CN111678911A - 一种基于毛细管印迹sers传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于毛细管印迹SERS传感器及其制备方法。该方法步骤包括：将表面氨基化的毛细管浸入粒径在20nm‑50nm的金纳米星溶液中24h后，得具有SERS活性的玻璃毛细管传感器；将蛋白与盐酸多巴胺溶解在10mM的Tris‑HCl缓冲液中，并浸入具有SERS活性的玻璃毛细管，洗涤后，即可获得针对蛋白特异性识别的毛细管印迹SERS传感器。本发明蛋白为胰蛋白酶、胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白。本发明还提供一种检测蛋白的方法，根据报告分子渗透进入印迹空穴差异引起的SERS信号差异，对蛋白进行定量检测。本发明易于操作与规模化生产，并且传感器上粒子分布均匀，检测重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于毛细管印迹SERS传感器及其制备方法和应用，涉及纳米材料学和分析化学领域。
背景技术
近年来，与生理过程、疾病等密切相关的蛋白类生物标志物(biomarkers)的分析监测已被广泛研究。然而，生物样品中标志物的浓度往往较低，并伴有高浓度的共存物干扰，快速高灵敏临床检测面临极大的困难。目前主要依赖高特异性的免疫测定法，但是这种分析方法需要特定的昂贵免疫抗体，且分析过程耗时费力。此外，抗体的可重复性较差，具有易变性，导致其检测的灵敏度与重现性不能保证。因此，急需发展新的分析方法和传感器件，提高分析品质。
分子印迹聚合物(MIPs)是在模拟酶—底物及受体—抗体之间相互作用的基础上，发展起来的一种对模板分子(即待分析对象)具有专一识别性能的聚合物。MIPs的制备过程是将目标分子作为模板,通过一定的作用力与功能单体形成复合物，和交联剂在一定条件下发生聚合反应,然后将目标分子洗脱,最终形成与目标分子具有在形状、大小、功能基团上相匹配的空穴。与常规使用的生物识别元件(如荧光蛋白、抗体、酶或适配体)相比，所制备的MIPs因对模板分子具有特定的结合位点和识别能力，具有良好的可重复性、价格便宜和高的化学稳定性等优点，已被广泛应用到分离、样品前处理、传感等领域。
表面增强拉曼散射(SERS)是指吸附在金、银等贵金属纳米材料表面的分子，其拉曼信号显著增强(可达到106以上)的现象，是一种重要的分析检测技术。目前已有研究整合了MIPs和SERS技术用于构建生物标志物传感器，以期同时获得MIPs的高稳定性和高特异性识别能力，以及SERS的高灵敏、快速检测等优点。此类传感器主要由SERS基底和其表面构建的MIP两层结构组成。在检测中主要基于以下两个原理：
(1)通过MIP捕获待测溶液中的biomarkers，其自身拉曼信号被SERS基底增强，进而用于定量。由于大部分biomarkers的拉曼活性(即化学结构信号决定的固有信号强度)很低，导致该原理的检测灵敏度较差。
(2)通过MIP捕获待测溶液中的biomarkers后，在测试体系中加上可以和biomarker特异结合的、具有高灵敏和特征性拉曼信号的SERS纳米探针。通过检测SERS纳米探针的信号来反映待测物含量。这种方法提升了灵敏度，但需要额外的昂贵SERS探针辅助，并且对biomarker种类有所限制：其结构必须含有两个以上的结合位点：一个位点用于MIPs的连接，另一个位点用于SERS探针的连接。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种基于毛细管印迹SERS传感器及其制备方法。该方法得到的传感器检测灵敏度高，并且检测时间短。
本发明提供一种基于毛细管印迹SERS传感器的制备方法，步骤包括：
(1)将表面洁净的玻璃毛细管一端浸泡在含APTES的无水乙醇溶液中，在70℃下氨基化24h后，水浴超声下用无水乙醇3次洗涤其表面未被反应的硅烷，得到氨基化的玻璃毛细管；
(2)在pH 7.5的HEPES缓冲液中加入3mL的超纯水与40μL的HAuCl4溶液，室温下静止20分钟后，得到粒径在20nm-50nm的金纳米星胶体悬浮液；
(3)将氨基化的玻璃毛细管浸入制备的金纳米星胶体悬浮液中24h后，用超纯水冲洗三次，室温下干燥后即可制得SERS活性的玻璃毛细管；
(4)在10mM Tris-HCl缓冲液中溶解10mg蛋白和2mg多巴胺，然后将SERS活性的玻璃毛细管垂直浸入上述溶液中，在室温下静置聚合6h；最后，用含0.1％w/v十二烷基硫酸钠与3％v/v乙酸的混合溶液洗涤五次，将蛋白酶分子从PDA层中洗脱，并用超纯水彻底去除残留的乙酸和十二烷基硫酸钠，干燥备用以制得毛细管印迹SERS传感器。
进一步的，所述蛋白为胰蛋白酶。
进一步的，所述蛋白为胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白。
本发明还提供一种基于毛细管印迹SERS传感器，采用上述制备方法制备得到。
本发明还提供一种基于毛细管印迹SERS传感器的应用，用于检测蛋白。
进一步的，检测蛋白的步骤包括：
(1)将所述的毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，在激光强度为100mW、激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTC SERS强度对蛋白酶浓度的标准曲线；
(2)将所述的毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的蛋白酶的尿液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中蛋白酶的含量，计算回收率。计算公式为：I0-I)/I0＝0.1737log c+0.3857R2＝0.9919，I0为空白毛细管印迹SERS传感器直接置于DTTC溶液产生的拉曼信号强度，I为空白毛细管印迹SERS传感器置于蛋白待测溶液后，再置于DTTC溶液产生的拉曼信号强度；c为溶液中待测蛋白质的浓度；(I0-I)/I0----log c呈现线性关系。
进一步的，所述DTTC的浓度为10-6M-10-4M。
进一步的，所述毛细管印迹SERS传感器浸入蛋白酶溶液的时间为10min-15min。
进一步的，所述毛细管印迹SERS传感器浸入尿液的时间为10min-15min。
进一步的，检测蛋白的步骤包括：
(1)将如权利要求4所述的毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面，在10-4M CBBG溶液中浸泡1min，再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，在激光强度为100mW、激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTCSERS强度对蛋白酶浓度的标准曲线；
(2)将毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的蛋白酶的尿液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中蛋白酶的含量，计算回收率。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的基于毛细管印迹的SERS传感器制备方法简便，易于操作与规模化生产，并且传感器上粒子分布均匀，检测重现性好。
2.本发明提供的基于毛细管印迹的SERS传感器及间接分析方法对胰蛋白酶的检测灵敏度高，检测限可达4.1×10-3μg/L，并且检测时间短(11min)。
3.本发明提供的基于毛细管印迹的SERS传感器所需的待测生物样品量极少，仅需50μL，使该传感器在测定微量生物样本中表现出了巨大潜力。
4.本发明提供的间接分析方法可扩充到任何其它模板印迹大分子的检测，使该分析方法在扩展基于MIPs的SERS检测种类上表现出了独特优势。
附图说明
图1为本发明实施例1的制备基于毛细管印迹的SERS传感器示意图。
图2为本发明实施例3的检测蛋白酶的步骤示意图。
图3为本发明实施例4的检测蛋白酶的步骤示意图。
图4为本发明芯片表面的电镜表征和检测信号情况图。其中4a)表面组装了金纳米星的玻璃毛细管扫描电镜SEM图像，4b-e)为以胰蛋白酶为模板分子，经历不同MIP聚合时间(1h、3h、5h和7h)后的毛细管SEM图像。4f)聚合时间为5h毛细管，去除胰蛋白酶模板分子后，形成MIP毛细管传感器的SEM图像。4g)只有多巴胺、没有胰蛋白酶模板分子参与聚合而形成非印迹(NIP)毛细管的SEM图像。所有SEM图像标尺为500nm。4h)聚多巴胺(PDA)厚度对SERS信号的影响机理示意图。4i)上述不同制备条件下形成传感器，浸入0.1mM DTTC溶液生成的拉曼光谱图。
图5为本发明测试胰蛋白酶的灵敏度、线性、选择性等结果图。5a)以去离子水和人尿液为检测基质，利用毛细管传感器测定100μg/L胰蛋白酶所生成的DTTC拉曼光谱。两种条件下拉曼信号强度基本一致，说明尿液基质组分不会对测定带来干扰。5b)同一毛细管传感器上随机选取10个测试点的拉曼光谱图，拉曼信号强度基本一致，说明传感器的测试重现性良好。5c)胰蛋白酶传感器对胰蛋白酶、血清白蛋白、胃蛋白酶、血红蛋白、L-半胱氨酸及其混合物的响应。胰蛋白酶和其他化合物的浓度分别为1μg/L和100μg/L。说明传感器的测试选择性良好。5d)胰蛋白酶传感器的测定标准曲线图，以及5e)对应的拉曼光谱。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1
图1为本发明实施例1的制备基于毛细管印迹的SERS传感器示意图。如图1所示，一种基于毛细管印迹SERS传感器的制备方法，步骤包括：
(1)将玻璃毛细管的两端分别用火焰密封后，浸泡在RBSTM 25试剂中水浴超声2h；然后，用大量的超纯水洗涤多次之后，继续浸泡在H2SO4-H2O2(v/v,7/3)的混合液中4h，最后用大量的超纯水洗涤3次，干燥备用；
(2)将上述制备的表面洁净玻璃毛细一端浸泡在含量为1％的APTES的无水乙醇溶液中，在70℃下氨基化24h后，水浴超声下用无水乙醇3次洗涤其表面未被反应的硅烷，干燥备用；
(3)在pH 7.5的HEPES缓冲液(2mL,100mM)中加入3mL的超纯水与HAuCl4(40μL,24.25mM)溶液，室温下静止20分钟后，绿色溶液的出现表明金纳米星的制备成功；
(4)将氨基化的玻璃毛细管浸入制备的金纳米星胶体悬浮液中24h后，用超纯水冲洗三次，室温下干燥后即可制得SERS活性的玻璃毛细管；
(5)在10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中溶解10mg蛋白酶和2mg多巴胺，然后将SERS活性的玻璃毛细管垂直浸入上述溶液中，在室温下静置6h完成聚合；最后，用含0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)与3％(v/v)乙酸的混合溶液洗涤五次，将胰蛋白酶分子从PAD层中洗脱，并用超纯水彻底去除残留的乙酸和SDS，干燥备用以制得毛细管印迹SERS传感器。
在SERS芯片形式上，我们选择了商品化的玻璃毛细管作为担载材料，和已有硅片、玻璃片、纸等相比，显示了一些优点，包括易获取、成本低、表面均匀性好，体积小易于便携化，制备和测试消耗的试剂量和待测样量少等。本发明毛细管尖端尺寸界定为100纳米至100微米，其优点是：纳米尺度尖端可以刺入活细胞或微区生物组织，实现微区中蛋白待测物分析；微米尺寸尖端适用于体外小体积样品(如尿液、血液、汗液等)中蛋白待测物分析。
本发明提供的基于毛细管印迹的SERS传感器，所述传感器依次由玻璃毛细管、吸附在毛细管外表面的金纳米星、包裹在金纳米星上的聚多巴胺层、印迹在聚多巴胺层里的胰蛋白酶空穴四个部分组成。
本发明采用金纳米星作为表面增强拉曼散射中使用的贵金属纳米材料，但不限于金纳米星，还可为金、银等材质的其他形貌纳米材料。
实施例2
实施例2的制备方法和实施例1相同，将实施例1中的毛细管印迹SERS传感器分别浸入到不同浓度的DTTC(10-6-10-3M)溶液中，在激光强度为100mW、激光波长为780nm的条件下测定各SERS强度，最终确定10-3M的DTTC传感器的灵敏度最高。
对比例1
对比例1的制备方法和实施例1相同，与实施例1的不同之处在于：将步骤(5)中室温下静置聚合时间分别变更为1h，3h和7h。
将制备的不同PDA厚度的毛细管印迹SERS传感器分别浸入到DTTC(10-4M)的溶液中，在激光强度为100mW，激光波长为780nm的条件下测定各SERS强度。
由图4可见，PDA厚度太薄时(聚合时间为1h和3h)，DTTC不仅能通过印迹空穴接触金纳米星产生SERS信号，也能通过壳层隔绝拉曼效应产生SERS信号，此时PDA无法起到隔绝作用；当PDA厚度太厚时(聚合时间为7h)，印迹空穴只能在PDA的表层生成，也会影响DTTC通过孔径的进入，本发明PDA的厚度要适宜，在室温下静置聚合6h为最优时间。
实施例3
一种检测胰蛋白酶的方法，如图2所示，利用拉曼报告分子的SERS信号与胰蛋白酶浓度的关系来间接测定胰蛋白酶的含量，具体步骤包括：
(1)将毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的胰蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，在激光强度为100mW，激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTC SERS强度对胰蛋白酶浓度的标准曲线；所述的毛细管印迹SERS传感器浸入胰蛋白酶溶液的时间为10min-15min；DTTC的浓度为10-6M-10-4M；
(2)将毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的胰蛋白酶的尿液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中胰蛋白酶的含量，计算回收率；所述的毛细管印迹SERS传感器浸入尿液的时间为10min-15min；DTTC的浓度为10-6M-10-4M。
表1 实施例3检测胰蛋白酶的结果表
从表1可看出，本方法的回收率和精密度良好。
本发明利用指示分子间接测定biomarker的方法原理，在毛细管外表面形成SERS基底，并在其上生成对胰蛋白酶特异性结合的印迹空穴，形成检测芯片。当没有胰蛋白酶待测物存在时，外在的拉曼指示分子(尺寸显著小于蛋白类标志物的小分子，但具有高的拉曼增强信号)，可以进入芯片制备过程中胰蛋白酶洗脱后形成的空穴，接触内部的SERS基底表面，产生强的指示分子SERS信号；而当胰蛋白酶待测物存在时，胰蛋白酶特异性结合在空穴中，堵塞了指示分子结合SERS基底的通道，因此SERS信号降低。通过分析信号下降程度反映胰蛋白酶浓度。
本发明选择的拉曼测试激发波长为780nm，拉曼报告分子为具有近红外吸收性质的拉曼报告分子DTTC，二者波长匹配，以实现表面增强共振拉曼散射(SERRS)效应，达到最优信号增强效果和检测灵敏度。但不限于DTTC，还可为其他报告分子，如：Cy7、DIR、IR792、IR140等近红外报告分子。
实施例4
一种检测蛋白质类生物标志物的方法，如图3所示，所述蛋白质为胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白，具体步骤包括：
(1)将所述的毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面，在10-4M考马斯亮蓝G-250(CBBG)溶液中浸泡1分钟，再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，在激光强度为100mW，激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTC SERS强度对蛋白浓度的标准曲线；所述的毛细管印迹SERS传感器浸入蛋白溶液的时间为10min-15min；DTTC的浓度为10-6M-10-4M；
(2)将毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的蛋白的水溶液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中蛋白的含量，计算回收率；所述的毛细管印迹SERS传感器浸入水溶液的时间为10min-15min；DTTC的浓度为10-6M-10-4M。
胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白等尺寸大，三维结构中存在疏水口袋结构，DTTC可以进入蛋白内部，这种作用将造成DTTC和SERS增强基底靠近，产生背景信号，不利于定量，不能获得定量曲线。为了解决该问题，在毛细管传感器吸附待测蛋白之后、混合DTTC生成信号之前，补充了一个考马斯亮蓝G250(CBBG)溶液浸泡步骤(10-4M CBBG溶液中停留1min)。CBBG能与蛋白质强相互作用/附着，占据疏水口袋。因此，DTTC再与结合了CBBG的蛋白混合，就无法进入蛋白质结构内部，生成干扰信号。胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白浓度与信号强度的对数呈良好的线性关系。
上述实施例只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能依此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于毛细管印迹SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将表面洁净的玻璃毛细管一端浸泡在含3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES的无水乙醇溶液中，在70℃下氨基化24h后，水浴超声下用无水乙醇3次洗涤其表面未被反应的硅烷，得到氨基化的玻璃毛细管；
(2)在pH 7.5的HEPES缓冲液中加入3mL的超纯水与40μL的HAuCl4溶液，室温下静止20分钟后，得到粒径在20nm-50nm的金纳米星胶体悬浮液；
(3)将氨基化的玻璃毛细管浸入制备的金纳米星胶体悬浮液中24h后，用超纯水冲洗三次，室温下干燥后即可制得SERS活性的玻璃毛细管；
(4)在10mM Tris-HCl缓冲液中溶解10mg蛋白和2mg多巴胺，然后将SERS活性的玻璃毛细管垂直浸入上述溶液中，在室温下静置聚合6h；最后，用含0.1％w/v十二烷基硫酸钠与3％v/v乙酸的混合溶液洗涤五次，将蛋白酶分子从聚多巴胺PDA层中洗脱，并用超纯水彻底去除残留的乙酸和十二烷基硫酸钠，干燥备用以制得毛细管印迹SERS传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白为胰蛋白酶。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白为胃蛋白酶、牛血清白蛋白或血红蛋白。
4.一种毛细管印迹SERS传感器，其特征在于，如权利要求2所述的制备方法制备得到。
5.一种毛细管印迹SERS传感器，其特征在于，如权利要求3所述的制备方法制备得到。
6.一种如权利要求4或5所述的毛细管印迹SERS传感器的应用，其特征在于，用于检测蛋白。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测蛋白的步骤包括：
(1)将如权利要求4所述的毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子3,3'-二乙基硫醛三碳菁化碘DTTC的溶液中，在激光强度为100mW、激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTC SERS强度对蛋白酶浓度的标准曲线；
(2)将如权利要求4所述的毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的蛋白酶的尿液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中蛋白酶的含量，计算回收率。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)(2)中毛细管印迹SERS传感器浸入蛋白酶溶液的时间为10min-15min；所述DTTC的浓度为10-6M-10-4M；所述毛细管印迹SERS传感器浸入尿液的时间为10min-15min。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测蛋白的步骤包括：
(1)将如权利要求4所述的毛细管印迹SERS传感器浸入不同浓度的蛋白酶溶液中后，用去离子水洗涤表面，在10-4M考马斯亮蓝G250 CBBG溶液中浸泡1min，再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，在激光强度为100mW、激光波长为780nm的条件下测定各溶液的SERS强度，绘制DTTC SERS强度对蛋白酶浓度的标准曲线；
(2)将毛细管印迹SERS传感器浸入含有一定量的蛋白酶的尿液中后，用去离子水洗涤表面后再浸入到拉曼报告分子DTTC的溶液中，测量SERS强度，依据(1)中获得的标准曲线测定尿液中蛋白酶的含量，计算回收率。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)(2)中毛细管印迹SERS传感器浸入蛋白酶溶液的时间为10min-15min；所述DTTC的浓度为10-6M-10-4M；所述毛细管印迹SERS传感器浸入尿液的时间为10min-15min。
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