CN104945623B

CN104945623B - 一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法

Info

Publication number: CN104945623B
Application number: CN201510387979.7A
Authority: CN
Inventors: 吕斌; 刘燕婕; 石云; 刘飞; 罗密芳
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: CN104945623A

Abstract

本发明公开了一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，首先在载体材料上修饰多巴胺纳米膜，然后将靶病毒与修饰了多巴胺纳米膜的载体材料相结合，形成病毒‑多巴胺‑载体材料复合体，最后再从复合体上将靶病毒洗脱，即得到相应的抗病毒分子印迹聚合物。本发明的抗病毒分子印迹聚合物可利用病毒洗脱后留下的印迹孔穴，特异性结合靶病毒，并抑制靶病毒增殖以及感染宿主；该抗病毒分子印迹聚合物具有使用特异性好、使用环境友好以及再生简单的优点，在生物免疫领域有良好的使用前景。

Description

一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法

技术领域

本发明属于生物免疫技术领域，更具体地，涉及一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法。

背景技术

人类的很多疾病由病毒引起，免疫法和抗病毒药物是抗病毒治疗的两种方法，其中免疫法是目前控制病毒感染的最有效方法。免疫法包括免疫接种以及利用含抗体的血清进行被动免疫，但疫苗、免疫球蛋白等免疫性制剂是蛋白质，其制备往往需要活体动物，制备过程复杂，且对温度、离子、pH敏感，不易保存。此外，蛋白制剂易于引起过敏反应，部分人群不能使用。由于这些特点，某些新发和高致死性病毒，如埃博拉病毒、HIV病毒等，至今尚缺乏适宜的免疫制剂。因此，开发有效的非蛋白类免疫制剂，是预防和治疗病毒性疾病的主要方向之一。

分子印迹技术可制备在空间结构和结合位点上与靶分子(模板分子)匹配的人工抗体，这种人工抗体又被称为分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers,MIP)。分子印迹聚合物是化学合成的高分子聚合物，通过特定的空间结构和化学键(包括共价键、离子键、氢键等)特异性识别和结合靶分子，其吸附特异性与天然抗体类似，但耐受有机溶剂、离子、酸碱、高温和高压。分子印迹聚合物已应用于天然抗体模拟，模拟酶催化，控缓释药物等诸多领域。

病毒人工抗体已有少量研究，大部分工作是利用人工抗体对靶病毒的特异性结合能力，检测靶病毒。如Bolisay等利用聚丙烯胺制备烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的分子印迹水凝胶(Bolisay,L.D.,et al.Molecularly imprinted polymers fortobacco mosaic virus recognition.Biomaterials.2006,27(22):4165-4168.)，可特异性识别烟草花叶活病毒，而对死病毒没有识别能力(Bolisay,L.D.,et al.Optimizationof virus imprinting methods to improve selectivity and reduce nonspecificbinding.Biomacromolecules.2007,8(12):3893-3899.)。Cumbo等利用表面印迹法合成了可特异性结合花叶病毒(turnip yellow mosaic virus)的分子印迹聚合物，这种分子印迹聚合物在人血清中也展现出很高的吸附能力(Cumbo,A.,et al.A syntheticnanomaterial for virus recognition produced by surface imprinting.NatureCommunications.2013,4:1503.)。Sankarakumar等运用乳液聚合法合成了大肠杆菌噬菌体fr的人工抗体，显示该人工抗体可以降低噬菌体感染靶细菌的能力(Sankarakumar,N.andY.W.Tong.Preventing viral infections with polymeric virus catchers:a novelnanotechnological approach to anti-viral therapy.Journal of MaterialsChemistry B.2013,1(15):2031-2037.)。但以上工作中，分子印迹聚合物是在有机溶液或含水的有机溶液中制备的，由于病毒是大分子化合物，在有机溶液中易变性，影响其形态结构的完整性，导致结合效果不佳。此外，在有机溶剂中制备的分子印迹聚合物，生物兼容性差，不适合体内使用。目前没有研究系统分析病毒分子印迹聚合物的毒性和生物兼容性；可制备植物病毒或细菌病毒分子印迹聚合物的方法，是否适合用于制备人类病毒的分子印迹聚合物，目前也尚无相应的报道。

多巴胺在碱性溶液(pH>8.5)中可进行自聚合，多巴胺自聚合体系为水溶性合成体系，不使用有机溶剂，适合制备蛋白质等生物大分子的人工抗体，但是该体系尚未用于制备病毒MIP，主要的原因有两个：(1)多巴胺自聚合膜的厚度在10nm～50nm之间，而大部分病毒直径大于50nm，直接将病毒与多巴胺自聚合体系混合进行自聚合，印迹效果不佳；(2)多巴胺自聚合反应需要在碱性(pH>8.5)条件下进行，病毒在碱性条件下容易变性，影响印迹效果。因此，以全病毒分子为模板分子制备病毒人工抗体时，需要对多巴胺印迹体系进行改进。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷，本发明提供了一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，通过对催化剂的选择和对反应条件的优化，使得多巴胺能在环境条件更加温和的情况下与靶病毒进行结合，从而生成具有优良性能的病毒人工抗体。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种抗病毒分子印迹聚合物，其特征在于：

首先，在过硫酸铵的催化下，将载体材料表面修饰多巴胺纳米膜，形成多巴胺-载体材料复合体；然后，将靶病毒与多巴胺-载体材料复合体相结合，形成病毒-多巴胺-载体材料复合体；最后从所述复合体上将所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物；

抗病毒分子印迹聚合物表面有所述靶病毒洗脱后形成的印迹孔穴，用于特异性结合所述靶病毒，并抑制所述靶病毒增殖以及感染宿主。

优选地，具体步骤如下：

步骤一：载体的表面修饰

向多巴胺缓冲液中加入载体材料，缓慢搅拌使之充分反应后弃掉缓冲液，在此过程中，多巴胺在过硫酸胺的催化下聚合在载体材料表面，得到多巴胺-载体材料复合体；

所述多巴胺缓冲液的配置方法为，将过硫酸铵与多巴胺以3:2～3:1的摩尔比溶于pH值为7.0～8.5的Tris-HCl缓冲溶液中；

步骤二：病毒-多巴胺-载体材料复合体的生成

向多巴胺缓冲液中加入步骤一得到的多巴胺-载体材料复合体和靶病毒，缓慢搅拌使之充分反应后弃掉缓冲液，即得到病毒-多巴胺-载体材料复合体；

所述靶病毒在缓冲液中的浓度为10⁸pfu/mL～10¹⁴pfu/mL；

步骤三：洗脱靶病毒

反复洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体，使所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物；靶病毒从复合体上洗脱后留下的印迹孔穴，可用于特异性结合靶病毒，使得所述的抗病毒分子印迹聚合物具有抗病毒效果；

其中，所述载体材料为纳米级微球、微米级微球或滤膜，如二氧化硅微球、四氧化三铁纳米微球、硝酸纤维滤膜等；当载体材料为微球时，步骤一和步骤二中可通过离心的方法弃掉缓冲液；当载体材料为滤膜时，步骤一和步骤二中可通过直接取出滤膜的方法弃掉缓冲液。

作为进一步优选地，过硫酸铵与多巴胺的摩尔比为2:1。

作为进一步优选地，Tris-HCl缓冲溶液的PH值为7.5。

作为进一步优选地，所述靶病毒为f2噬菌体、T4噬菌体、流感病毒或手足口病病毒。

作为进一步优选地，步骤三的具体方法为：先用洗涤液洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体4次～8次，每次30min～50min，再用三蒸水洗涤4次～8次，每次30min～50min，即得到抗病毒分子印迹聚合物；

所述洗涤液为，含有质量分数为3％的醋酸以及摩尔浓度为1mol/L的NaCl的水溶液。

本发明还提供了一种利用该方法制备的抗病毒分子印迹聚合物。

本发明还提供了一种再生该抗病毒分子印迹聚合物的方法，其特征在于，将所述抗病毒分子印迹聚合物置于纯水中超声震荡20min～40min，更换纯水并重复4次～8次。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、通过将载体材料表面修饰多巴胺，保证了抗病毒分子印迹聚合物的制备效率和特异性；

2、使用过硫酸铵对抗病毒分子印迹聚合物的制备条件进行优化，使修饰了多巴胺聚合物的载体材料与靶病毒结合的过程，在pH值友好的条件下进行，靶病毒不易变形，保证了抗病毒分子印迹聚合物对靶病毒的特异性识别能力；

3、用该方法制备的抗病毒分子印迹聚合物重生方法简单，经过多次循环后仍然有着优良的性能，可以降低使用成本，具有较好的经济效益；

4、该抗病毒分子印迹聚合物可在多种pH值，氯化钠浓度以及比粘度的溶液中依然保持良好的吸附性，适用于多种环境条件；

5、该抗病毒分子印迹聚合物对红细胞、人胚肝细胞无明显毒性。

附图说明

图1是本发明一种抗病毒分子印迹聚合物(MIP)的制备方法的流程图；

图2为实施例和对比例中，当催化剂过硫酸铵与多巴胺在不同的摩尔比之下制备的抗病毒分子印迹聚合物(MIP)和空白印迹聚合物(NIP)的吸附容量；

图3为实施例1、实施例2中制备的抗病毒MIP以及对比例1、对比例2制备的NIP的扫描电镜和透射电镜图；

图4为实施例1中制备的抗病毒MIP、对比例1中制备的NIP以及硅胶颗粒的傅里叶变换红外光谱；

图5为实施例1中制备的抗病毒MIP的吸附动力学曲线以及对不同噬菌体的吸附容量特性；

图6a-图6d分别为实施例1中制备的抗病毒MIP在不同的pH值、NaCl浓度、聚乙二醇浓度以及使用循环数的情况下的吸附容量特性；

图7a为不同浓度抗病毒MIP的抑制靶病毒感染性；图7b为不同浓度抗的病毒MIP和NIP抑制靶病毒增殖的时间曲线；

图8a和图8b为不同浓度抗病毒MIP和NIP分别对红细胞和HepG2细胞活性的影响；

图9为实施例1、实施例6、实施例7、实施例8中制备的不同抗病毒MIP以及对比例1中制备的NIP抑制相应靶病毒感染性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1f2噬菌体抗病毒分子印迹聚合物(MIP)的制备

步骤一：载体的表面修饰

将过硫酸铵与多巴胺以2:1的摩尔比溶于pH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液中成为多巴胺缓冲液；将二氧化硅微球作为载体材料加入部分多巴胺缓冲液中，室温下暴露于空气中缓慢搅拌进行反应，12小时后离心弃掉反应液，得到多巴胺-二氧化硅复合体；

在所述反应液中，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为2mg/mL和1.5mg/mL，二氧化硅微球的浓度为15mg/mL；

步骤二：病毒与载体的结合

将步骤一中所得的多巴胺-二氧化硅复合体与步骤一中另外一部分多巴胺缓冲液混匀，然后加入靶病毒f2噬菌体使得所述靶病毒在缓冲液中的浓度为10⁸pfu/mL，将上述混合溶液室温下暴露于空气中缓慢搅拌12小时，令靶病毒与多巴胺-二氧化硅复合体结合，离心弃掉反应液即得到f2噬菌体-多巴胺-二氧化硅复合体；

步骤三：洗脱靶病毒

使用洗涤液(含有质量分数为3％冰乙酸以及摩尔浓度为1mol/L的NaCl的水溶液)反复洗涤步骤二制得的复合体6次，每次30min～50min，再用三蒸水震荡洗涤6次，每次30min～50min，即得到可与f2噬菌体结合的抗病毒MIP。其制备流程原理可见图1。

实施例2

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中不加入过硫酸铵。

实施例3

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为2mg/mL和1mg/mL，摩尔比为3:1。

实施例4

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为2mg/mL和2mg/mL，摩尔比为3:2。

实施例5

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为2mg/mL和2.25mg/mL，摩尔比为4:3。

实施例6T4噬菌体抗病毒MIP的制备

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤二中的模板病毒为T4噬菌体。

实施例7流感抗病毒MIP的制备

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤二中的模板病毒为流感病毒。

实施例8手足口病抗病毒MIP的制备

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤二中的模板病毒为手足口病病毒。

实施例9

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中的载体材料为磷脂微球，Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为40mg/mL和30mg/mL，磷脂微球的浓度为150mg/mL；步骤一和步骤二中的搅拌时间都为10小时，步骤三中的洗涤次数和震荡次数都为4次。

实施例10

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中的载体材料为四氧化三铁纳米微球，多巴胺和过硫酸铵的浓度分别为0.2mg/mL和0.1mg/mL，四氧化三铁纳米微球的浓度为1mg/mL。

实施例11

步骤一：载体的表面修饰

将过硫酸铵与多巴胺以2:1的摩尔比溶于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中成为多巴胺缓冲液；将一部分多巴胺缓冲液浸没放在容器中的硝酸纤维滤膜，室温下暴露于空气中缓慢搅拌48小时后取出滤膜，得到多巴胺-硝酸纤维滤膜复合体；

步骤二：病毒与载体的结合

将多巴胺-硝酸纤维滤膜复合体放入另一部分多巴胺缓冲液使之完全浸没，然后加入靶病毒f2噬菌体使得所述靶病毒在缓冲液中的浓度为10¹⁴pfu/mL，将上述混合溶液室温下暴露于空气中缓慢搅拌48小时，令靶病毒与多巴胺-硝酸纤维滤膜复合体结合，取出滤膜，得到f2噬菌体-多巴胺-硝酸纤维滤膜复合体；

步骤三：洗脱靶病毒

使用洗涤液(含有质量分数为3％冰乙酸以及摩尔浓度为1mol/L的NaCl的水溶液)反复浸泡洗涤步骤二制得的复合体8次，每次30min～50min，再用三蒸水震荡洗涤8次，每次30min～50min，即得到可与f2噬菌体结合的抗病毒MIP滤膜。

对比例1空白印迹聚合物(NIP)的制备

按所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤二中不加入模板病毒。

对比例2

按所述的相同步骤重复实施例2，区别在于，步骤二中不加入模板病毒。

对比例3

按所述的相同步骤重复实施例3，区别在于，步骤二中不加入模板病毒。

对比例4

按所述的相同步骤重复实施例4，区别在于，步骤二中不加入模板病毒。

对比例5

按所述的相同步骤重复实施例5，区别在于，步骤二中不加入模板病毒。

试验例1反应参数优化

将各实施例中制备的抗病毒MIP以及各对比例中制备的NIP各10mg分别加入浓度为10³pfu/mL的f2噬菌体的缓冲液中，室温下震摇，反应12小时后取上清液，利用双层琼脂平板法测定上清中噬菌体f2的含量，计算每克颗粒的结合量(吸附容量＝(起始噬菌体量-吸附后上清噬菌体量)/颗粒重量)。每个浓度平行测定3次取平均值，结果见图2。

图2a为实施例1、实施例2中制备的抗病毒MIP以及对比例1、对比例2中制备的NIP对噬菌体f2的吸附容量，可看到使用了过硫酸铵的MIP吸附容量提高了两倍以上，可知催化剂过硫酸铵的使用是成功制备抗病毒MIP的关键。

图2b为实施例1、实施例3、实施例4、实施例5以及对比例1、对比例3、对比例4、对比例5中，当多巴胺与过硫酸铵按不同摩尔比例混合时，制备的抗病毒MIP和NIP的吸附容量。从图上可以看出，当多巴胺与过硫酸铵的摩尔比为2:1时，抗病毒MIP的吸附性能最佳。

试验例2理化性质分析

从图3可见，扫描电镜显示实施例1中制备的抗病毒MIP(图3a)与对比例1中制备的NIP(图3b)均为膜状物，无明显区别；而透射电镜显示抗病毒MIP(图3c)与NIP(图3d)的厚度都在40nm左右；但抗病毒MIP表面有圆形的印迹孔穴，NIP表面则无，此位点即为用于特异性结合病毒的印迹孔穴。

使用傅里叶变换红外光谱对实施例1制备的抗病毒MIP与对比例1中制备的NIP进行分析。由图4可以看出，与硅胶相比，抗病毒MIP与NIP在3100cm^-1，1600cm^-1、1000cm^-1、880cm^-1和650cm^-1处都具有5个明显的红外吸收峰，分别代表C-H的伸缩振动，芳烃的骨架振动，N-H的面外弯曲振动，C-H的面外弯曲振动以及O-H的面外弯曲振动，与多巴胺的特征峰一致，证实了抗病毒MIP中含有多巴胺分子。

试验例3抗病毒MIP的吸附特性

将10mg实施例1中制备的抗病毒MIP或对比例1中制备的NIP分别加入含10³pfu/mLf2噬菌体的缓冲液中，室温下震荡，分别在反应0.5h、1h、2h、3h、6h、9h时停止震荡，并取上清液，利用双层琼脂平板法测定上清中噬菌体f2的含量，计算每克颗粒的结合量(吸附容量＝(起始噬菌体量－吸附后上清噬菌体量)/颗粒重量)。每个浓度平行测定3次取平均值，测定结果见图5a。图上显示，抗病毒MIP可以在30min内达到吸附平衡，抗病毒MIP对靶病毒f2噬菌体的吸附量显著高于NIP。由于f2噬菌体的繁殖周期为40分钟左右，只有较快达到吸附平衡的抗病毒MIP才能在噬菌体繁殖前有效吸附噬菌体，使吸附的噬菌体无法感染靶细菌，最终产生抗病毒效能。

将10mg上述抗病毒MIP或NIP分别加入10³pfu/mL的f2噬菌体及相同浓度的T4噬菌体、M13噬菌体、P1噬菌体以及4种噬菌体的混合液的缓冲液中，室温下震摇2h，用双层琼脂培养法测定上清中各噬菌体的浓度(pfu/mL)，并计算抗病毒MIP或NIP对各种噬菌体的结合量(pfu/mg)。由图5b可见，抗病毒MIP对f2噬菌体的吸附远远高于其他噬菌体，即使是在竞争性吸附实验中，抗病毒MIP对f2、M13、T4、P1混合溶液中的f2噬菌体依然保持了很高的特异性吸附。在三种其他大肠杆菌噬菌体中，抗病毒MIP只对结构比较类似的噬菌体P1有一定的吸附，对其他两种噬菌体几乎没有吸附。这是因为抗病毒MIP主要通过印迹孔穴保持对靶病毒有特异性吸附，这种吸附特异性不受干扰物的影响。

试验例4抗病毒MIP在不同环境条件下的吸附特性

病毒颗粒在中性条件下能最好地保持形态和活性的稳定性，因此前期实验中的缓冲液pH均为7。但MIP可能在不同pH的环境下使用。为验证pH对抗病毒MIP吸附特性的影响，将10mg实施例1中制备的抗病毒MIP和对比例1中制备的NIP加入含10³pfu/mL f2噬菌体的缓冲液中，缓冲液的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算吸附量。从图6a可见，抗病毒MIP在pH为6.0～8.0的范围内对f2噬菌体的吸附保持稳定。过高或过低的pH均会影响病毒分子的结构，从而干扰抗病毒MIP对靶病毒的识别和结合能力。

将10mg上述抗病毒MIP和NIP加入含10³pfu/mL f2噬菌体的缓冲液中，缓冲液还分别含有不同浓度的氯化钠，室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算吸附量。可从图6b中看出，在氯化钠溶液中，抗病毒MIP对噬菌体f2的吸附能力维持在25pfu/mL～32pfu/mL之间，并未随着氯化钠浓度的增加而下降，表现出良好的抗盐干扰性能。

血液是具有一定粘稠度的液体。为了模拟血液的粘稠环境，聚乙二醇(PEG8000)被加入到SM缓冲溶液(NaCl 5.8g,MgSO₄·7H₂O 2g,pH值为7.5的1mol/L的Tris-HCL缓冲液50mL，2％的明胶5mL溶解于去离子水，最后定容至1L)中来增加其粘稠度。用旋转式黏度计对该缓冲液的比粘度进行测量，切变率在20s^－1，温度为37℃时，其比粘度在16～18之间，与血液的比粘度接近。将10mg上述抗病毒MIP和NIP加入含10³pfu/mL f2噬菌体的缓冲液中，缓冲液还分别含有5％、10％、15％、20％的聚乙二醇。室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算病毒MIP的吸附量。图6c显示，抗病毒MIP对f2噬菌体的吸附容量在不同浓度PEG8000的缓冲液中均为36pfu/mg～40pfu/mg。虽然PEG8000对病毒颗粒的具有良好的亲和力和粘性，但并不能干扰抗病毒MIP对靶病毒的特异性吸附能力。证明本发明所制备的抗病毒MIP适合在血液等粘稠的液体中使用。

将已经吸附了f2噬菌体的上述抗病毒MIP和NIP，置于纯水中震荡30分钟并重复6次，再次测定其吸附特性；再震荡重生，再测定吸附特性，分别测定第0次、第2次、第4次和第6次循环后的吸附容量，实验结果如图6d所示。从图上可以看出，经去离子水洗涤再生的抗病毒MIP，连续使用6个循环，MIP的吸附能力并未发生明显下降。

试验例5抗病毒MIP的抗感染特性

利用病毒感染靶细胞形成的噬菌斑数量，检测被抗病毒MIP吸附的病毒是否具有对宿主菌的感染能力。不同浓度实施例1中制备的抗病毒MIP或对比例1中制备的NIP(10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL)与200uL含200pfu f2噬菌体的缓冲液反应2h后，双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(pfu/mL)，并计算吸附量(pfu/mg)。图7a显示，在f2噬菌体的浓度为10³pfu/mL条件下，随着抗病毒MIP浓度增加，其抗病毒感染性能增强，呈现明显的剂量-效应关系；而阴性对照NIP浓度与抗病毒感染能力无相关性。这是因为被抗病毒MIP吸附的噬菌体无法再感染其宿主大肠杆菌，因此抗病毒MIP可显著降低病毒的感染性，用于预防病毒感染，如图1所示。

在200uL含200pfu f2噬菌体的缓冲液中，分别加入10mg/mL和20mg/mL的上述抗病毒MIP和NIP，在不同时间停止反应，并利用双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(pfu/mL)以及并计算吸附量(pfu/mg)。描绘不同条件下噬菌体的时间增殖曲线。图7b显示，抗病毒MIP组相比于NIP组与空白对照组(只加入f2噬菌体,不加入抗病毒MIP和NIP)，噬菌体到达增殖平台期的时间被推迟，呈现剂量依赖性生长延迟效应，而NIP组与空白对照组的生长曲线近乎吻合，说明抗病毒MIP可有效减缓噬菌体的生长，而NIP则无此效应。只有在随着时间的推移，噬菌体的增殖超过抗病毒MIP的吸附容量时，噬菌体f2的数量才逐渐恢复。

试验例6抗病毒MIP的细胞毒性

将10mg/ml实施例1中制备的抗病毒MIP或对比例1中制备的NIP加入小鼠红细胞中，4℃孵育30min后，15000g离心5min，上清液稀释10倍后，分光光度计测541nm吸光值。质量分数为1％的聚乙二醇辛基苯基醚作为阳性对照，生理盐水为阴性对照。结果如图8a所示，表明无论抗病毒MIP或NIP均未引起红细胞溶血。

将不同浓度的抗病毒MIP和NIP(0,0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL,5mg/mL,10mg/mL)加入HepG2细胞,暴露24小时后，MTT法测定细胞的存活率。图8b显示抗病毒MIP组和NIP组对HepG2细胞无明显毒性。

图8表明用过硫酸铵作为氧化剂制备的抗病毒MIP不会引起明显的细胞毒效应，具有良好的生物兼容性，在生物医学领域具有应用价值。

试验例7不同抗病毒MIP抑制相应靶病毒感染性

将实施例1、实施例6、实施例7、实施例8中制备的抗病毒MIP或对比例1中制备的NIP，分别以10mg/mL和40mg/mL的浓度与200uL含200pfu病毒的缓冲液混合，反应2h后，双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(pfu/mL)，并计算吸附量(pfu/mg)。图7显示各种病毒的抗MIP均对靶病毒有很好的特异性结合能力。因此本发明所公开的抗病毒MIP制备方法适用于包括人类病毒在内的多种病毒，在控制病毒的感染和增殖中有很好的应用前景。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：首先，在过硫酸铵的催化下，将载体材料表面修饰多巴胺纳米膜，形成多巴胺-载体材料复合体；然后，将靶病毒与多巴胺-载体材料复合体相结合，形成病毒-多巴胺-载体材料复合体；最后从所述复合体上将所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物；

抗病毒分子印迹聚合物表面有所述靶病毒洗脱后形成的印迹孔穴，用于特异性结合所述靶病毒。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一：载体的表面修饰

向多巴胺缓冲液中加入载体材料，缓慢搅拌充分反应后弃掉缓冲液，即得到多巴胺-载体材料复合体；

其中，所述载体材料为纳米级微球、微米级微球或滤膜；

步骤二：病毒-多巴胺-载体材料复合体的生成

向所述多巴胺缓冲液中加入所述多巴胺-载体材料复合体和靶病毒，缓慢搅拌充分反应后弃掉缓冲液，即得到病毒-多巴胺-载体材料复合体；

所述靶病毒在缓冲液中的浓度为10⁸pfu/mL～10¹⁴pfu/mL；

步骤三：洗脱靶病毒

反复洗涤所述病毒-多巴胺-载体材料复合体，使所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，过硫酸铵与多巴胺的摩尔比为2:1。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲溶液的 pH值为7.5。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料为二氧化硅微球。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述靶病毒为f2噬菌体、T4噬菌体、流感病毒或手足口病病毒。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体方法为：先用洗涤液洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体4次～8次，每次30min～50min，再用三蒸水洗涤4次～8次，每次30min～50min，即得到抗病毒分子印迹聚合物；

8.一种利用权利要求1所述方法制备的抗病毒分子印迹聚合物。

9.一种再生如权利要求8所述抗病毒分子印迹聚合物的方法，其特征在于，将所述抗病毒分子印迹聚合物置于纯水中超声震荡20min～40min，更换纯水并重复4次～8次。