵育2h；浸泡洗涤3次，每次3min；分别加入按1:2500、1:5000、1:10000、1:15000、1:17500、1:20000、1:30000、1:40000梯度稀释的各个小鼠血清，3复孔，37℃孵育1h；浸泡洗涤3次，每次3min；加入有酶标记的兔抗小鼠二抗，1:5000稀释，37℃孵育1h；浸泡洗涤3次，每次3min；加入OPD与过氧化氢混合的显色液，10min后停止反应；测波长490nm处OD值，4只小鼠的血清效价分别是1:20000，1：10000，1:17500，1:17500，1号小鼠的血清效价最高，选择1号小鼠进行细胞融合。
处死小鼠，浸于75％酒精消毒。将小鼠放于超净台中，小鼠左侧身向上放置，用无菌剪剪开皮肤，即可看到脾脏。无菌取出的脾脏，放于含有3层纱布和适量缓冲液的培养皿中，用尖头镊子在脾脏上扎几个孔，切莫扎断脾脏，用弯头镊子挤压脾脏，细胞会从孔中流出，当脾脏变得透明时，此时脾脏中细胞已全部挤压出来，收集于离心管中，用PBS清洗培养皿，以保证细胞全部收集于离心管中，1000rpm离心5min，PBS清洗两次，计数待用。挑选细胞状态好、没有污染的骨髓瘤细胞，弃去上清，PBS清洗一次，加入适量胰酶，室温消化2-3min，吸走胰酶，加入适量培养基，吹起细胞，收集于离心管中，1000rpm离心5min，PBS两次，计数待用。将脾细胞和骨髓瘤细胞按照比例为6:1混合加到50mL圆底融合管中，加入适量SFM无血清培养基，800rpm离心5min。然后弃去上清，轻敲管底，使管底细胞散开。将融合管放于37℃水浴中，1min内加入1mL预热的50％PEG溶液，滴加完成后1min内匀速滴加1mLSFM，重复一次，2-3min内加入7mL的SFM，最后加入20mLSFM，1200rpm离心5min。将融合管放在37℃水浴中，加入预热的适量的10％FBS-1640-1×HAT培养基，铺板。5天后换出一半的培养基，添加一半HAT培养基，10天后换为HT培养基，待细胞长到板底的1/10时，检测阳性孔。采用间接ELISA方法进行阳性克隆的筛选。当两次检测含有克隆的孔的吸光值与阴性对照孔吸光值比值大于2.1时，则可以判定此孔为阳性孔。经统计，共计有15个阳性较好的克隆。将阳性克隆细胞进行亚克隆3次，直到96孔细胞培养板中克隆后的细胞全为阳性时，获得了2株单克隆阳性杂交瘤细胞，分别是1G5和2D9。
采用体内诱生法，所用动物为10周的雌性纯系BALB/c小鼠，提前7天给每只小鼠注射500μL液体石蜡，待2个杂交瘤细胞细胞数量达到1-5×106个时，注入小鼠腹腔中，小鼠腹部胀大后收集腹水，2500rpm低温离心20min，取清澈的腹水进行腹水效价的测定：将每株杂交瘤细胞收集的腹水分别取出50μL按照1:100-1:51200比例进行倍比稀释，按照间接ELISA的方法测定腹水效价，结果如表1所示。
表1单抗的腹水效价
将腹水低温离心，用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g15分钟高速离心(4℃)除去细胞残渣及小颗粒物质。在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS(0.01mol/LPH7.2)，得到纯化后的2个抗体。将抗体的浓度调为5mg/mL，4℃保存。采用SDS-PAGE检测二个抗体均有较为清晰的轻链和重链二个条带。
实施例3 2D9单抗亚型鉴定
将准备好的2D9单抗加入板条样品孔中，每孔50μL；无需孵育，将1×羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μL。混匀器上轻轻混匀，也可用手轻轻敲击板架两侧1min。盖上封板膜，室温孵育1h。1×PBST洗涤3次，拍干。将现配的显色液加入孔中，每孔100μL。显色液配制方法：A液：B液＝1:100。室温避光显色10-20min。每孔加入终止液，每孔100μL。结果判读。结果通过酶标仪读取OD450。颜色最深或者OD值最高的孔对应的即为相应的亚型。结果如图2所示。
从图2的结果可以看出，2D9单抗是IgG1亚型，Kappa链。
实施例4 2D9单抗亲和力鉴定
利用AMC传感器，将纯化出来的2D9抗体用PBST稀释到10μg/mL，抗原多肽N-3用PBST进行梯度稀释：250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL、15.6μg/mL、7.80μg/mL。
运行流程：缓冲液中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液进行传感器再生，输出数据。KD表示平衡解离常数即亲和力。结果见下表2。
表2 2D9抗体的亲和力检测结果
从表2数据可以看出，2D9抗体对抗原具有较好的的亲和力。
实施例5 2D9单抗可变区测序鉴定
采用简并引物扩增法测序获得2D9单抗的重链可变区和轻链可变区序列，具体来说，收集2D9的杂交瘤单克隆细胞，采用试剂盒提取细胞总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸定量分析仪测定RNA浓度。使用RNA反转录试剂盒，将lμg的RNA逆转录成cDNA，以5μl cDNA为模板，按照本领域常规的轻重链引物扩增引物和反应体系来配置PCR反应体系和设置PCR程序，其中退火温度采用梯度降温的方法，然后直接以1μ1第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，PCR反应体系和程序同上，第二轮PCR产物全部上样进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下合适大小的特异目的条带，进行胶回收，连接克隆载体，转化感受态细胞，挑取单克隆菌落，菌落活化后委托上海生工进行测序，测序后获得2D9抗体的VL和VH氨基酸序列，如SEQ ID NO：1和2所示。
实施例6 2D9单抗特异性鉴定
包被免疫原N-3多肽、IBV北京分离株(购买自中国农业大学动物医学院)灭活培养液、IBV山西分离株(SX9)(购买自山西农业大学国家级动物医学实验教学与示范中心兽医微生物与免疫学实验室)，禽流感病毒AIV、传染性法氏囊病(IBDV)、新城疫病毒(NDV)，禽减蛋综合症(EDS76)(均购买自山西农业大学)病毒培养液、BSA的酶标板，加入1:4000稀释的抗体。同时设阴性对照孔。酶标仪测定A450nm。P/N样本孔吸光度值(S)/阴性对照孔吸光度值(N)≥2.1判断为阳性。结果如图3所示。
从图3的ELISA体系的特异性鉴定结果可以看出，IG5单抗针对N-3多肽以及北京分离株和SX9株的P/N值显著大于2.1，为阳性，针对其他物质的检测结果为阴性，说明该体系能特异检测IBV相关病毒，也说明IG5单抗具有较好的用于区分鸡冠状病毒与其他病毒，同时针对鸡冠状病毒也具有较好的广谱性。针对北京分离株和SX9株的P/N值分别是(14.82±0.21)和(15.54±0.39)。
实施例7磁微粒的IBV免疫层析试纸条的制备
一、N-3顺磁微粒的制备：
1)吸取200μL(2mg)磁微粒，用500μL10mmol/LMES缓冲液，pH5.5，含0.05％Tween-20的洗涤缓冲液漂洗3次，分别加入新鲜配制的浓度为5mg/mL的EDC和NHS，37℃旋转活化反应4h；活化后，用MES缓冲液洗涤两次除去未反应的活化剂。
2)用0.005MpH9.0的BS偶联缓冲液(称取0.95g四硼酸钠粉末，溶解于50mL纯水中后，取8mL与2mL的0.05M硼酸缓冲液混合，用0.1M NaOH调pH至9.0,随后稀释40倍，用0.1MNaOH条pH至9.0)洗涤活化好的磁微粒两次，用500μL偶联缓冲液洗涤磁微粒两遍；加入475μL偶联缓冲液重悬洗涂后的磁微粒，再加入25μL共150μg 2D9单克隆抗体，使得磁微粒表面活化的羟基与抗体的氨基接触并在37℃反应3小时，将抗体偶联于磁微粒表面，得到免疫磁微粒。
3)磁分离吸附磁微粒移除上清后，加入1mL含封闭剂的偶联缓冲液(0.25g脱脂奶粉加入10mL0.005MBS偶联缓冲液)，37℃封闭过夜；
4)封闭好的磁微粒用偶联缓冲液洗涤4次后，保存于500μL合适的保存缓冲液中(取0.1gBSA及5mg吐温-20加入10mL0.005MBS偶联缓冲液中，并加入0.01％NaN3，置于4℃冰箱保存备用。通过BCA蛋白定量检测试剂盒分析偶联后的磁微粒抗体含量，结果显示每毫克磁微粒表面偶联抗体的量为36μg，具有较好的偶联量。
二、试纸条的制备
1)样品垫预处理：将裁剪成合适大小的玻璃纤维素膜完全浸泡于样品垫处理液(pH7.4的0.01mol/LPBS，0.5％BSA，0.5％TritonX-100)中处理4h后室温自然干燥。
2)磁微粒结合垫的制备：取适量制备好的单抗标记的磁微粒用移液枪吸取适量磁微粒点于结合垫上，室温通风干燥5h。
3)NC膜的制备：将稀释成1mg/mL浓度的IBV单抗(山西农业大学国家级动物医学实验教学与示范中心兽医微生物与免疫学实验室)和市售羊抗鼠二抗用点膜机以1μL/cm的量分别喷于NC膜的相应位置上，作为检测T线和质控C线。
4)免疫层析试纸条的组装：将制备好的样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫按顺序依次粘贴于PVC背板上，相邻垫子部分互相重叠，组装好后用试纸条斩切机切割成3mm宽的试纸条，装入含有干燥剂的密封袋中4℃保存。
试纸条的检测灵敏度实验：检测灵敏度确定：将N-3多肽抗原稀释于人正常血清中，浓度范围0-1000ng/mL。用构建的试纸条分别检测0、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的血清样品，15分钟后用磁强度检测仪(MAR)分析T/C与样品浓度之间的关系。由于试纸条定量检测的灵敏度为偏离试纸条背景信号的最低浓度，即用空白样品的T/C平均值加上3倍标准差计算出的检测抗原肽的定量检测灵敏度为0.57ng/mL。
特异性鉴定：将灭活的：IBV北京分离株(购买自中国农业大学动物医学院)、IBV山西分离株(SX9)(购买自山西农业大学国家级动物医学实验教学与示范中心兽医微生物与免疫学实验室)，禽流感病毒AIV、传染性法氏囊病(IBDV)、新城疫病毒(NDV)，禽减蛋综合症(EDS76)(均购买自山西农业大学)病毒培养液以及正常鸡血清滴加到试纸条上，15分钟后观察检测结果，如表3所示。
表3试纸条交叉反应性检测抗原检测结果
| 检测样本 | 检测结果 |
| IBV北京分离株 | + |
| IBV山西分离株(SX9) | + |
| 禽流感病毒AIV | - |
| 传染性法氏囊病(IBDV) | - |
| 新城疫病毒(NDV) | - |
| 禽减蛋综合症(EDS76) | - |
| 正常鸡血清 | - |
+表示阳性，-表示阴性。
结果显示本发明的2D9单抗制备的试纸条只与鸡的2种冠状病毒相反应，而不与其他的病毒反应，如表3所示，表明该检测试纸条具有较高的特异性。
虽然已经参考特定实施方案或示例描述了本公开，但是可以理解，实施方案是说明性的，并且本公开的范围不限于此。本公开的替代实施方案对于本公开所属领域的普通技术人员可能变得显而易见。这样的替代实施方案被认为包含在本公开的范围内。因此，本公开的范围由所附权利要求限定并由前述描述支持。本公开中引用或提及的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。
Claims (6)
1.一种特异性针对鸡冠状病毒IBV的单克隆抗体2D9，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为
DIVITQRPALMAASPGEKVTITCGSEYSSDWNEGRWYQQKSGISPKPWIYVFWMYFMGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCYEWCQDPWDFGAGTKLELK
所述重链可变区的氨基酸序列为
EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSWEKHYWIKQRPGQGLEWIGVSWGIDMWSQFDILQTGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGPWWEKFMWGLGTTLAVSS。
2.如权利要求1所述的针对鸡冠状病毒IBV的单克隆抗体2D9在制备检测鸡冠状病毒IBV N蛋白的试剂盒中的用途。
3.如权利要求1所述的针对鸡冠状病毒IBV的单克隆抗体2D9在制备检测鸡冠状病毒IBV的试剂盒中的用途。
4.如权利要求2或3所述的的用途，其特征在于所述检测是基于ELISA原理检测。
5.如权利要求1所述的针对鸡冠状病毒IBV的单克隆抗体2D9在制备检测鸡冠状病毒IBV的试纸条中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述试纸条含有结合垫、样品垫、NC膜和吸水垫。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210897525.4A CN115925894B (zh) | 2022-07-28 | 2022-07-28 | 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210897525.4A CN115925894B (zh) | 2022-07-28 | 2022-07-28 | 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115925894A true CN115925894A (zh) | 2023-04-07 |
| CN115925894B CN115925894B (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=86699609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210897525.4A Active CN115925894B (zh) | 2022-07-28 | 2022-07-28 | 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115925894B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102721812A (zh) * | 2012-06-20 | 2012-10-10 | 江苏省农业科学院 | 检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒 |
| CN104845941A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-08-19 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种鸡传染性支气管炎病毒ibv-k136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3d5、单克隆抗体及其应用 |
| CN106841611A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-06-13 | 四川大学 | 一种基于ibv串联抗原s‑m‑n的免疫磁性微球‑elisa检测ibv抗体的方法 |
| CN112063765A (zh) * | 2020-11-11 | 2020-12-11 | 北京欣颂生物科技有限公司 | 一种核酸抗体双重检测病毒的试剂盒及其制备方法 |
-
2022
- 2022-07-28 CN CN202210897525.4A patent/CN115925894B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102721812A (zh) * | 2012-06-20 | 2012-10-10 | 江苏省农业科学院 | 检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒 |
| CN104845941A (zh) * | 2014-11-18 | 2015-08-19 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种鸡传染性支气管炎病毒ibv-k136、利用其制备的单克隆抗体细胞株3d5、单克隆抗体及其应用 |
| CN106841611A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-06-13 | 四川大学 | 一种基于ibv串联抗原s‑m‑n的免疫磁性微球‑elisa检测ibv抗体的方法 |
| CN112063765A (zh) * | 2020-11-11 | 2020-12-11 | 北京欣颂生物科技有限公司 | 一种核酸抗体双重检测病毒的试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZONGXI HAN ET AL.: "Fine level epitope mapping and conservation analysis of two novel linear B-cell epitopes of the avian infectious bronchitis coronavirus nucleocapsid protein", 《VIRUS RESEARCH》, vol. 171, pages 54 - 64 * |
| 万洪全等: "从肿大的鸡腺胃中分离出冠状病毒", 《中国兽医科技》, vol. 30, no. 2, pages 23 - 25 * |
| 方谱县等: "猪δ冠状病毒N 蛋白单克隆抗体的制备及初步应用", 《中国动物传染病学报》, pages 1 - 16 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115925894B (zh) | 2024-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110964102B (zh) | 能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN109232736B (zh) | 特异性结合猪传染性胃肠炎病毒的单克隆抗体、药物组合物、试剂盒及其应用 | |
| JP2011514321A (ja) | Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの普遍的な検出のための結合タンパク質およびエピトープブロッキングｅｌｉｓａ | |
| CN106771260A (zh) | 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法 | |
| CN110187097B (zh) | 猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用 | |
| JP4953256B2 (ja) | 鳥類免疫系によって認識されるｈｎ蛋白質のエピトープ及び前記エピトープ突然変異を含むニューカッスル病ウイルス | |
| CN114574448B (zh) | 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN103059132A (zh) | 抗h9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN112760294A (zh) | 犬i型腺病毒单克隆抗体/多克隆抗体、双抗夹心elisa试剂盒和应用 | |
| CN109705216B (zh) | 一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 | |
| CN108918869B (zh) | fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用 | |
| CN109810191B (zh) | 一种抗羊骨骼肌肌钙蛋白i单克隆抗体及其应用 | |
| CN107449912A (zh) | 抗h7n9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用 | |
| CN109320606B (zh) | 一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| RU2555530C2 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ H.parasuis | |
| CN115947835B (zh) | 靶向乙型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
| CN106866797A (zh) | J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用 | |
| CN115925894B (zh) | 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂 | |
| CN115894671B (zh) | 一种冠状病毒检测试剂盒 | |
| CN109206510B (zh) | 与伪狂犬病病毒gB蛋白结合的单克隆抗体及其应用 | |
| CN115838421A (zh) | 靶向乙型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
| CN113801854B (zh) | 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用 | |
| CN102633878A (zh) | 一种甲型h1亚型流感病毒双抗体夹心elisa试剂盒及应用 | |
| CN115057925A (zh) | 一种抗赤羽病病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN111537736A (zh) | 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20231226 Address after: 518100, 8th Floor, Building 4, No. 128 Shangnan East Road, Huangpu Community, Xinqiao Street, Bao'an District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant after: HUACHENYANG (SHENZHEN) TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: Room 2150, Building 2, East Ring Road, Yanqingyuan, Zhongguancun, Yanqing District, Beijing 100000 Applicant before: Beijing Reyan Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |