CN115656156B - 基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农药残留传感器的技术领域，具体涉及基于酶‑分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法及其应用。利用酶抑制法本身的显色性能，无需额外使用电化学装置等进行检测结果的显示，对操作者的专业要求相对较低，利用分子印迹聚合物选择性高的特点，减少酶抑制法的假阳性或假阴性结果，提高方法的准确度和重现性，酶试剂固化在MIP上，稳定性得到提升，有利于增强检测的重复性，传感器也更便于携带和野外现场使用；本发明的基于酶‑分子印迹聚合物双识别传感器能选择性识别样品中的目标农药，有较好的抗干扰能力，提高了方法的重现性和准确度。

Description

基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于农药残留传感器的技术领域，具体涉及基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法及其应用。

背景技术

在大田、农贸市场、超市等场所快速筛选检测农药残留是农产品质量安全监控的重要环节。我国的农药使用范围广、种类繁多，样品基质复杂，干扰成分多，这对农药残留的速测工作提出了很大的挑战。因此，发展高选择性、方便易用的农药残留快速检测技术以应对大量的现场分析，是保障人们生命健康和促进农产品产业可持续发展的客观需要和迫切要求。

目前常见的农残速测方法主要有酶抑制法、胶体金免疫层析法、酶联免疫法、化学速测法、活体检测法、生物传感器法等等，其中酶抑制法应用最为普通，主要针对被广发使用的有机磷和氨基甲酸酯两类杀虫剂。但酶抑制法的选择性不足，易受样品的基质干扰，出现假阳性或假阴性结果，方法的重现性和准确性有限。通过使用特异性较强的酶可提高酶抑制法的选择性，如有机磷水解酶(Organophosphorus hydrolase，OPH)与氨基甲酸类农药无相互作用，能选择性检测有机磷类农药。但这类酶的制备过程较繁琐，耗时费力。这限制了基于酶抑制原理的农残速测方法的进一步研究和应用。如能通过简单、经济的技术手段提高酶抑制法的选择性，有效改善复杂样品基质干扰的问题，基于酶抑制法的农残速测技术的应用性和普适性将会得到很好的提升。

“分子印迹”的基础是由诺贝尔奖获得者Pauling提出的“抗体形成”模板理论，分子印迹聚合物是一种以目标分子为模板制备的、对目标物具有特异性识别性能的高分子聚合物。MIP作为人工识别材料很适合作为传感器的识别元件，在农药残留的检测中应用广泛。但它无法直接检测目标物，需要与不同的检测技术方法结合使用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法及其应用。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，包括如下步骤：

1)将模板分子、功能单体以及聚合溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

所述模板分子、功能单体以及聚合溶液的使用比例为1mmoL:4mmoL:(10～30)mL；

所述模板分子包括克百威、涕灭威、敌敌畏、对硫磷的一种；

所述功能单体包括乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)的一种；

所述聚合溶液包括甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯的一种；

2)于分子复合体中加入10～20mmoL交联剂和引发剂(用量为功能单体的2wt％)，然后在40kHz下进行超声脱气5min得到预聚溶液；

所述交联剂包括α-甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶(4-Vpy)和丙烯酰胺(AM)的一种或以上；

所述引发剂包括偶氮二异丁腈；

3)在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，在65℃下进行热引发自由基聚合反应，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取底材采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

所述底材包括醋酸纤维素、玻璃纤维、聚丙烯、聚偏氟乙烯、定量滤纸、尼龙66等微孔滤膜的一种；

4)聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸进行洗脱除去模板分子，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

所述洗脱采用的溶剂包括甲醇-乙酸、稀盐酸和稀硝酸的一种或以上；

5)配制乙酰胆碱酯酶溶液(1～3U/mL，溶剂为0.02mol/L PBS(pH7.0))，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

本发明还提供了一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器应用于农药残留物的检测，所述农药残留物包括但不限于克百威、涕灭威、敌敌畏、对硫磷。

本发明的有益效果如下：

本发明的基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，1)传感器制备较为简单、步骤少，不需要合成纳米材料合成和制作电极，成本低，；2)利用酶抑制法本身的显色性能，无需额外使用电化学装置等进行检测结果的显示，对操作者的专业要求相对较低，利用分子印迹聚合物选择性高的特点，减少酶抑制法的假阳性或假阴性结果，提高方法的准确度和重现性，酶试剂固化在MIP上，稳定性得到提升，有利于增强检测的重复性，传感器也更便于携带和野外现场使用；3)双识别传感器为膜状，传质速度快，且MIP提高了传感器对农药残留的亲和性，有助于提高酶抑制技术的灵敏度，显色结果肉眼可视，整个分析过程简便、快速、直观。

本发明的基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器能选择性识别样品中的目标农药，有较好的抗干扰能力，提高了方法的重现性和准确度。将该方法与商品化速测卡法进行了对比，以色谱-质谱法进行验证。双识别传感器的假阳性/假阴性率均低于商用速测卡，与色谱-质谱法有较好的符合性，满足农药残留快速检测的要求，为分子识别提供了基础数据。

附图说明

图1为实施例1所制备的克百威双识别传感器的SEM和EDS结果图；

图2为实施例1所制备的克百威双识别传感器的红外吸收光谱图；

图3为实施例1所制备的克百威双识别传感器对不同浓度克百威的响应结果图；

图4为实施例1所制备的克百威双识别传感器对1.00mg/L克百威和3-羟基克百威的响应对比图；

图5为实施例1所制备的克百威双识别传感器的稳定性测试结果图；

图6为实际样品中克百威快速检测结果图；

图7为实施例2所制备的涕灭威双识别传感器的SEM和EDS结果图；

图8为实施例2所制备的涕灭威双识别传感器的红外吸收光谱图；

图9为实施例2所制备的涕灭威双识别传感器对不同浓度涕灭威的响应结果图；

图10为实际样品中克百威快速检测结果图；

图11为实施例3所制备的敌敌畏双识别传感器的SEM和EDS结果图；

图12为实施例3所制备的敌敌畏双识别传感器的红外吸收光谱图；

图13为实施例3所制备的敌敌畏双识别传感器对不同浓度敌敌畏的响应结果图；

图14为实施例3所制备的敌敌畏双识别传感器对1.00mg/L敌敌畏和敌百虫的响应对比图；

图15为实施例3所制备的敌敌畏双识别传感器的稳定性测试结果图；

图16为实际样品中敌敌畏快速检测结果图；

图17为实施例4所制备的对硫磷双识别传感器的SEM和EDS结果图；

图18为实施例4所制备的对硫磷双识别传感器的红外吸收光谱图；

图19为实施例4所制备的对硫磷双识别传感器对不同浓度对硫磷的响应结果图；

图20为实际样品中对硫磷快速检测结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法

1)将1mmoL克百威、10mmoL EGDMA以及10mL DMSO溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

2)于分子复合体中加入4mmoL MAA交联剂和0.0378g偶氮二异丁腈，然后在40kHz下进行超声脱气5min得到预聚溶液；

3)在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，65℃下进行热引发自由基聚合反应10h，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取尼龙66采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

4)聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸采用10％(v％)乙酸-甲醇溶液进行洗脱除去模板分子克百威，无水乙醇清洗，室温下自然晾干，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

5)配制1U/mL乙酰胆碱酯酶溶液，溶剂为0.02mol/L PBS(pH7.0)，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

如图1为实施例1所得克百威酶-分子印迹聚合物双识别传感器的SEM扫描图和EDS图，在放大倍率5000倍下，克百威双识别传感器表面呈层叠、多孔结构。这种多孔结构有利于增大传感器与样品溶液的接触面积，提高传质速率和增大吸附能力。传感器表面C、O和Na三种主要元素的质量比分别为89.1％、10.4％和0.5％(半定量)；

克百威分子印迹-酶双识别传感器的涂层聚合物材料采用溴化钾压片法，根据GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》，进行红外光谱(IR)表征，观察涂层的化学结构。结果如图2所示，涂层在3431cm^-1均有一个较宽的红外吸收峰，对应于O-H键的伸缩振动；2979cm^-1为功能单体MAA上的C–H键伸缩振动；1733cm^-1吸收峰为MAA和EGDMA羰基上C＝O键的伸缩振动；1471cm^-1吸收峰对应残留的C＝C双键的伸缩振动；1389cm^-1吸收峰对应于EGDMA甲基上C-H键的弯曲振动；1264cm^-1处的吸收峰对应于羧基中C-O键的伸缩振动；1154cm^-1处较强的吸收峰对应于酯基中的C-O-C键的伸缩振动。

1.传感器使用条件优化

考察了乙腈、甲醇、pH分别为6.5、7.0、7.5和8.0的0.02mol/LPBS缓冲液，克百威浓度为1.00mg/L。结果显示，当反应溶液为pH＝8.0的PBS缓冲液时，双识别传感器的显色变化最强，与文献、标准的结果比较相符，其次为pH＝7.0和7.5时。乙腈、甲醇作为反应溶剂时传感器的显色变化略弱于pH＝7.0和7.5的PBS缓冲液。当pH＝6.5的PBS缓冲液为溶剂时，传感器无肉眼可观察到的显色变化。因此选择pH＝8.0的PBS缓冲液为最优的反应溶剂。

孵育时间：尝试条件包括3、5、8和10min。结果显示，在8min之内，随吸附时间的增加，传感器对克百威的显色变化程度增加；增加到10min后无明显变化，传感器达到抑制平衡。因此选择8min为最优的孵育时间。

抑制温度：室温

显色底物：50μL 2mg/mL靛酚乙酸酯丙酮溶液

显色温度：尝试条件包括35、37、39和41℃。结果显示37℃时的传感器的显色变化程度最好，41℃时的效果最差，因此选取37℃为最优条件。

显色时间：尝试条件包括1、3和5min。结果显示显色3min的效果优于1min，而增加到5min无明显改善，因此选取3min为最优条件。

2.传感器的检测识别性能

配制一系列克百威标准溶液0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/kg，以纯溶剂作为空白对照，显色后目测样品传感器和空白对照的颜色差别，确定其检出限和显色范围。结果如图3所示。克百威双识别传感器检测克百威的LOD为0.05mg/kg(肉眼可观察到颜色产生对比变化的浓度下限)，高于我国蔬菜、水果中克百威的最大残留限量标准(Maximum residuelimit，MRL)0.02mg/kg。随着溶液中克百威浓度的提高，克百威对传感器上的乙酰胆碱酯酶抑制程度加强，酶催化底物靛酚乙酸酯的程度减弱，于是传感器显色后呈现的蓝色越来越浅。当标准溶液的浓度增加到5.00mg/L时，传感器反应后的颜色接近于白色，农药对酶的抑制近于饱和。

为了对比、印证MIP在传感器识别过程中的作用，在制备克百威分子印迹聚合物-酶双识别传感器的同时制备了非印迹-酶传感器。以1.00mg/L的克百威标准溶液测试两者显色性能的差异，如图3所示。双识别传感器显色后的颜色浅于非印迹-没传感器的颜色，说明双识别传感器上吸附的克百威较多，抑制酶催化的程度较深。这种响应能力上的差异来源于双识别传感器与非印迹-酶对照传感器不同的制备和吸附机理。双识别传感器制备时，模板分子克百威与功能单体MAA之间发生氢键作用，在预组装的过程中进行有序排列。在交联聚合的制备过程中，这种有序排列和特定的三维空间被固定下来。模板分子被洗脱后，聚合物上原来由其所占有的空间形成一个遗留的印迹空腔，可以重新选择性吸附模板分子。而非印迹-酶传感器的制备未以克百威作为模板分子，不存在印迹空腔，其识别机理主要为非特异性吸附，对模板分子的吸附能力低于双识别传感器。由此可见双识别传感器的分子印迹识别性能发生了作用，对模板分子的吸附和响应性能高于非印迹-酶传感器。

3.传感器的选择性识别能力

选择3-羟基克百威作为模板分子克百威的结构类似物，研究了双识别传感器的选择性识别能力，标准溶液的浓度为1.00mg/L。克百威双识别传感器对克百威及3-羟基克百威的显色响应如图4所示。双识别传感器对模板分子克百威的响应颜色浅于对结构类似物3-羟基克百威响应，表明传感器能选择性识别模板分子与其结构类似物。这是由于双识别传感器由于有印迹聚合物的改性作用，在选择性上得到了较大的增强。

4.存放稳定性

为了考察双识别传感器的稳定性，将整片传感器(4.5cm×2.0cm)存放在干燥、4℃的环境中，0天、2周、1个月后各剪下约1.0cm×1.0cm的一小片传感器，均以0.50mg/L克百威标准溶液测试其显色相应性能，结果如图5所示。乙酰胆碱酯酶固载在MIM上面后，稳定性较好，存放2周后和1个月后传感器的灵敏度无肉眼可观察到的明显变化，作为一次性使用的功能材料，稳定性较为优异。

6.实际样品分析

采用双识别传感器快速测定加标0.05mg/kg的小白菜、黄瓜和苹果样品中的克百威，测试传感器在实际样品中的识别能力。图6为传感器识别3种蔬菜、水果样品中克百威后的显色结果图。传感器分析3种样品后均显示不同程度的弱阳性，说明实施例1所制备的双识别传感器可用于实际样品中克百威的快速检测。

7.符合性试验

取30份经色谱-质谱法分析确认后无有机磷、氨基甲酸酯类等干扰农药的空白小白菜、黄瓜、苹果样品，每种蔬菜水果各10份。其中15份作为阴性样品，另外15份添加0.10mg/kg克百威作为阳性样品。将克百威双识别传感器和市面上流通的某品牌的农药残留速测卡应用于该30份样品中克百威的快速检测，以LC-MS/MS法作为确认方法验证结果的准确性。以假阳性和假阴性结果进行判定，假阳性：对于色谱-质谱法检测为阴性的15份样品，分别用自制传感器和购买的速测卡进行检测，与仪器检测结果的一致性进行比较，计算假阳性率；假阴性：对于色谱-质谱法检测为阳性的15份样品，分别用自制传感器和购买的速测卡进行检测，与仪器检测结果的一致性进行比较，计算假阴性率。结果显示，克百威双识别传感器的检测结果与LC-MS/MS法有较好的符合性，说明本方法具有优异的准确度，适用于实际样品中克百威的快速检测。其假阳性率20.0％和假阴性率13.3％均低于对照的商品化农残速测卡(33.3％和20.0％)。

实施例2

一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法

1)将1mmoL涕灭威、20mmoL TMPTMA以及30mL DMF溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

2)于分子复合体中加入4mmoL MAA交联剂和0.0756g偶氮二异丁腈，然后在40kHz下进行超声脱气5min得到预聚溶液；

3)在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，65℃下进行热引发自由基聚合反应10h，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取玻璃纤维采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

4)聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸采用10％(v％)乙酸-甲醇溶液进行洗脱除去模板分子涕灭威，无水乙醇清洗，室温下自然晾干，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

5)配制3U/mL乙酰胆碱酯酶溶液，溶剂为0.02mol/L PBS(pH7.0)，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到涕灭威酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

如图7所示，为实施例2所得涕灭威酶-分子印迹聚合物双识别传感器的SEM扫描图和EDS图，在放大倍率5000倍下，涕灭威双识别传感器表面呈层叠、多孔结构。这种多孔结构有利于增大传感器与样品溶液的接触面积，提高传质速率和增大吸附能力。传感器表面C、O和Na三种主要元素的质量比分别为92.9、6.7和0.4(半定量)。

涕灭威分子印迹-酶双识别传感器的涂层聚合物材料采用溴化钾压片法，根据GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》，进行红外光谱(IR)表征，观察涂层的化学结构，结果如图8所示，涂层在3436cm^-1均有一个较宽的红外吸收峰，对应于O-H键的伸缩振动；2973cm^-1为功能单体MAA上的C–H键伸缩振动；1734cm^-1吸收峰为MAA和EGDMA羰基上C＝O键的伸缩振动；1676cm^-1、1470cm^-1吸收峰对应残留的C＝C双键的伸缩振动；1389cm^-1吸收峰对应于EGDMA甲基上C-H键的弯曲振动；1263cm^-1处的吸收峰对应于羧基中C-O键的伸缩振动；1152cm^-1处较强的吸收峰对应于酯基中的C-O-C键的伸缩振动。

1.传感器的最优使用条件

反应溶剂：0.02mol/L pH＝8.0的PBS缓冲水溶液；孵育时间：8min；孵育温度：室温；显色底物：50μL 2mg/mL靛酚乙酸酯丙酮溶液；显色温度：37℃；显色时间：3min。

2.传感器的检测识别性能

配制一系列涕灭威标准溶液0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/kg，以纯溶剂作为空白对照，显色后目测样品传感器和对照传感器的颜色差别，确定其检出限和显色范围。结果如图9所示。涕灭威双识别传感器检测涕灭威的LOD为0.05mg/kg(肉眼可观察到颜色产生对比变化的浓度下限)，高于我国蔬菜、水果中涕灭威的MRL0.02-0.03mg/kg。随着溶液中涕灭威浓度的提高，涕灭威对传感器上的乙酰胆碱酯酶抑制程度加强，酶催化底物靛酚乙酸酯的程度减弱，于是传感器显色后呈现的蓝色越来越浅。当标准溶液的浓度增加到5.00mg/L时，传感器反应后的颜色接近于白色，农药对酶的抑制近于饱和。

为了对比、印证MIP在传感器识别过程中的作用，在制备涕灭威分子印迹聚合物-酶双识别传感器的同时制备了非印迹-酶传感器。以1.00mg/L的涕灭威标准溶液测试两者显色性能的差异，如图9所示。双识别传感器显色后的颜色浅于非印迹-没传感器的颜色，说明双识别传感器上吸附的涕灭威较多，抑制酶催化的程度较深。这种响应能力上的差异来源于双识别传感器与非印迹-酶对照传感器不同的制备和吸附机理。双识别传感器制备时，模板分子涕灭威与功能单体MAA之间发生氢键作用，在预组装的过程中进行有序排列。在交联聚合的制备过程中，这种有序排列和特定的三维空间被固定下来。模板分子被洗脱后，聚合物上原来由其所占有的空间形成一个遗留的印迹空腔，可以重新选择性吸附模板分子。而非印迹-酶传感器的制备未以涕灭威作为模板分子，不存在印迹空腔，其识别机理主要为非特异性吸附，对模板分子的吸附能力低于双识别传感器。由此可见双识别传感器的分子印迹识别性能发生了作用，对模板分子的吸附和响应性能高于非印迹-酶传感器。

3.实际样品分析

采用双识别传感器快速测定加标0.05mg/kg的小白菜、黄瓜和苹果样品中的涕灭威，测试传感器在实际样品中的识别能力。图10为传感器识别3种蔬菜、水果样品中涕灭威后的显色结果图。传感器分析3种样品后均显示不同程度的弱阳性，说明双识别传感器可用于实际样品中涕灭威的快速检测。

实施例3

一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法

1)将1mmoL敌敌畏、10mmoL EGDMA以及20mL二氯甲烷溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

2)于分子复合体中加入4mmoL AM交联剂和0.0378g偶氮二异丁腈，然后在40kHz下进行超声脱气5min得到预聚溶液；

3)在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，65℃下进行热引发自由基聚合反应10h，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取聚偏氟乙烯采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

4)聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸采用10％(v％)乙酸-甲醇溶液进行洗脱除去模板分子敌敌畏，无水乙醇清洗，室温下自然晾干，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

5)配制2U/mL乙酰胆碱酯酶溶液，溶剂为0.02mol/L PBS(pH7.0)，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到敌敌畏酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

如图11所示，为实施例3所得敌敌畏酶-分子印迹聚合物双识别传感器的SEM扫描图和EDS图，在放大倍率5000倍下，敌敌畏双识别传感器表面呈疏松、多孔结构。这种多孔结构有利于增大传感器与样品溶液的接触面积，提高传质速率和增大吸附能力。传感器表面C和O两种主要元素的质量比分别为90.1％和9.9％(半定量)。

敌敌畏分子印迹-酶双识别传感器的涂层聚合物材料采用溴化钾压片法，根据GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》，进行红外光谱(IR)表征，观察涂层的化学结构，结果如图12所示。涂层在3437cm^-1均有一个较宽的红外吸收峰，对应于N-H键的伸缩振动；2965cm^-1为功能单体AM上的C–H键伸缩振动；1737cm^-1吸收峰为AM和EGDMA羰基上C＝O键的伸缩振动；1675cm^-1、1466cm^-1吸收峰对应残留的C＝C双键的伸缩振动；1389cm^-1吸收峰对应于EGDMA甲基上C-H键的弯曲振动；1263cm^-1处中等强度的吸收峰对应于羧基中C-O键的伸缩振动；1148cm^-1处较强的吸收峰对应于酯基中的C-O-C键的伸缩振动。

1.传感器的最优使用条件

pH＝8.0的0.02mol/L PBS缓冲水溶液；孵育时间：8min；孵育温度：室温；显色底物：50μL 2mg/mL靛酚乙酸酯丙酮溶液；显色温度：37℃；显色时间：3min。

2.传感器的检测识别性能

配制一系列敌敌畏标准溶液0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/kg，以纯溶剂作为空白对照，显色后目测样品传感器和对照传感器的颜色差别，确定其检出限和显色范围。结果如图13所示。敌敌畏双识别传感器检测敌敌畏的LOD为0.05mg/kg(肉眼可观察到颜色产生对比变化的浓度下限)，低于我国蔬菜、水果中敌敌畏的MRL 0.1-0.5mg/kg。随着溶液中敌敌畏浓度的提高，敌敌畏对传感器上的乙酰胆碱酯酶抑制程度加强，酶催化底物靛酚乙酸酯的程度减弱，于是传感器显色后呈现的蓝色越来越浅。当标准溶液的浓度增加到5.00mg/L时，传感器反应后的颜色接近于白色，农药对酶的抑制近于饱和。

为了对比、印证MIP在传感器识别过程中的作用，在制备敌敌畏分子印迹聚合物-酶双识别传感器的同时制备了非印迹-酶传感器。以1.00mg/L的敌敌畏标准溶液测试两者显色性能的差异，如图13所示。双识别传感器显色后的颜色浅于非印迹-没传感器的颜色，说明双识别传感器上吸附的敌敌畏较多，抑制酶催化的程度较深。这种响应能力上的差异来源于双识别传感器与非印迹-酶对照传感器不同的制备和吸附机理。双识别传感器制备时，模板分子敌敌畏与功能单体AM之间发生氢键作用，在预组装的过程中进行有序排列。在交联聚合的制备过程中，这种有序排列和特定的三维空间被固定下来。模板分子被洗脱后，聚合物上原来由其所占有的空间形成一个遗留的印迹空腔，可以重新选择性吸附模板分子。而非印迹-酶传感器的制备未以敌敌畏作为模板分子，不存在印迹空腔，其识别机理主要为非特异性吸附，对模板分子的吸附能力低于双识别传感器。由此可见双识别传感器的分子印迹识别性能发生了作用，对模板分子的吸附和响应性能高于非印迹-酶传感器。

3.选择性识别能力：

选择敌百虫作为模板分子敌敌畏的结构类似物，研究了双识别传感器的选择性识别能力，标准溶液的浓度为1.00mg/L。敌敌畏双识别传感器对敌敌畏及敌百虫的显色响应如图14所示。双识别传感器对模板分子敌敌畏的响应颜色浅于对结构类似物敌百虫响应，表明传感器能选择性识别模板分子与其结构类似物。这是由于双识别传感器由于有印迹聚合物的改性作用，在选择性上得到了较大的增强。

4.抗干扰试验：

以pH＝8.0的0.02mol/L PBS缓冲液为溶剂分别配制1.00mg/L阿维菌素、吡虫啉、杀虫双和丙环唑标准溶液，作为敌敌畏双识别传感器抗干扰实验的研究对象。通过考察这4种农产品中有可能出现的、非有机磷或氨基甲酸酯类干扰物的存在对传感器显色结果的影响，研究其抗干扰能力。结果显示，双识别传感器对这4种农药的显色结果与空白对照无明显差异，说明这些农药未对传感器的检测产生干扰，传感器具有选择性识别能力。

5.存放稳定性：

为了考察双识别传感器的稳定性，将整片传感器(4.5cm×20cm)存放在干燥、4℃的环境中，0天，2周、1个月后各剪下约1.0cm×1.0cm的一小片传感器，均以0.50mg/L敌敌畏标准溶液测试其显色相应性能，结果如图15所示。乙酰胆碱酯酶固载在MIM上面后，稳定性较好，存放2周和1个月后传感器的灵敏度无肉眼可观察到的明显变化，作为一次性使用的功能材料，稳定性较为优异。

6.实际样品分析

采用双识别传感器快速测定加标0.05mg/kg的小白菜、黄瓜和苹果样品中的敌敌畏，测试传感器在实际样品中的识别能力。图16为传感器识别3种蔬菜、水果样品中敌敌畏后的显色结果图。传感器分析3种样品后均显示不同程度的弱阳性，说明双识别传感器可用于实际样品中敌敌畏的快速检测。

7.符合性试验：

取30份经色谱-质谱法分析确认后无有机磷、氨基甲酸酯类等干扰农药空白小白菜、黄瓜、苹果样品，每种蔬菜水果各10份。其中15份作为阴性样品，另外15份添加0.10mg/kg敌敌畏作为阳性样品。将敌敌畏双识别传感器和市面上流通的某品牌的农药残留速测卡应用于该30份样品中敌敌畏的快速检测，以LC-MS/MS法作为确认方法验证结果的准确性。以假阳性和假阴性结果进行判定，假阳性：对于色谱-质谱法检测为阴性的15份样品，分别用自制传感器和购买的速测卡进行检测，与仪器检测结果的一致性进行比较，计算假阳性率；假阴性：对于色谱-质谱法检测为阳性的15份样品，分别用自制传感器和购买的速测卡进行检测，与仪器检测结果的一致性进行比较，计算假阴性率。结果显示，敌敌畏双识别传感器的检测结果与LC-MS/MS法有较好的符合性，取得令人满意的准确度，适用于实际样品中敌敌畏的快速检测。同时其假阳性率13.3％和假阴性率13.3％均低于对照的商品化农残速测卡(20.0％和26.7％)。

实施例4

一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法

1)将1mmoL对硫磷、10mmoL TMPTMA以及20mL乙酸乙酯溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

2)于分子复合体中加入4mmoL4-Vpy交联剂和0.0378g偶氮二异丁腈，然后在40kHz下进行超声脱气5min得到预聚溶液；

3)在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，65℃下进行热引发自由基聚合反应10h，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取醋酸纤维素采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

4)聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸采用10％(v％)乙酸-甲醇溶液进行洗脱除去模板分子对硫磷，无水乙醇清洗，室温下自然晾干，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

5)配制2U/mL乙酰胆碱酯酶溶液，溶剂为0.02mol/L PBS(pH7.0)，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到对硫磷酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

如图17所示，为实施例4所得对硫磷酶-分子印迹聚合物双识别传感器的SEM扫描图和EDS图，在放大倍率5000倍下，对硫磷双识别传感器表面呈疏松、多孔结构。这种多孔结构有利于增大传感器与样品溶液的接触面积，提高传质速率和增大吸附能力。传感器表面C、和O两种主要元素的质量比分别为90.4％、和9.6％(半定量)。

对硫磷分子印迹-酶双识别传感器的涂层聚合物材料采用溴化钾压片法，根据GB/T 6040-2002《红外光谱分析方法通则》，进行红外光谱(IR)表征，观察涂层的化学结构，结果如图18所示。涂层在3436cm^-1均有一个较宽的红外吸收峰，对应于O-H键的伸缩振动；2951cm^-1为功能单体MAA上的C–H键伸缩振动；1735cm^-1吸收峰为MAA和EGDMA羰基上C＝O键的伸缩振动；1674cm^-1、1467cm^-1吸收峰对应残留的C＝C双键的伸缩振动；1388cm^-1吸收峰对应于EGDMA甲基上C-H键的弯曲振动；1262cm^-1处的吸收峰对应于羧基中C-O键的伸缩振动；1148cm^-1处较强的吸收峰对应于酯基中的C-O-C键的伸缩振动。

1.传感器的最优使用条件

pH＝8.0的0.02mol/L PBS缓冲水溶液；孵育时间：8min；孵育温度：室温；显色底物：50μL 2mg/mL靛酚乙酸酯丙酮溶液；显色温度：37℃；显色时间：3min。

2.传感器的检测识别性能

配制一系列对硫磷标准溶液0.50、1.00、5.00、10.00mg/kg，以纯溶剂作为空白对照，显色后目测样品传感器和对照传感器的颜色差别，确定其检出限和显色范围。结果如图19所示。对硫磷双识别传感器检测对硫磷的LOD为0.50mg/kg(肉眼可观察到颜色产生对比变化的浓度下限)，高于我国蔬菜、水果中对硫磷的MRL 0.01mg/kg。随着溶液中对硫磷浓度的提高，对硫磷对传感器上的乙酰胆碱酯酶抑制程度加强，酶催化底物靛酚乙酸酯的程度减弱，于是传感器显色后呈现的蓝色越来越浅。当标准溶液的浓度增加到10.00mg/L时，传感器反应后的颜色接近于白色，农药对酶的抑制近于饱和。

为了对比、印证MIP在传感器识别过程中的作用，在制备对硫磷分子印迹聚合物-酶双识别传感器的同时制备了非印迹-酶传感器。以5.00mg/L的对硫磷标准溶液测试两者显色性能的差异，如图19所示。双识别传感器显色后的颜色浅于非印迹-没传感器的颜色，说明双识别传感器上吸附的对硫磷较多，抑制酶催化的程度较深。这种响应能力上的差异来源于双识别传感器与非印迹-酶对照传感器不同的制备和吸附机理。双识别传感器制备时，模板分子对硫磷与功能单体AM之间发生氢键作用，在预组装的过程中进行有序排列。在交联聚合的制备过程中，这种有序排列和特定的三维空间被固定下来。模板分子被洗脱后，聚合物上原来由其所占有的空间形成一个遗留的印迹空腔，可以重新选择性吸附模板分子。而非印迹-酶传感器的制备未以对硫磷作为模板分子，不存在印迹空腔，其识别机理主要为非特异性吸附，对模板分子的吸附能力低于双识别传感器。由此可见双识别传感器的分子印迹识别性能发生了作用，对模板分子的吸附和响应性能高于非印迹-酶传感器。

3.实际样品分析

采用双识别传感器快速测定加标0.50mg/kg的小白菜、黄瓜和苹果样品中的对硫磷，测试传感器在实际样品中的识别能力。图20为传感器识别3种蔬菜、水果样品中对硫磷后的显色结果图。传感器分析3种样品后均显示不同程度的弱阳性，说明双识别传感器可用于实际样品中对硫磷的快速检测。

Claims (6)

1.一种基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将模板分子、功能单体以及聚合溶液混合，充分混匀、溶解后静置，使得模板分子和功能单体充分接触，形成分子复合体；

所述模板分子、功能单体以及聚合溶液的使用比例为1 mmoL:4 mmoL:（10~30） mL；

所述模板分子包括克百威、涕灭威、敌敌畏、对硫磷的一种；

2）于分子复合体中加入交联剂和引发剂，然后进行超声脱气得到预聚溶液；

3）在预聚溶液中浸泡滤纸，取出滤纸后，将其用两片盖玻片夹住，形成三层结构，置于容器中，通入氮气后密封，放入烘箱中，进行热引发自由基聚合反应，与底材一体得到分子印迹聚合物；

所述滤纸的前处理为：取底材采用无水乙醇清洗、氮气吹干后保存备用，即为滤纸；

所述底材包括醋酸纤维素、玻璃纤维、聚丙烯、聚偏氟乙烯、定量滤纸、尼龙66的一种；

4）聚合反应完成后，取出滤纸，将滤纸进行洗脱除去模板分子，得到可选择性吸附模板分子的分子印迹膜MIM；

5）配制乙酰胆碱酯酶溶液，将分子印迹膜MIM浸没于酶溶液中，置于室温、避光的空间里让溶剂自然挥发，使乙酰胆碱酯酶留在膜上，反复进行以上过程直至分子印迹膜上的固载酶量达到分析灵敏度的要求为止，即得到酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

2.根据权利要求1所述的基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，其特征在于，步骤1）所述聚合溶液包括甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯的一种。

3.根据权利要求1所述的基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，其特征在于，步骤2）所述引发剂包括偶氮二异丁腈。

4.根据权利要求1所述的基于酶-分子印迹聚合物双识别传感器的制备方法，其特征在于，步骤4）所述洗脱采用的溶剂包括甲醇-乙酸、稀盐酸和稀硝酸的一种或以上。

5.一种权利要求1~4任一项所述制备方法得到的酶-分子印迹聚合物双识别传感器。

6.一种权利要求5所述的酶-分子印迹聚合物双识别传感器应用于农药残留物的检测，所述农药残留物包括克百威、涕灭威、敌敌畏、对硫磷。