CN106841611A - 一种基于ibv串联抗原s‑m‑n的免疫磁性微球‑elisa检测ibv抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测禽传染性支气管炎病毒抗体的ELISA检测方法,该方法以IBV S–M–N片段串联蛋白为包被抗原、以氨基化二氧化硅磁性微球为固相支持物。包被抗原包含了IBV 3种主要结构蛋白( S、M、N)的抗原表位,是一种多表位重组蛋白,通过在大肠杆菌中表达获得,避免了IBV鸡胚增殖、提纯的繁琐过程。该方法检测鸡血清中的IBV抗体,具有较好的特异性、重复性,可用于鸡群免疫状态的评估,也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

Description

一种基于IBV串联抗原S-M-N的免疫磁性微球-ELISA检测IBV 抗体的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域,所检测的是鸡血清中IBV主要抗原蛋白的抗体,可 用于鸡群免疫状态的评估,也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。

背景技术

[0002] 禽传染性支气管炎(Infectious Bronchitis, IB)是危害养禽业的重大传染病之 一,是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,可引起小鸡呼吸系统和肾脏损伤、产蛋 鸡群产蛋量下降和蛋品质降低。疫苗免疫是防制本病的主要措施,进行血清抗体水平监测 可以为鸡群免疫效果的评价、免疫程序的合理制定等提供依据,对于本病的防控具有重要 意义。因IBV没有血凝性,且用C型魏氏梭菌等处理病毒后建立的HI检测方法不稳定,因此没 有广泛用于IBV抗体检测。ELISA是一种敏感、快速、操作简便的抗体检测方法,通常采用全 病毒作为包被抗原。全病毒ELISA方法在理论上能够检测针对该病毒所有抗原蛋白的抗体, 能够较全面地反映血清中IBV抗原蛋白的抗体水平。然而,全病毒ELISA方法需要在鸡胚中 增殖获得IBV,过程繁琐,病毒的纯化操作困难,最外层的纤突蛋白容易掉落,且存在病毒灭 活不彻底的生物安全隐患。目前有进口的IDEXX ELISA试剂盒用于IBV抗体检测,但该试剂 盒价格高,在生产上未得到广泛应用。全病毒制备困难、成本高的一个解决方法是用重组多 表位蛋白作为替代。多个抗原或抗原表位的联合是具有潜力的检测抗原,且通过外源表达 的方式使得制备简单,近年来已有多项以多表位串联蛋白用作ELISA包被抗原的研究。常规 ELISA方法通常以酶标板作为固相支持物。磁性微球作为一种新型固相支持物,相比于平坦 的固相载体,具有比表面积大、偶联容量高的特点,以磁性微球为固相支持物的免疫学检测 技术具有敏感性高、检测时间短的优点。

发明内容

[0003] 本发明涉及一种检测禽传染性支气管炎病毒抗体的检测方法,是以IBV S-M-N片 段串联蛋白为包被抗原、磁性微球为固相支持物建立的免疫磁性微球-ELISA检测IBV抗体 的方法,检测的是鸡血清中的IBV抗体,可用于鸡群免疫状态的评估,也可以用于鸡群IBV感 染风险的评估。

附图说明

[0004] 图1是本发明实施例1提供的IBV S-M-N片段串联基因的组成图; 图2是本发明实施例2提供的氨基化二氧化硅磁性微球的TEM表征图; 图3是本发明实施例2提供的ELISA操作流程图。

具体实施方式

[0005] 以下实施例仅用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。其中,IBV M41毒株购自中国兽医药品监察所,由本实验室保存。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自 大连宝生物工程公司。pET32a(+)由生科院白林含老师实验室惠赠。IBV阳性血清购自中国 兽医药品监察所。标准阴性血清采自SPF鸡。待检鸡血清样品采集自免疫鸡群。新城疫病毒、 禽流感病毒(H9亚型)和传染性法氏囊病病毒的阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公 司。

[0006] I. IBV S-M-N片段串联抗原的制备 根据文献报道的IBV S、M、N蛋白的抗原表位鉴定情况,结合2种在线预测软件对IBV B 细胞表位的预测结果,在综合分析抗原表位的分布情况后选出了 8个抗原片段。它们的氨基 酸位置分别是:Sl 蛋白 166-247、501-515; S2 蛋白 8-30 ;M蛋白 181-210;N蛋白 6-88、118-133、 218-264、304-385。将8个抗原片段以柔性氨基酸间隔、按顺序进行串联,构建S-M-N片段串 联基因(基因组成示意图见图1),并连接至pET32a⑴后构建了重组表达载体,随后在大肠 杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达并纯化,大小约61.5kDa,并伴随一个截短蛋白产物,都能和 IBV阳性血清反应。

[0007] 2. IBV ELISA抗体检测方法的建立 2.1免疫磁性微球的制备 利用反相微乳液法制备了氨基化二氧化硅磁性微球,粒径约50_70nm,分散性较好、均 一性良好(图2)。将IBV S-M-N片段串联抗原在室温条件下偶联至磁性微球表面制成免疫磁 性微球溶液,偶联缓冲液为0. OlM磷酸盐缓冲液(pH 6.5),偶联时间为3h。

[0008] 2.2 ELISA条件确定 按照常规ELISA的操作步骤建立基于免疫磁性微球的ELISA检测IBV抗体的方法,并对 各项反应条件进行了优化,确定免疫磁性微球溶液用量为80yL,血清稀释倍数为1:500,HRP 标记的驴抗鸡抗体稀释倍数为1:5000,血清作用时间和二抗孵育时间均为30!^11。阴阳性血 清的临界值确定为0.302。

[0009] 2.3 ELISA操作步骤 ELISA具体操作步骤(图3):⑴将80yL免疫磁性微球溶液和IOOyL经抗体稀释液稀释的 待检血清混合,37 °C振荡孵育30min;⑵磁性分离2min,弃上清;PBST洗涤3次;⑶加入100μ L经抗体稀释液稀释的HRP标记的驴抗鸡IgY(IgG),37°C振荡孵育30min; ⑷磁性分离2min,弃上清;PBST洗涤3次;(5)加入IOOyL TMB底物溶液,避光显色5-IOmin; (6)加入50yL终止液(2M H2S(M)终止反应;(7)磁性分离2min,吸取上清IOOyL转移到 酶标板中,在酶标仪上测定各孔的OD450值。

[0010] 2.4特异性试验 分别对新城疫病毒、禽流感病毒(H9)和鸡传染性法氏囊病毒的阳性血清进行检测,结 果均为阴性,具有较好的特异性(表1)。

[0011] 表1特异性试验结果

Figure CN106841611AD00051

2.5重复性试验 分别选取5份血清进行批内重复性试验和批间重复性试验,每份进行4个重复。结果表 明批内变异系数范围为3.08%-7.17%(表2),批间变异系数范围为5.23%-10.09% (表3),具有 较好的重复性。

[0012] 表2批内重复性试验结果

Figure CN106841611AD00052

表3批间重复性试验结果

Figure CN106841611AD00053

Claims (3)

1. 一种基于IBV S-M-N片段串联抗原的免疫磁性微球-ELISA检测IBV抗体的方法,其特征在于:构建一种包含了IBV S、M、N片段的串联抗原,并偶联至氨基化二氧化硅磁性微球表面制成免疫磁性微球,建立了以IBV S-M-N片段串联蛋白为包被抗原、磁性微球为固相支持物的ELI SA检测IBV抗体的方法。
2. 根据权利要求1所述的一种基于IBV S-M-N片段串联抗原的免疫磁性微球-ELISA检测IBV抗体的方法,其特征在于:所述抗原由IBV 3种主要结构蛋白(S、M、N)的抗原片段串联组成;所述磁性微球为氨基化二氧化硅磁性微球;所检测的是鸡血清中的IBV抗体,可用于鸡群免疫状态的评估,也可以用于鸡群IBV感染风险的评估。
3. 根据权利要求1所述,IBV S-M-N片段串联蛋白的大小约61.5kDa;所述氨基化二氧化硅磁性微球粒径约50-70nm;所述免疫磁性微球-ELISA检测IBV抗体的方法特异性较好,对新城疫病毒、禽流感病毒(H9)和鸡传染性法氏囊病毒的阳性血清的检测结果均为阴性;批内、批间变异系数分别为3.08%-7.17%、5.23%-10.09%,重复性较好。
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