CN106841611A

CN106841611A - 一种基于ibv串联抗原s‑m‑n的免疫磁性微球‑elisa检测ibv抗体的方法

Info

Publication number: CN106841611A
Application number: CN201710080119.8A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 杨鑫; 丁梦蝶; 雷昌伟; 张安云; 高文倩; 周泷
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明涉及一种检测禽传染性支气管炎病毒抗体的ELISA检测方法，该方法以IBV S–M–N片段串联蛋白为包被抗原、以氨基化二氧化硅磁性微球为固相支持物。包被抗原包含了IBV 3种主要结构蛋白（ S、M、N）的抗原表位，是一种多表位重组蛋白，通过在大肠杆菌中表达获得，避免了IBV鸡胚增殖、提纯的繁琐过程。该方法检测鸡血清中的IBV抗体，具有较好的特异性、重复性，可用于鸡群免疫状态的评估，也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

Description

一种基于IBV串联抗原S-M-N的免疫磁性微球-ELISA检测IBV 抗体的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，所检测的是鸡血清中IBV主要抗原蛋白的抗体，可用于鸡群免疫状态的评估，也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

背景技术

禽传染性支气管炎（Infectious Bronchitis, IB）是危害养禽业的重大传染病之一，是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒（Infectious BronchitisVirus, IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，可引起小鸡呼吸系统和肾脏损伤、产蛋鸡群产蛋量下降和蛋品质降低。疫苗免疫是防制本病的主要措施，进行血清抗体水平监测可以为鸡群免疫效果的评价、免疫程序的合理制定等提供依据，对于本病的防控具有重要意义。因IBV没有血凝性，且用C型魏氏梭菌等处理病毒后建立的HI检测方法不稳定，因此没有广泛用于IBV抗体检测。ELISA是一种敏感、快速、操作简便的抗体检测方法，通常采用全病毒作为包被抗原。全病毒ELISA方法在理论上能够检测针对该病毒所有抗原蛋白的抗体，能够较全面地反映血清中IBV抗原蛋白的抗体水平。然而，全病毒ELISA方法需要在鸡胚中增殖获得IBV，过程繁琐，病毒的纯化操作困难，最外层的纤突蛋白容易掉落，且存在病毒灭活不彻底的生物安全隐患。目前有进口的IDEXX ELISA试剂盒用于IBV抗体检测，但该试剂盒价格高，在生产上未得到广泛应用。全病毒制备困难、成本高的一个解决方法是用重组多表位蛋白作为替代。多个抗原或抗原表位的联合是具有潜力的检测抗原，且通过外源表达的方式使得制备简单，近年来已有多项以多表位串联蛋白用作ELISA包被抗原的研究。常规ELISA方法通常以酶标板作为固相支持物。磁性微球作为一种新型固相支持物，相比于平坦的固相载体，具有比表面积大、偶联容量高的特点，以磁性微球为固相支持物的免疫学检测技术具有敏感性高、检测时间短的优点。

发明内容

本发明涉及一种检测禽传染性支气管炎病毒抗体的检测方法，是以IBV S–M–N片段串联蛋白为包被抗原、磁性微球为固相支持物建立的免疫磁性微球–ELISA检测IBV抗体的方法，检测的是鸡血清中的IBV抗体，可用于鸡群免疫状态的评估，也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的IBV S–M–N片段串联基因的组成图；

图2是本发明实施例2提供的氨基化二氧化硅磁性微球的TEM表征图；

图3是本发明实施例2提供的ELISA操作流程图。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。其中，IBVM41毒株购自中国兽医药品监察所，由本实验室保存。大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞购自大连宝生物工程公司。pET32a(+)由生科院白林含老师实验室惠赠。IBV阳性血清购自中国兽医药品监察所。标准阴性血清采自SPF鸡。待检鸡血清样品采集自免疫鸡群。新城疫病毒、禽流感病毒（H9亚型）和传染性法氏囊病病毒的阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1. IBV S–M–N片段串联抗原的制备

根据文献报道的IBV S、M、N蛋白的抗原表位鉴定情况，结合2种在线预测软件对IBV B细胞表位的预测结果，在综合分析抗原表位的分布情况后选出了8个抗原片段。它们的氨基酸位置分别是：S1蛋白166–247、501–515；S2蛋白8–30；M蛋白181–210；N蛋白6–88、118–133、218–264、304–385。将8个抗原片段以柔性氨基酸间隔、按顺序进行串联，构建S–M–N片段串联基因（基因组成示意图见图1），并连接至pET32a(+)后构建了重组表达载体，随后在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达并纯化，大小约61.5kDa，并伴随一个截短蛋白产物，都能和IBV阳性血清反应。

2. IBV ELISA抗体检测方法的建立

2.1 免疫磁性微球的制备

利用反相微乳液法制备了氨基化二氧化硅磁性微球，粒径约50–70nm，分散性较好、均一性良好（图2）。将IBV S–M–N片段串联抗原在室温条件下偶联至磁性微球表面制成免疫磁性微球溶液，偶联缓冲液为0.01M磷酸盐缓冲液（pH 6.5），偶联时间为3h。

2.2 ELISA条件确定

按照常规ELISA的操作步骤建立基于免疫磁性微球的ELISA检测IBV抗体的方法，并对各项反应条件进行了优化，确定免疫磁性微球溶液用量为80μL，血清稀释倍数为1:500，HRP标记的驴抗鸡抗体稀释倍数为1:5000，血清作用时间和二抗孵育时间均为30min。阴阳性血清的临界值确定为0.302。

2.3 ELISA操作步骤

ELISA具体操作步骤（图3）：⑴ 将80μL免疫磁性微球溶液和100μL经抗体稀释液稀释的待检血清混合，37℃振荡孵育30min；⑵ 磁性分离2min，弃上清；PBST洗涤3次；⑶ 加入100μL经抗体稀释液稀释的HRP标记的驴抗鸡IgY（IgG），37℃振荡孵育30min；

⑷ 磁性分离2min，弃上清；PBST洗涤3次；⑸ 加入100μL TMB底物溶液，避光显色5–10min；⑹ 加入50μL终止液（2M H₂SO4）终止反应；⑺ 磁性分离2min，吸取上清100μL转移到酶标板中，在酶标仪上测定各孔的OD₄₅₀值。

2.4 特异性试验

分别对新城疫病毒、禽流感病毒（H9）和鸡传染性法氏囊病毒的阳性血清进行检测，结果均为阴性，具有较好的特异性（表1）。

表1 特异性试验结果

2.5 重复性试验

分别选取5份血清进行批内重复性试验和批间重复性试验，每份进行4个重复。结果表明批内变异系数范围为3.08%–7.17%（表2），批间变异系数范围为5.23%–10.09%（表3），具有较好的重复性。

表2 批内重复性试验结果

表3 批间重复性试验结果

。

Claims

1.一种基于IBV S–M–N片段串联抗原的免疫磁性微球–ELISA检测IBV抗体的方法，其特征在于：构建一种包含了IBV S、M、N片段的串联抗原，并偶联至氨基化二氧化硅磁性微球表面制成免疫磁性微球，建立了以IBV S–M–N片段串联蛋白为包被抗原、磁性微球为固相支持物的ELISA检测IBV抗体的方法。

2.根据权利要求1所述的一种基于IBV S–M–N片段串联抗原的免疫磁性微球–ELISA检测IBV抗体的方法，其特征在于：所述抗原由IBV 3种主要结构蛋白（S、M、N）的抗原片段串联组成；所述磁性微球为氨基化二氧化硅磁性微球；所检测的是鸡血清中的IBV抗体，可用于鸡群免疫状态的评估，也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

3.根据权利要求1所述，IBV S–M–N片段串联蛋白的大小约61.5kDa；所述氨基化二氧化硅磁性微球粒径约50–70nm；所述免疫磁性微球–ELISA检测IBV抗体的方法特异性较好，对新城疫病毒、禽流感病毒（H9）和鸡传染性法氏囊病毒的阳性血清的检测结果均为阴性；批内、批间变异系数分别为3.08%–7.17%、5.23%–10.09%，重复性较好。