CN103837523B - 一种检测乙酰甲胺磷的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种检测样品中痕量乙酰甲胺磷的检测新方法，并提供了试剂盒。利用多巴胺氧化聚合法，在载体材料上合成可特异性结合乙酰甲胺磷的人工抗体（分子印迹聚合物，MIP），用MIP特异性分离富集不同样品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制‑化学发光法测定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP对温度、有机溶剂耐受性高，可直接特异性分离富集不同样品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有机磷农药、叶绿素等多种干扰物的影响。通过将MIP特异性样品预处理与酶抑制法有机结合，MIP‑酶抑制法不仅可利用酶抑制法特异性快速检测某种农药，还可提高检测灵敏度和特异性，可直接、快速、灵敏、高通量地检测环境和食品中的痕量靶农药。
Description
技术领域
本发明属于分子印迹技术和农药残留快速检测技术领域，具体涉及一种乙酰甲胺磷人工抗体（MIP）的制备，以及将MIP与酶抑制-化学发光法有机结合，所建立的集特异性样品预处理和酶抑制-化学发光法检测于一体，可特异、快速、灵敏、高通量地检测样品中痕量乙酰甲胺磷的新方法:MIP-酶抑制法，并提供相应的检测试剂盒。
技术背景
有机磷农药是我国目前使用量最大的一类农药，自从2007年1月1日我国全面禁用甲胺磷等5种中高毒有机磷农药以来，乙酰甲胺磷因其低毒、安全、广谱、持效期长、大田应用效果好等优势，作为甲胺磷的替代农药，广泛应用于农业生产实践中。但是乙酰甲胺磷在环境中仍然有残留风险（我国规定，乙酰甲胺磷在蔬菜中的最大残留限量为1mg/kg），人们在食用残留有乙酰甲胺磷的农产品和食品后，会在体内蓄积，甚至发生急性中毒，危害人体健康和生命安全。因此，如何快速检测出环境中乙酰甲胺磷的残留量，对保证食品安全、保障人群健康具有重要意义。
目前乙酰甲胺磷的检测方法主要有色谱法（气相或液相色谱）、质谱法、ELISA法、酶抑制法等。色谱及质谱法灵敏度高，可区分具体的农药种类，但费用相对昂贵，样品前处理过程复杂，需要昂贵的仪器设备，无法用于现场检测。ELISA法灵敏度高、特异性强，但小分子农药的抗体制备难度较大，且抗体稳定性差，对热、pH、盐浓度等有严格要求，多用于检测血样中的有机磷农药；食品和环境样品需要经过预处理，去除干扰物后，才能保证ELISA检测的灵敏度和特异性，不宜用于现场直接快速检测。酶抑制法快速，操作简便，目前广泛用于现场检测；但特异性差，样品中的叶绿素等物质对检测的干扰很大，仅能判断样品中是否含有可抑制胆碱酯酶的有机磷或氨基甲酸酯农药，不能判断出具体的农药品种及各种农药的量。
为提高酶抑制法的灵敏度，耦合酶促反应的化学发光法（简称为酶抑制-化学发光法）通过化学发光法测定酶抑制水平，可有效提高酶抑制法的灵敏度。具有灵敏度高、检测限低的优点（M.Guardigli et al.Chemiluminescent high-throughput microassay forevaluation of acetylcholinesterase inhibitors.Analytica Chimica Acta.2005,535,139-144）。但本方法同样具有酶抑制法缺乏特异性、抗干扰能力差、往往只能定性测定样品中是否存在有机磷农药或氨基甲酸酯农药，无法确定某种农药的含量等缺点。
针对酶抑制-化学发光法缺乏特异性、抗干扰能力差等缺点，若能采用特异性样品预处理方法，首先特异性富集某种农药（如乙酰甲胺磷）同时去除干扰物，然后用酶抑制-化学发光法快速检测所富集的靶农药，则可快速灵敏地测定样品中某种特定的农药种类和含量。人工抗体（MIP）因具有特异识别能力、耐受性好等特点，在化学分析等许多领域已得到广泛应用。Shen等以MAA作为功能单体、EGDMA为交联剂、AIBN为引发剂，合成了甲胺磷、乙酰甲胺磷的MIP，结果表明，MIP对相应的模板分子有很强的特异性识别和吸附能力（Zhong-Lan shen et al.Study on the Binding Characteristic of Methamidophos-specificMolecularly Imprinted Polymer and the Interactions between Template andMonomers.Journal of the Chinese Chemical Society.2008,55,587-593）。Wei等以乙酰甲胺磷为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，在SPR传感芯片上合成了超薄的MIP膜，结果表明，含MIP的SPR芯片可准确检测出两种样品中的乙酰甲胺磷浓度，回收率为96.6-98%（C.Wei et al.Ultrasensitively sensing acephate using molecular imprintingtechniques on a surface plasmon resonance sensor.Talanta.2011,83,1422–1427）。可见，MIP技术在乙酰甲胺磷检测的样品预处理和快速检测上有很好的应用前景，但上述研究中的MIP仅限应用于固相萃取，或检测需要复杂的仪器（如SPR仪），尚无将MIP和酶抑制法有机结合，快速测定某种靶农药的报道。
如果将MIP与酶抑制-化学发光法联合使用，利用MIP的特异性吸附能力，在特异高效地富集样品中的痕量乙酰甲胺磷的同时去除干扰物，然后利用酶抑制-化学发光法快速灵敏地测定所富集的乙酰甲胺磷，实现利用简单的酶抑制法灵敏、特异、快速地测定某种特定农药（如乙酰甲胺磷）含量之目的，特异性样品预处理还可提高酶抑制-化学发光检测的灵敏度和准确性。目前尚无集样品预处理和酶抑制法于一体的方法报道，也无酶抑制法可特异性检测某种农药的报道。因此，将MIP与酶抑制-化学发光法结合，建立一种集特异性样品预处理和酶抑制-化学发光检测于一体的快速检测方法，不仅可快速准确检测乙酰甲胺磷，也有望用于其它有机磷或氨基甲酸酯农药的快速检测上，在环境、农业、食品等学科中将有很大的应用前景。
发明内容
为克服传统酶抑制法缺乏特异性、抗干扰能力低、稳定性较差等技术问题，本发明提供一种检测乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，可特异、快速、灵敏、高通量地检测蔬菜和环境样品中的痕量乙酰甲胺磷。
本发明公开一种可特异性检测乙酰甲胺磷的MIP-酶抑制法，其特征在于以多巴胺为功能单体制备的乙酰甲胺磷MIP可特异性分离富集样品中痕量乙酰甲胺磷，并建立了相应的MIP-酶抑制法试剂盒。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的采用多巴胺氧化聚合法在载体材料上合成可特异性结合乙酰甲胺磷的人工抗体（MIP）的方法，包括以下步骤：
步骤一：聚合反应：
（a）将模板分子乙酰甲胺磷与多巴胺按摩尔比为1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL缓冲溶液中，混匀的混合液；
（b）加入载体材料，
（c）聚合：室温下暴露于空气中48-72h进行聚合；
空白印迹聚合物（NIP）的合成方法与MIP的合成方法相似，只是在合成过程中不加模板分子；
步骤二：洗脱模板分子：使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反复震荡洗涤载体材料，再得到含MIP的载体材料。即制备得到可特异性结合乙酰甲胺磷的人工抗体（MIP）。
上述方法中所述的载体材料是多孔酶标板、滤膜、纳米级微球或微米级微球。所述的滤膜如是硝酸纤维滤膜、醋酸纤维滤膜或滤纸。所述的微球是四氧化三铁磁性微球或二氧化硅微球；
在所述的载体材料是多孔酶标板时，在步骤一之步骤（b）中，所述的加入载体材料的具体方法是：将混合液加入到多孔酶标板的孔中；在步骤二中，所述的使用10%冰乙酸的水溶液和三蒸水反复震荡洗涤载体材料的具体方法是：使用10%冰乙酸的水溶液反复震荡洗涤多孔酶标板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震荡洗涤7-14次，每次30-50min，即得到含MIP的酶标板。
本发明提供的检测乙酰甲胺磷的试剂盒含有权利要求6所述的可特异性结合乙酰甲胺磷的人工抗体（MIP）。该试剂盒具体可由含MIP的载体材料、乙酰甲胺磷标准溶液（0-200ng/mL）、胆碱酯酶AChE（500mU/mL）、乙酰胆碱ATCI（20μmol/mL）、胆碱氧化酶ChOX（1mg/mL）、辣根过氧化物酶HRP（15U/mL）、鲁米诺Luminol（1μmol/mL）组成，所述的含MIP的载体材料按本发明所述的方法制得。
对本发明所制备的MIP的性能评价，以96孔酶标板为例：
1、形态评价：扫描电镜分析显示酶标板上合成的MIP为均一的高分子膜状物，厚度为150-750nm，红外光谱检测显示MIP在3100，1600，1000，880和650厘米-1处具有5个明显的红外吸收峰，与多巴胺的特征峰一致，证明在96孔酶标板孔内制备了含多巴胺分子的MIP。
2、静态吸附试验评价MIP吸附容量：准确吸取300μL乙酰甲胺磷标准品水溶液（0.50-100ng/mL），分别加入到MIP、NIP和空白孔中，25℃室温下在振荡器中振荡10min后在37℃恒温条件下吸附1-6h，用LC-MS测定上清中乙酰甲胺磷的浓度Free(ng/mL)，根据结合前后上清液中乙酰甲胺磷浓度的变化计算每cm2的乙酰甲胺磷结合量Bond（ng/cm2）。以[Bound]/[Free]为纵坐标，[Bound]为横坐标建立Scatchard曲线，以Scatchard曲线的斜率为平衡解离常数Kd，以公式：[Bound]/[Free]=-([Bound]/Kd)+(Bmax/Kd)，计算最大吸附容量Bmax。本发明所制备的MIP的Kd=8.26ng/mL，Bmax=2.07ng/cm2，而阴性对照（NIP）的Kd=27.78ng/mL，Bmax=1.00ng/cm2。
3、静态吸附试验评价MIP吸附特异性：采用IPB（imprinting-induced promotionof binding）值来评价MIP的选择性：IPB=(Cmip-Cnip)/Cnip×100%。其中，Cmip为与MIP结合的乙酰甲胺磷的量，Cnip为与NIP结合的乙酰甲胺磷的量，得到MIP的IPB值为1.24-1.93。
本发明公开了所述MIP-酶抑制法试剂盒的构成和使用方法：试剂盒由含MIP的载体材料（酶标板、滤膜、微球等）、乙酰甲胺磷标准溶液（0-200ng/mL）、胆碱酯酶AChE（500mU/mL）、乙酰胆碱ATCI（20μmol/mL）、胆碱氧化酶ChOX（1mg/mL）、辣根过氧化物酶HRP（15U/mL）、鲁米诺Luminol（1μmol/mL）构成。使用方法包括以下步骤（以96孔酶标板为例）：
步骤一：向所得含MIP的酶标板孔内加入300μL乙酰甲胺磷标准溶液或样品，37℃作用1-6h后用纯水洗涤2-3次。
步骤二：每孔加入120μL三蒸水和10-20μL胆碱酯酶（AChE）（500mU/mL），37℃孵育10-20min。
步骤三：每孔加入105μL含0.1μmol/mL鲁米诺（luminol），0.5mg/mL胆碱氧化酶（ChOX）和10U/mL辣根过氧化物酶（HRP）的混合液。
步骤四：检测前每孔加入10-20μL乙酰胆碱（ATCI）（20μmol/mL），立即用酶标仪检测5min内的累积发光值变化，读数间隔为10s。
步骤五：确定乙酰甲胺磷浓度。以乙酰甲胺磷对胆碱酯酶的抑制率为纵坐标，乙酰甲胺磷浓度为横坐标建立标准曲线，其中抑制率=（RLU0-RLU）/RLU0×100%（RLU0：乙酰甲胺磷浓度为0时的发光值；RLU：不同乙酰甲胺磷浓度下的发光值）。通过测定发光值计算出乙酰甲胺磷的抑制率，根据抑制率与乙酰甲胺磷浓度之间的线性关系，即可确定乙酰甲胺磷的浓度。
另一方面，本发明还公开了一种特异、快速的乙酰甲胺磷检测方法，以及所述MIP-酶抑制法检测样品中痕量乙酰甲胺磷方面的用途。检测方法包括下列步骤：
（1）环境样品或蔬菜样品的制备；
（2）权利要求1所述MIP-酶抑制试剂盒结合酶标仪检测上述样品溶液；
（3）获得乙酰甲胺磷含量。
本发明建立了一种集特异性样品预处理和酶抑制-化学发光检测于一体，可利用酶抑制法直接检测样品中痕量乙酰甲胺磷的检测新方法：人工抗体-酶抑制法（MIP-酶抑制法），并提供相应的试剂盒。MIP-酶抑制法利用多巴胺氧化聚合法，在不同载体材料（如多孔酶标板、滤膜（如硝酸纤维滤膜、醋酸纤维滤膜、滤纸等）、纳米或微米级微球（如四氧化三铁磁性微球、二氧化硅微球等）上合成可特异性结合乙酰甲胺磷的人工抗体（又称分子印迹聚合物，MIP），用MIP特异性分离富集不同样品中的痕量乙酰甲胺磷后，利用酶抑制-化学发光法测定所富集的乙酰甲胺磷含量。MIP对温度、有机溶剂耐受性高，可直接特异性分离富集不同样品中的痕量乙酰甲胺磷，去除其他有机磷农药、叶绿素等多种干扰物的影响。通过将MIP特异性样品预处理与酶抑制法有机结合，MIP-酶抑制法不仅可利用酶抑制法特异性快速检测某种农药，还可提高检测灵敏度和特异性，可直接、快速、灵敏、高通量地检测环境和食品中的痕量靶农药。MIP-酶抑制法试剂盒由含MIP的载体材料（如96孔酶标板、滤膜、微球等）、乙酰甲胺磷标准溶液、胆碱酯酶（AChE）、乙酰胆碱（ATCI）、胆碱氧化酶（ChOX）、辣根过氧化物酶（HRP）、鲁米诺（Luminol）构成。试剂盒对环境和食品中乙酰甲胺磷的检测灵敏度为1-2.5ng/mL，日内偏差为7.10-16.81%，日间偏差为3.98-7.42%，批次间偏差为4.04-7.25%，可特异、灵敏、高通量地测定环境和食品中的乙酰甲胺磷。
本发明中用于检测乙酰甲胺磷的酶抑制-化学发光法，其原理为：胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱，胆碱被胆碱氧化酶氧化生成甜菜碱和H2O2，后者在辣根过氧化物酶的作用下作为与鲁米诺反应产生光子，而有机磷农药对胆碱酯酶有抑制作用，以致乙酰胆碱无法被水解生成胆碱，连锁反应被封闭，化学发光值相应降低，发光值的降低与乙酰甲胺磷在一定浓度范围内呈线性关系，根据发光值的抑制率变化即可测定样品中乙酰甲胺磷的含量。
众所周知，酶抑制法具有简单、检测快速、灵敏等特点，但是因为特异性差和抗干扰能力差而无法准确测定某种农药含量。本发明所制备的人工抗体（MIP）在制备的过程中能形成与乙酰甲胺磷大小和形状相匹配的立体空腔，并具有特定的非共价结合键，能在室温下特异性地结合乙酰甲胺磷，因而可快速且特异地分离和富集各种样品中的乙酰甲胺磷。利用MIP的仿生识别能力，建立MIP-酶抑制法，MIP特异性分离富集不同样品中的痕量乙酰甲胺磷后，使用酶抑制-化学发光法测定所富集的乙酰甲胺磷。MIP可有效去除样品中的杂质，保证酶抑制-化学发光可特异、灵敏、准确地测定乙酰甲胺磷。MIP-酶抑制法集选择性样品预处理和灵敏快速的酶抑制-化学发光检测于一体，可直接检测不同样品中痕量乙酰甲胺磷，特异、灵敏、快速、稳定，特别适合用于现场快速测定复杂样品如食品和环境样品中痕量乙酰甲胺磷，在痕量农药的检测中具有十分广泛的应用价值。
附图说明
载体材料以96孔酶标板为例。
图1为本发明制备的MIP和空白对照。左侧（A1-H6）为未经任何处理的孔（空白对照），右侧（A7-H12）为MIP的孔。显示MIP的孔内有棕黑色的MIP膜。
图2为本发明制备的MIP的扫描电镜图。图2a为空白，图2b为MIP，图2c为NIP（阴性对照）。与空白相比，所制得的MIP和NIP均为高分子膜状物，且MIP较NIP分布均一。
图3a为空白酶标板的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）图谱，图3b为本发明制备的MIP的FT-IR图谱，其纵坐标为吸光度，横坐标为波数（厘米-1）。FT-IR证实了酶标板表面确实是含多巴胺分子的MIP（图3b）。与空白相比，MIP和NIP在3100，1600，1000，880和650厘米-1处具有5个明显的红外吸收峰，分别代表C-H的伸缩振动，芳烃的骨架振动，N-H的面外弯曲振动，C-H的面外弯曲振动以及O-H的面外弯曲振动，与多巴胺的特征峰一致，证明本发明在96孔酶标板孔内制备了含多巴胺分子的MIP。
图4为MIP-酶抑制法检测乙酰甲胺磷的化学发光动力曲线图，纵坐标为不同乙酰甲胺磷浓度下（0-200ng/mL）的发光强度；横坐标为时间（时：分：秒）（HH：MM：SS）。其中，乙酰甲胺磷浓度从上往下，分别为：0，2.5，5，10，20，100，200ng/mL）。可看出，乙酰甲胺磷的浓度越高，得到的化学发光平衡值越低。说明乙酰胆碱对胆碱酯酶的抑制作用使酶促反应受到影响，因此检测到的化学发光值相应降低。通过测定发光值的降低，即可确定样品中含有的乙酰甲胺磷含量，从而定量测定乙酰甲胺磷。
图5为MIP-酶抑制法测定乙酰甲胺磷的标准曲线，图中：Y:利用发光平衡值计算出乙酰甲胺磷对胆碱酯酶的抑制率，抑制率=（RLU0-RLU）/RLU0*100（RLU：不同乙酰甲胺磷浓度下的发光值；RLU0：乙酰甲胺磷浓度为0时的发光值）；X：乙酰甲胺磷浓度（ng/mL）。纵坐标为不同浓度的乙酰甲胺磷对胆碱酯酶的抑制率；横坐标为标准品乙酰甲胺磷浓度。随着乙酰甲胺磷浓度的增加，其抑制率增加，抑制率与乙酰甲胺磷浓度在2.5～200ng/mL范围内存在较好的线性关系。通过测定发光值计算出乙酰甲胺磷的抑制率，即可定量测定样品中乙酰甲胺磷含量。
图6为本发明方法流程图，图中各物质为：
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
所有试剂均为市售。
实施例1：乙酰甲胺磷MIP的制备
乙酰甲胺磷MIP的制备是以多巴胺为功能单体，乙酰甲胺磷为模板分子，通过多巴胺氧化聚合反应及模板分子洗脱过程得到乙酰甲胺磷MIP。具体方法包括以下步骤：
步骤一：聚合反应：
a)将模板分子乙酰甲胺磷与多巴胺按摩尔比为1:10-50的比例溶于PH=7.6的Tris-HCL缓冲溶液中，混匀；
b)加入载体材料：微球、滤膜等载体材料直接加入混合液中，或将混合液加入酶标板的孔中。
c)聚合：室温下暴露于空气中48-72h进行聚合。
d)空白印迹聚合物（NIP）的合成方法与MIP的合成方法相似，只是在合成过程中不加模板分子。
步骤二：洗脱模板分子：使用10%冰乙酸的水溶液反复震荡洗涤酶标板7-14次，每次30-50min，再用三蒸水震荡洗涤7-14次，每次30-50min，即得到含MIP的酶标板。
MIP的性能评价，分别为（以96孔酶标板为例）：
形态评价：扫描电镜分析显示酶标板上合成的MIP为均一的高分子膜状物，厚度为150-750nm，红外光谱检测显示MIP在3100，1600，1000，880和650厘米-1处具有5个明显的红外吸收峰，与多巴胺的特征峰一致，证明本发明在96孔酶标板孔内制备了含多巴胺分子的MIP。
静态吸附试验评价MIP吸附容量：准确吸取300μL乙酰甲胺磷标准品水溶液（0.50-100ng/mL），分别加入到MIP、NIP和空白孔中，25℃室温下在振荡器中振荡10min后在37℃恒温条件下吸附1-6h，用LC-MS测定上清中乙酰甲胺磷的浓度Free(ng/mL)，根据结合前后上清液中乙酰甲胺磷浓度的变化计算每cm2的乙酰甲胺磷结合量Bond（ng/cm2）。以[Bound]/[Free]为纵坐标，[Bound]为横坐标建立Scatchard曲线，以Scatchard曲线的斜率为平衡解离常数Kd，以公式：[Bound]/[Free]=-([Bound]/Kd)+(Bmax/Kd)，计算最大吸附容量Bmax。本发明所制备的MIP的Kd=8.26ng/mL，Bmax=2.07ng/cm2，而阴性对照（NIP）的Kd=27.78ng/mL，Bmax=1.00ng/cm2。
静态吸附试验评价MIP吸附特异性：采用IPB（imprinting-induced promotion ofbinding）值来评价MIP的选择性：IPB=(Cmip-Cnip)/Cnip×100%。其中，Cmip为与MIP结合的乙酰甲胺磷的量，Cnip为与NIP结合的乙酰甲胺磷的量，得到MIP的IPB值为1.24-1.93。
实施例2：MIP-酶抑制法试剂盒的灵敏度分析（载体材料以96孔酶标板为例）
向含MIP的酶标板孔中加入300μL系列浓度梯度的乙酰甲胺磷标准品水溶液（0，2.5，5，25，50，100，200ng/mL），37℃作用1-6h后用纯水洗涤2-3次，然后向每孔加入120μL三蒸水和10-20μL胆碱酯酶（AChE）（500mU/mL），37℃孵育10-20min后每孔加入105μL含0.1μmol/mL鲁米诺（luminol），0.5mg/mL胆碱氧化酶（ChOX）和10U/mL辣根过氧化物酶（HRP）的混合液，检测前每孔加入乙酰胆碱（ATCI）10-20μL（20μmol/mL），立即用多功能酶标仪检测测定5min内的累积发光值变化，读数间隔为10s，5min内发光值达到平衡，利用化学发光强度平衡值得出的抑制率与乙酰甲胺磷浓度在2.5ng/mL～200ng/mL范围内存线性关系，检测灵敏度为1-2.5ng/mL，说明利用本发明制备的试剂盒能方便地用于测定乙酰甲胺磷的含量，有望直接用于食品、环境和生物等实际样品中低浓度乙酰甲胺磷含量的检测分析。
实施例3：MIP-酶抑制法试剂盒的特异性分析（载体材料以96孔酶标板为例）
（1）向含MIP的酶标板孔中分别加入300μL敌百虫、乐果、草铵膦（标准品水溶液（0，2.5，5，25，50，100，200ng/mL），不同浓度类似物的发光值基本与浓度为0ng/mL时的发光值一致，按照实施例2中的方法，利用化学发光强度平衡值得出的抑制率与敌百虫、乐果、草铵膦浓度无线性关系。说明本发明所制备的试剂盒不能结合敌百虫、乐果、草铵膦，只能特异性结合乙酰甲胺磷，可方便准确地用于环境中乙酰甲胺磷的检测。
（2）将乙酰甲胺磷和敌百虫、草铵膦标准品水溶液按比例混合，使混合液中乙酰甲胺磷的浓度为1，10，100ng/mL，敌百虫的浓度50，100，200ng/mL，草铵膦的浓度为50，100，200ng/mL，用LC-MS检测上清中混合物的浓度，计算吸附率，结果表明，乙酰甲胺磷、敌百虫、草铵膦的吸附率分别为：60.11%、11.87%、8.54%；用MIP-酶抑制法测定混合液中乙酰甲胺磷的含量，其中乙酰甲胺磷的回收率为89.09～120.23%，说明本法能特异性地结合乙酰甲胺磷，可方便准确地用于环境中乙酰甲胺磷的检测。
实施例4：MIP-酶抑制法试剂盒的稳定性分析（载体材料以96孔酶标板为例）
（1）方法稳定性。将蔬菜样品可食用部分剪碎，加入一定量的超纯水超声提取样品中的乙酰甲胺磷，将提取液过滤后用MIP-酶抑制法测定样品提取液中的乙酰甲胺磷含量，其中乙酰甲胺磷的加标回收率在80.73%～126.48%，日内偏差为7.10-16.81%（n=6），日间偏差为3.98-7.42%（n=5），说明本方法具有较好的稳定性。
（2）试剂盒批次间稳定性。将蔬菜样品可食用部分剪碎，加入一定量的超纯水超声提取样品中的乙酰甲胺磷，将提取液过滤后用不同批次的MIP-酶抑制法试剂盒测定样品提取液中的乙酰甲胺磷含量，其中乙酰甲胺磷的加标回收率在78.81～119.24%，批次间偏差为4.04-7.25%（n=6），说明本试剂盒具有较好的稳定性。
实施例5：利用MIP-酶抑制法试剂盒测定韭菜样品中的乙酰甲胺磷含量（载体材料以96孔酶标板为例）
将韭菜样品可食用部分剪碎，加入一定量的超纯水超声提取样品中的乙酰甲胺磷，将提取液过滤后，用MIP-酶抑制法测定样品提取液中乙酰甲胺磷的加标量（加标浓度为10ng/mL、100ng/mL），检测结果为12.03±1.73ng/mL和106.41±9.71ng/mL，与LC-MS测定结果12.49±0.35ng/mL和108.08±11.52ng/mL相当，说明利用本方法可准确测定韭菜样品中的乙酰甲胺磷含量；对加标量为1ng/mL的样品，可通过三次加样富集再检测，检测结果为1.49±0.14ng/mL，与LC-MS测定结果0.99±0.04ng/mL相当，说明利用本方法可对低浓度样品先进行富集后再检测。
实施例6：利用MIP-酶抑制法试剂盒测定小白菜样品中的乙酰甲胺磷含量（载体材料以96孔酶标板为例）
将小白菜样品可食用部分剪碎，加入一定量的超纯水超声提取样品中的乙酰甲胺磷，将提取液过滤后，用MIP-酶抑制法测定样品提取液中乙酰甲胺磷的加标量（加标浓度为10ng/mL、100ng/mL），检测结果为8.34±1.10ng/mL和87.48±7.08ng/mL，与LC-MS测定结果8.34±0.36ng/mL和81.42±4.78ng/mL相当，说明利用本方法可准确测定小白菜样品中的乙酰甲胺磷含量；对加标量为1ng/mL的样品，可通过三次加样富集再检测，检测结果为1.33±0.08ng/mL，与LC-MS测定结果1.12±0.10ng/mL相当，说明利用本方法可对低浓度样品先进行富集后再检测。
实施例7：利用MIP-酶抑制法试剂盒测定花菜样品中的乙酰甲胺磷含量（载体材料以96孔酶标板为例）
将花菜样品可食用部分剪碎，加入一定量的超纯水超声提取样品中的乙酰甲胺磷，将提取液过滤后，用MIP-酶抑制法测定样品提取液中乙酰甲胺磷的加标量（加标浓度为10ng/mL、100ng/mL），检测结果为13.09±0.61ng/mL和103.09±12.02ng/mL，与LC-MS测定结果9.35±0.23ng/mL和103.04±10.93ng/mL相当，说明利用本方法可准确测定花菜样品中的乙酰甲胺磷含量；对加标量为1ng/mL的样品，可通过三次加样富集再检测，检测结果为1.16±0.16ng/mL，与LC-MS测定结果1.11±0.09ng/mL相当，说明利用本方法可对低浓度样品先进行富集后再检测。
表1为MIP-酶抑制法与标准液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法对三种蔬菜加标样品的检测结果比较。从表中可以看出，MIP-酶抑制法可以检测出蔬菜样品中痕量的乙酰甲胺磷，检测结果与LC-MS检测结果相当（经配对t检验，p>0.05，两种方法测定结果无显著性差异）。
表1实际样品检测结果
Claims (4)
1.一种采用多巴胺氧化聚合法在载体材料上合成多功能人工抗体(MIP)的方法，该种多功能MIP既可特异性结合有机磷农药乙酰甲胺磷，包括以下步骤：
步骤一：聚合反应：
(a)将模板分子乙酰甲胺磷与多巴胺按摩尔比为1:10-50的比例溶于PH＝7.6的Tris-HCL缓冲溶液中，混匀的混合液；
(b)加入载体材料，
(c)聚合：室温下暴露于空气中48-72h进行聚合；
步骤二：洗脱模板分子：使用10％冰乙酸的水溶液和三蒸水反复震荡洗涤载体材料，再得到含MIP的载体材料；
上述步骤中，所述的载体材料是多孔酶标板、滤膜、纳米级微球或微米级微球；所述的滤膜是硝酸纤维滤膜、醋酸纤维滤膜或滤纸；所述的微球是四氧化三铁磁性微球或二氧化硅微球。
2.按权利要求1所述方法制备的可特异性结合乙酰甲胺磷的多功能人工抗体(MIP)。
3.一种检测乙酰甲胺磷的试剂盒，它有权利要求1所述的可特异性结合乙酰甲胺磷的多功能人工抗体(MIP)。
4.一种检测乙酰甲胺磷的试剂盒，由含MIP的载体材料、0-200ng/mL的乙酰甲胺磷标准溶液、500mU/mL的胆碱酯酶AChE、20μmol/mL的乙酰胆碱ATCI、1mg/mL的胆碱氧化酶ChOX、15U/mL的辣根过氧化物酶HRP(15U/mL)、1μmol/mL的鲁米诺Luminol组成，所述的含MIP的载体材料按以下方法制得：
步骤一：聚合反应：
(a)将模板分子乙酰甲胺磷与多巴胺按摩尔比为1:10-50的比例溶于PH＝7.6的Tris-HCL缓冲溶液中，混匀的混合液；
(b)加入载体材料，
(c)聚合：室温下暴露于空气中48-72h进行聚合；
步骤二：洗脱模板分子：使用10％冰乙酸的水溶液和三蒸水反复震荡洗涤载体材料，再得到含MIP的载体材料。
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