CN101503731A

CN101503731A - 一种农药残毒快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN101503731A
Application number: CNA2009100380368A
Authority: CN
Inventors: 余建飞
Original assignee: DONGGUAN CITY LVJIAN ORGANISM SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Dongguan Heng Heng Testing Technology Co., Ltd.
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2029-03-19
Also published as: CN101503731B

Abstract

本发明涉及农药残毒快速检测试剂盒，尤其是含乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶混合物的农药残毒快速检测试剂盒，由胆碱酯酶，底物，显色剂5，5’－二硫代－2，2’－二硝基苯甲酸(DTNB)和磷酸缓冲液组成，所述胆碱酯酶为含有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的混合物；所述底物含碘化硫代丁酰胆碱。

Description

一种农药残毒快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及农药残毒快速检测试剂盒，尤其是含乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶混合物的农药残毒快速检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着农药在粮食、蔬菜和水果种植中的广泛应用，频频发生农药中毒伤害、死亡事故。尤其是，随着我国农产品出口量的增加，由于农药残留超标，被拒收、扣留、退货、销毁、索赔和终止合同的现象时有发生，许多传统大宗出口创汇农产品被迫退出了国际市场。因此，发展农药残毒检测技术，大力加强我国农产品中农药残留检测技术尤其是快速检测技术的研究已刻不容缓。

目前，也开发了一些具有农药残毒检测功能的试剂盒，例如：申请号为02159668.9，名称为农药残毒检测试剂盒、其制备方法的中国专利，揭示了一种包括乙酰胆碱酯酶、保护剂、底物与显色剂的试剂盒；申请号为2004100053611.9，名称为蔬菜农药残留速测纸卡及其制备方法，揭示了一种从人血清中提取的乙酰胆碱酯酶酶片来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留；申请号为200510090386.0，发明名称为农药残毒快速检测用液体酶试剂及其制备方法与使用方法，揭示了用乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶之一来检测有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。

应用这些试剂盒在一定程度上解决了检测农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的问题，然而，这些试剂盒灵敏度不高，酶极易失活，推广困难。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种农药残毒快速检测试剂盒，其酶活性高、灵敏性好、准确性好、稳定性好，且检测方便，可广泛应用于各级食品放心工程检测机构、蔬菜批发市场、蔬菜生产基地、农贸市场、超市及学校、工厂、机关食堂等。

本发明是通过如下技术方法实现的：一种农药残留快速检测试剂盒，由胆碱酯酶、底物、显色剂5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸(DTNB)和磷酸缓冲液组成，所述胆碱酯酶为含有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的混合物；所述底物为碘化硫代丁酰胆碱(BTCI)或溴化硫代丁酰胆碱或氯化硫代丁酰胆碱或其中两种或三种的混合物。

所述胆碱酯酶中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的质量比例为15～30％:70～85％。

所述胆碱酯酶中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的质量比例为20％:80％。

所述胆碱酯酶为粉剂。

所述胆碱酯酶中还含有稳定剂甘露醇或聚乙烯吡咯烷酮。

所述稳定剂甘露醇或聚乙烯吡咯烷酮在胆碱酯酶中的含量为5％。

为了更好地理解本发明的实质，以下将结合具体实验，进一步描述本发明试剂盒中胆碱酯酶的灵敏度，稳定性，以及本发明试剂盒的快速检测条件和农药浓度和检测本底对检测结果的影响，并比较了液相色谱检测结果和本试剂盒检测结果。

一、胆碱酯酶试剂灵敏度比较

为了比较本发明和其他胆碱酯酶对有机磷农药残毒检测的灵敏性，本发明选择用于检测农药残毒的市售乙酰胆碱酯酶试剂盒中的乙酰胆碱酯酶(以下简称市售乙酰胆碱酯酶)与自制胆碱酯酶试剂盒中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的混合物(以下试验中均选择乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶的质量比例为20:80，以下简称自制胆碱酯酶混合物)，在同等条件下，进行数种农药酶抑制率测试。由于市面上目前还没有用于检测农药残毒的丁酰胆碱酯酶试剂盒，因此与丁酰胆碱酯酶的比较，未能进行。

具体实验如下

材料：市售乙酰胆碱酯酶、自制胆碱酯酶混合物；市售农药甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷。

步骤：每种农药用蒸馏水分别配制成0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.20μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL等七种浓度；取等活力的市售胆碱酯酶和自制胆碱酯酶混合物与上述各种浓度的农药进行酶抑制率测试实验。实验结果如表1所示。

表1 市售乙酰胆碱酯酶和自制胆碱酯酶混合物对农药抑制率测试实验结果

从上述实验可以看出，自制胆碱酯酶混合物，较之市售乙酰胆碱酯酶具有更好的灵敏度。

二、本发明试剂盒中胆碱酯酶混合物的稳定性研究

1、放置温度和稳定剂对酶稳定性的影响

1)稳定剂的加入方法

把经纯化干燥的胆碱酯酶混合物干粉溶入含有5％稳定剂甘露醇(计为稳定剂A)或聚乙烯吡咯烷酮(计为稳定剂B)的溶液，然后再冷冻干燥制得含稳定剂的酶干粉。

2)实验方法：把不含稳定剂和加有稳定剂的酶干粉用密封塑料瓶包装，分别在-18℃、4℃和33℃保存，测定酶活力△A随保存时间的变化情况。酶活力测定方法采用标准方法。

表2-1列出了不加稳剂和分别加稳定剂A和B的实验结果，为了使结果更加一目了然，表中结果制成折线图1A，1B和1C。

表2-1 温度和稳定剂对酶稳定性影响结果表

从表2和图1A，图1B，图1C可以看出，在-18℃下保存，加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化趋势没有明显差异。放置360天后，其酶活力损失分别为39％和25％。而在4℃和33℃下放置酶活性损失差异明显。在4℃下，不加稳定剂时，放置约25天其活力损失一半，放置3个月后基本无活力，而加入稳定剂B在4℃下放置360天后，酶活力还有原来的70％。在33℃时，稳定剂的作用更明显，不加稳定剂，酶在33℃下放置约15天活力基本消失，而加入稳定剂B后其活力仍有原来的86％，30天后其活力仍有原来的73％。可见加入稳定剂B后对酶的活性起了很好的保护作用。由于稳定剂的加入使酶在常温条件下也能保持很好的稳定，这就消除了用户在购买此试剂盒时担心在运输和使用放置过程中酶活性损失而失效的担忧，为该酶的推广应用提供了一个很好的保证。

3)酶溶液稳定性实验由于酶法测农药残毒时均需用冲稀释以后才使用，酶在冲液中的稳定性自然也就成了使用者关心的问题。为回答此问题，我们按活力测定方法用磷酸缓冲液稀释酶粉，分别置于4℃和33℃下保存，测定了酶活力在一个星期内的变化情况，其结果如表2-2和图1D和1E所示。

表2-2 酶稀释液保存测试结果表

从表2-2和图1D，图1E可以看出，在4℃时，不论是否加有稳定剂，酶溶液在24小时内活性损失不大于15％。96小时以内，其活力仍符合使用要求，加5％稳定剂B的酶稀释液在4℃保存1个星期(168小时)仍有效。

综合以上结果，可以看出温度对活性的影响非常大，酶保存温度愈低，其有效保存时间也就越长，因此我们应尽可能在低温下保存酶。另外，稳定剂对酶有明显的稳定作用，因此应加入稳定剂延长酶的保存时间和使用寿命。另外，同样条件下保存酶溶液比酶干粉更易失活，稳定剂对溶液中的酶没有明显的稳定作用。

三、快速检测体系的建立与使用

材料与方法

(1)仪器与药品

721型分光光度计，秒表，电热恒温水浴锅，50μl微量进样器，碘化硫代丁酰胆碱，二硫双对硝基苯甲酸DTNB(Sigma公司产品)，自制胆碱酯酶混合物，蒸馏水，其他所用试剂均为分析纯。

(2)实验方法

试剂配制：

磷酸盐缓冲液：用0.1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，在pH计监控下，分别配制pH为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0的磷酸缓冲液。

胆碱酯酶溶液：取60mg胆碱酯酶混合物(乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶的质量比例为20:80)干粉溶于8毫升pH8.0的磷酸缓冲液。

BTCI溶液：取100mgBTCI溶于10毫升pH为8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

DTNB溶液：取60mgDTNB溶于10毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

实验步骤1：磷酸缓冲液pH值与胆碱酯酶混合物活力关系

如表3-1所示，取9支洁净的试管，依次编号为0，1，2，3，...，8，9；向0号试管中加入3.0ml pH值8.0的磷酸盐缓冲液，分别向1，2，3，...，8，9试管中依次加入3.0ml pH值为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0的磷酸盐缓冲液；在向上述试管中各加入50μl DTNB溶液，50μl胆碱酯酶液，混匀，在37℃下保温30分钟，加入50μl BTCI溶液，立即用721型分光光度计，在412nm处测定A值，记录3分钟前后A值。0号试管不加入BTCI，加入50μl蒸馏水作为空白调零。每个样品重复三次。

3-1 磷酸缓冲液的pH值与胆碱酯酶活力关系实验操作表

实验结果见图2A，从图中可以看出以pH值为7.5～8.5时所得到的A值最大，即在磷酸缓冲液pH值为7.5～8.5时，酶的活力处于最佳状态。

以下实验均以pH 8.0的磷酸缓冲液为反应体系。

实验步骤2：测定时间与胆碱酯酶活力关系

在干净试管中加入3.0ml pH8.0的磷酸缓冲液，50μl DTNB，50μl胆碱酯酶。在37℃下保温30分钟后，加入50μl BTCI，立即在分光光度计上进行测定，记录0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360秒时的读数。每个处理重复三次。实验结果如图3-2所示。

从图2B可知在前180秒反应速度基本呈线形关系，此后反应速度逐渐减慢，渐趋饱和。在反应前180秒结果具有可比性，而且反应时间也短，适合快速检测样品的要求，因此选择180秒作为观测终点。

实验步骤3：保温温度与胆碱酯酶活力关系

如表3-2所示，取8支洁净的试管，依次编号为0，1，2，3，...，8；分别加入pH为8.0的磷酸缓冲液3.0ml，50μl DTNB溶液，50μl酶液，0号试管分别在20℃下保温30分钟后，1，2，3，...，8号试管分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下保温30分钟后，加入50μl BTCI溶液，立即用721B分光光度计，在412nm处测定A值，记录3分钟前后A值。0号试管不加入BTCI，加入50μl蒸馏水作为空白调零。每个样品重复三次。

3-2 保温温度与胆碱酯酶活力关系实验操作表

实验结果见图2C，在不同温度下胆碱酯酶的活力表现出明显不同。在35℃左右表现出最高活力，在低温段，温度对酶活力的影响比较温和；而在高温段，温度对酶活力的影响比较明显，在40℃以上酶活力损失较严重，这与胆碱酯酶对热不稳定的性质是一致的；反应体系选择保温温度37℃是比较合理的。

实验步骤4：底物浓度与反应速度的关系

如表3-3所示，取8支洁净的试管，依次编号为0，1，2，3，...，8；依次分别加入pH8.0的磷酸缓冲液3.05，3.045，3.04，3.03，3.01，3.00，2.95，2.85ml，再加入50μl DTNB溶液、50μl酶液，混匀后在37℃下保温30分钟，然后依次加入0ul，5μl、10μl、20μl、40μl、50μl、100μl、200μl的BTCI溶液，使试管内反应体系总量都为3.15ml。立即用721型分光光度计，在412nm处测定A值。每个样品重复三次。

3-3 底物浓度与反应速度的关系实验操作表

实验结果如图2D，底物在低浓度时，反应速度随底物浓度的增大而增大，而超过一定限度时，底物反而对酶活力表现出一定的抑制作用。从实验结果来看，50ul的底物已能满足实验要求，故选择50ul作为底物添加量。

实验步骤5：胆碱酯酶酶量与反应速度的关系

如表3-4所示，取8支洁净的试管，依次编号为0，1，2，3，...，8；依次分别加入pH8.0的磷酸缓冲液3.05，3.045，3.04，3.03，3.01，3.00，2.95，2.85ml，再加入50μl DTNB溶液、然后加入0μl，5μl、10μl、20μ1、40μl、50μl、100μl、200μl的胆碱酯酶，混匀后在37℃下保温30分钟，然后依次加入50μl的BTCI溶液，使试管内反应体系总量都为3.15ml。立即用721型分光光度计，在412nm处测定A值。每个样品重复三次。

3-4 胆碱酯酶酶量与反应速度的关系实验操作表

实验结果如图2E所示，随着酶量的增加反应速度相应增加，但当酶量达到100μl时，出现拐点现象，反应速度增加变慢，此时表明酶量相等于反应中的底物量来说已过量。50μl酶量的反应速度已能完全满足农药残留检测的需要，故以50μl酶作为试验添加量。

根据以上结果分析，在加入显色剂(DTNB)50μl的情况下，应用本胆碱酯酶快速检测农药残度的最佳条件是：pH8.0的磷酸盐缓冲液；反应温度37℃；50μl的底物(BTCI)；50μl酶溶液；反应时间180秒。

3)使用方法：根据《中华人民共和国农业行业标准NY/T448—2001蔬菜类有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法》，使用上述快速检测体系检测蔬菜类有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法及检测结果的计算和判断标准如下：

取样

用不锈钢管取样器取来自不同植株叶片(至少8-10片叶子)的样本；果菜从表皮至果肉1-1.5处取样。

检测过程

取2g切碎的样本(非叶菜类取4g)，放入提取瓶内，加入20ml缓冲液，震荡1-2min，倒出提取液，静止3-5min；于小试管内分别加入50μL酶，3mL样本提取液，50μL显色剂，于37-38℃下放置30min后再分别加入50μL底物，倒入比色杯中，用仪器进行测定。

检测结果计算

检测结果按式(1)计算：

式中：Ac——对照组3min后与3min前吸光值之差；

As——样本3min后与3min前吸光值之差。

抑制率≥70％时，蔬菜中含有某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残毒。此时样本要有2次以上重复检测，几次重复检测的重现性应在80％以上。

四、试剂盒中胆碱酯酶对农药的灵敏性试验

1)酶活性与抑制率的关系

根据《中华人民共和国农业行业标准NY/T448—2001蔬菜是有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法方法》的要求，对胆碱酯酶的活力△A值要控制在0.4～0.8之间，那么不同批次的酶，或酶在保存，运输过程中△A值的下降对检测结果的判定有无影响，我们选择△A值在0.3～0.9的酶5支，分别测试甲胺磷和呋喃丹不同浓度对酶的抑制率。

表4-1 使用不同浓度农药对测试抑制率的影响结果表

由表4-1可以看出，同一浓度的甲胺磷或呋喃丹标准液对不同△A值的酶抑制率是非常接近的，从统计学分析，抑制率之间无显著差异。这个结果说明，在运输或保存过程中酶的活力发生变化，但只要△A值仍在0.4～0.8之间，则检测时对样品农药残留的判断并不会产生偏差。

2)酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏性试验

利用生物化学的酶抑制法检测的是有机磷和氨基甲酸酯类农药的多残留总和，对具体的农药种类其敏感性之间存在差异，为了了解不同种农药对酶抑制率的差异，我们选择了5种有机磷类农药和5种氨基甲酸酯类农药进行了试验。实验方法是先把目标农药用磷酸缓冲液配成一系列浓度，然后各取3毫升于试管中，加入50μl酶和50μl显色剂，分别培养10分钟和30分钟，取出加入底物50μl，记录抑制率。每一浓度农药平行测定三次，取平均值。实验结果汇总在表4-2和表4-3，为了直观起见，也绘出了各农药浓度与抑制率关系的折线图，如图3A，图3B，图3C，图3D，图3E，图3F，图图3G，图3H，图3I，图3J所示。

表4-2 酶对几种有机磷类农药灵敏度试验结果表

4-3 酶对几种氨基甲酸酯类农药灵敏度试验结果表

从以上图表可以看出，虽然农药对酶活性的抑制灵敏度不一样，但趋势是一样的，即农药浓度越高，酶活性被抑制率也就越大。另外，酶抑制率小于70％时，各农药对酶活性的抑制随浓度变化较大，而当抑制率大于70℃时，抑制率随农药浓度的变化趋于平缓。换言之，以70％抑制率为检测方法的判断参数可以避免假阳性的产生。从以上图表结果还可看出，不同培养时间农药对酶活性的抑制率虽然不一样，培养时间长，抑制率值大，但它们抑制率的变化趋势是相同的，因此，改变判断参数抑制率的值以缩短检测时间是可行的。

五、样品本底对检测结果的影响

为了了解样品本底对检测结果的影响，我们比较了无污染蔬菜中加入农药标准品和相对应的无本底农药标准品对酶的抑制率，共实验了4种蔬菜和6种有代表性的农药。实验结果如表5-1，表5-2，表5-3，表5-4，表5-5所示，为了直观起见，也绘出了各农药浓度与抑制率关系的折线图，如图4A，图4B，图4C，图4D，图4E，图4F，图4G，图4H，图4I，图4J，图4K，图4L所示。

表5-1 甲胺磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

表5-2 呋喃丹对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

表5-3 毒死蜱对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

表5-4 对硫磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

表5-5 氧化乐果对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

表5-5 甲拌磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果

从以上4种蔬菜和6种农药的实验结果可以看出，样品本底对测试抑制率结果还是有一定影响，尤其是在抑制率小于60％时，影响更大，而当抑制率大于70％时，本底对抑制率结果影响不大，因此本方法规定抑制率大于70％，可以预见本底对检测结果影响不大。

六、本法检测结果和气相色谱结果比较

为了检验我们制定的快速检测方法的准确性，试验比较了不同批次样品本方法结果和气相色谱分析结果，数据如下表6-1，6-2，6-3所示，从表中可看出，我们的结果和气相色谱分析结果相当吻合。

综合上述实验和分析结果，本试剂盒的灵敏性、准确性和稳定性均符合《中华人民共和国农业行业标准NY/T448—2001蔬菜类有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法》，制备简单，使用方便，适用于各级食品放心工程检测机构、蔬菜批发市场、蔬菜生产基地、农贸市场、超市及学校、工厂、机关食堂等。

表6-1 比较不同批次样品本发明试剂盒与气相色谱分析结

采样日期：2002.10.21 分析日期：2002.10.22 分析方法：外标法计算公式：C_(mg/kg)＝(m*v)/(w*n)

表6-2 比较不同批次样品本发明试剂盒与气相色谱分析结果

采样日期：2002.10.22 分析日期：2002.10.23 分析方法：外标法计算公式：C_(mg/kg)＝(m*v)/(w*n)

表6-3 比较不同批次样品本发明试剂盒与气相色谱分析结果

附图说明

图1A.在-18℃下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图。

图1B.在4℃下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图。

图1C.在33℃下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图。

图1D.在4℃下加稳定剂和不加稳定剂酶溶液活性随保存时间的变化图。

图1E.在33℃下加稳定剂和不加稳定剂酶溶液活性随保存时间的变化图。

图2A.磷酸缓冲液pH值对胆碱酯酶活力的影响。

图2B.测定时间与胆碱酯酶反应速度的关系。

图2C.保温温度对胆碱酯酶活力的影响。

图2D.底物浓度对胆碱脂酶活力测定的影响。

图2E.酶量对胆碱酯酶活力的影响。

图3A甲胺磷浓度与抑制率关系的折线图。

图3B氧化乐果浓度与抑制率关系的折线图。

图3C久效磷浓度与抑制率关系的折线图。

图3D对硫磷浓度与抑制率关系的折线图。

图3E甲拌磷浓度与抑制率关系的折线图。

图3F抗蚜威浓度与抑制率关系的折线图。

图3G速灭威浓度与抑制率关系的折线图。

图3H仲丁威浓度与抑制率关系的折线图。

图3I西维因浓度与抑制率关系的折线图。

图3J呋喃丹浓度与抑制率关系的折线图。

图4A.10分钟内甲胺磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4B.30分钟内甲胺磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4C.10分钟内呋喃丹对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4D.30分钟内呋喃丹对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4E.10分钟内毒死蜱对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4F.30分钟内毒死蜱对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4G.10分钟内对硫磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4H.30分钟内对硫磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4I.10分钟内氧化乐果对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4J.30分钟内氧化乐果对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4K.10分钟内甲拌磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

图4L.30分钟内甲拌磷对酶的抑制率受样品本底影响实验结果。

具体实施方式

实施例1

一种农药残毒试剂盒，包括

磷酸盐缓冲液，pH8.0：用0.1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，在pH计监控下配制。

胆碱酯酶粉剂，其中乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶的质量比例为20:80，使用时，取60mg胆碱酯酶粉剂溶于8毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

底物：使用时，100mg碘化硫代丁酰胆碱，溶于10毫升pH为8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

显色液：取60mgDTNB溶于10毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

实施例2

一种农药残毒试剂盒，包括

磷酸盐缓冲液，pH7.5：用0.1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，在pH计监控下配制。

胆碱酯酶溶液，其中乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶的质量比例为30:70。配制方法为：取60mg胆碱酯酶粉剂溶于8毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

底物溶液：使用时，取100mg碘化硫代丁酰胆碱和溴化硫代丁酰胆碱的混合物，溶于10毫升pH为8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

显色液：配制方法为：取60mgDTNB溶于10毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

实施例3

一种农药残毒试剂盒，包括

胆碱酯酶粉剂，其中乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶与甘露醇的质量比例为15:80:5，使用时，取68.4mg胆碱酯酶粉剂溶于8毫升pH8.0的磷酸缓冲液。

底物：使用时，取100mg碘化硫代丁酰胆碱和溴化硫代丁酰胆碱和氯化硫代丁酰胆碱的混合物溶于10毫升pH为8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

显色液：取60mgDTNB溶于10毫升pH8.0的磷酸缓冲液，4℃保存。

实施例4

一种农药残毒试剂盒，包括

胆碱酯酶粉剂，其中乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶与聚乙烯吡咯烷酮的质量比例为15:80:5，使用时，取68.4mg胆碱酯酶粉剂溶于8毫升pH8.0的磷酸缓冲液。

底物：使用时，取100mg溴化硫代丁酰胆碱和氯化硫代丁酰胆碱的混合物溶于10毫升pH为8.0的磷酸缓冲液。

显色液：取60mgDTNB溶于10毫升pH8.0的磷酸缓冲液。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。

Claims

1、一种农药残留快速检测试剂盒，由胆碱酯酶，底物，显色剂5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸和磷酸缓冲液组成，其特征在于，所述胆碱酯酶为含有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的混合物；所述底物为碘化硫代丁酰胆碱或溴化硫代丁酰胆碱或氯化硫代丁酰胆碱或其中两种或三种的混合物。

2、如权利要求1所述的农药残留快速检测试剂盒，其特征在于，所述胆碱酯酶中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的质量比例为15～30％:70～85％。

3、如权利要求1所述的农药残留快速检测试剂盒，其特征在于，所述胆碱酯酶中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的质量比例为20％:80％。

4、如权利要求1所述的农药残留快速检测试剂盒，其特征在于，所述胆碱酯酶为粉剂。

5、如权利要求1所述的农药残留快速检测试剂盒，其特征在于，所述胆碱酯酶中还含有稳定剂甘露醇或聚乙烯吡咯烷酮。

6、如权利要求6所述的农药残留快速检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂甘露醇或聚乙烯吡咯烷酮在胆碱酯酶中的含量为5％。