CN105158240A - 铁酸铜/石墨烯量子点复合材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种铁酸铜/石墨烯量子点复合材料及其制备方法和用途，该材料在比色法检测领域中具有很好的应用，尤其适用于比色法检测有机磷农药。通过先分别制备石墨烯量子点和铁酸铜，再将二者混合，利用静电吸附作用制备出CuFe2O4/GQDs复合材料。该复合材料另外，复合材料具有优异的电导率、良好的电子传输性能，催化效果显著增强，检测灵敏度进一步增强，同时由于GQDs表面带有一定量的亲水基团，因此GQDs的结合更易于CuFe2O4/GQDs在水中的分散。检测有机磷农药的方法使用了显色更灵敏且无致癌性的显色底物TMB，使用的CuFe2O4/GQDs纳米复合材料具有磁性，能够通过物理方法很简便地分离回收利用，符合绿色化学理念。
Description
技术领域
本发明涉及合成一种铁酸铜/石墨烯量子点(CuFe2O4/GQDs)磁性类似过氧化物酶活性的碳基纳米复合材料及其制备方法和用途，该材料在比色法检测领域中具有很好的应用，尤其适用于比色法检测有机磷农药。
背景技术
近年来，由于农药的大量和广泛的使用，大量农药残留在农产品中，不易分解，通过饮食，最终进入人的体内，农药残留问题给人类的生产和生活带来了巨大的危害，严重影响了消费者的身心健康。因此，有机磷农药残留的检测研究意义重大，研制一种高效、简便、准确、灵敏、低价的农药生物传感器迫在眉睫。
有机磷农药检测方法理论上大致分为光谱法、酶抑制法、活体生物测定法、色谱法及联用技术等。其中气相色谱(GC)，气相色谱-质谱联用(GC-MS)，高效液相色谱(HPLC)，高效液相色谱—质谱联用等技术手段是检测农药残留的传统的权威方法，但是这些技术手段耗时长、预处理复杂、分析仪器价格昂贵、还需要专业操作人员，不适合田间作业，尤其在紧急情况下。有研究者利用分子印迹电化学传感检测农药，虽然具备较高的专一性，但是预处理复杂，模板分子的制备耗时且移除不尽，对后者农药残留检测有影响。基于酶抑制法制备的农药生物传感器由于酶促反应灵敏迅速，成为农药残留快速检测技术研究热点。酶被抑制后活性的变化通常可以用放射性法、荧光法、电化学、比色法和化学发光法检测，但是除比色法以外这些方法操作流程复杂，耗时，涉及专业的后处理，此外它们还需要复杂昂贵的图像设备和相应的识别的软件。
基于酶抑制原理的农药比色检测法与上述方法相比，前处理简单，所用设备少，操作简单，技术成熟，成本低廉，能实现快速准确的检测，具备更多的优势。酶抑制比色法检测农药主要分为三个环节，分别是酶抑制反应、显色反应、吸光度测量。酶抑制反应原理是农药抑制乙酰胆碱酶催化底物乙酰胆碱分解生成中间胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化下生成中间产物H2O2(过氧化氢)；显色反应原理是前一个反应生成的中间产物H2O2，在过氧化物酶催化下加速氧化底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色。检测农药的酶抑制比色法主要是把农药对酶的抑制率大小转化为显色反应颜色强弱，通过测量颜色对应的吸光度值来反推酶抑制率大小，进而计算出农药浓度。
近年来，许多学者探索人工合成纳米材料(类似过氧化物酶材料)，来近似替代过氧化物酶催化显色反应。如利用Fe3O4纳米材料验证类似过氧化物酶特性，农药浓度越大，酶抑制率也越大，反应产生的H2O2越少，显色会越弱，Fe3O4具有类似过氧化物酶催化特性，通过催化中间产物H2O2加速氧化底物TMB显色，显色效果更佳，有效地把农药对酶抑制率的大小转化显色反应颜色强弱，成功应用于基于酶抑制法的农药比色检测。虽然上述纳米材料(类过氧化物酶材料)虽然具有类似过氧化物酶催化特性，但是其催化能力还比较弱，显色反应速度慢、显色不明显、吸光度值不够高，会影响农药检测灵敏度和精度。
本发明涉及合成一种新型类似过氧化酶复合材料，即CuFe2O4/GQDs，GQDs包裹球状CuFe2O4，增大比表面积，提供了更多的活性中心，使得该材料与上述类过氧化物酶单体材料相比，在农药比色检测的显色反应中，催化性能大大增强，显色速度更快、显色更明显，对应测量的吸光度值更大，更灵敏的反映农药对酶抑制率的大小，有效地提高了农药检测灵敏度和检测极限。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型复合材料CuFe2O4/GQDs，该材料在比色法检测有机磷农药中具有灵敏度高，检测速度快等优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种铁酸铜/石墨烯量子点复合材料CuFe2O4/GQDs，所述CuFe2O4/GQDs复合材料是由质量比为1:99～10:90的GQDs和CuFe2O4复合而成；5～10nm的所述GQDs纳米颗粒均匀覆盖于所述CuFe2O4颗粒的表面，所述CuFe2O4颗粒为直径是50～100nm的球形。
所述铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的制备方法如下：
步骤1、GQDs的制备：取固体柠檬酸加热熔化，在搅拌下，滴入碱性溶液调节PH为6～8，继续恒温加热，制备成GQDs溶液；
步骤2、CuFe2O4的制备：称取CuCl2·2H2O和FeCl3·6H2O加溶解到乙二醇中，搅拌均匀，随后加入醋酸钠和聚乙二醇搅拌均匀，恒温热反应，冷却至室温得到黑色产物，离心、清洗、干燥后最终得到CuFe2O4；
步骤3、CuFe2O4/GQDs的制备：称取步骤2中制备的CuFe2O4加入到步骤1中制备的GQDs溶液中分散均匀，静置，离心分离得到固体沉淀，清洗，干燥即得到CuFe2O4/GQDs复合物。
所述步骤1中，所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液，所述熔化温度为150～250℃。
所述步骤2中，所述乙二醇溶液中CuCl2·2H2O的浓度为6.75～13.5mg/mL，CuCl2·2H2O和FeCl3·6H2O的物质的量比为1:2，所述醋酸钠的浓度为70～110mg/mL，聚乙二醇的浓度为15～35mg/mL，所述恒温温度为150～250℃，所述恒温时间为6～10h。
所述铁酸铜/石墨烯量子点复合材料用于比色法检测有机磷农药。
所述铁酸铜/石墨烯量子点复合材料用于比色法检测有机磷农药，包括如下步骤：
步骤A、H2O2浓度与反应体系吸光度的对应关系：将含有TMB的磷酸缓冲溶液PBS分别和梯度浓度的H2O2溶液混合均匀反应；然后加入CuFe2O4/GQDs分散液，混合均匀并反应，反应后磁性分离反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录含不同浓度H2O2反应溶液的吸光度，绘制标准曲线；
步骤B、酶抑制反应和双酶催化反应：取固体乙酰胆碱酯酶AchE与不同浓度的有机磷农药混合液A反应后将农药排掉，将所述排掉农药后的乙酰胆碱酯酶干燥后加入至含有胆碱氧化酶(ChOx)和乙酰胆碱的PBS中，形成混合液B，温育；
步骤C、有机磷农药的浓度与吸光度的对应关系：将含有TMB和CuFe2O4/GQDs的PBS，分别加入到步骤B温育后的溶液中混合均匀并反应，反应完成后磁性分离反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系。
所述步骤A中，所述CuFe2O4/GQDs分散液体积:磷酸缓冲溶液体积:H2O2溶液体积为1:40:5，CuFe2O4/GQDs分散液中CuFe2O4/GQDs的浓度为2～5mg/mL，磷酸缓冲溶液中TMB的浓度为0.375～0.875mg/mL，H2O2溶液浓度为10-6～100mM；反应温度为32～38℃，反应时间为10～20min。
所述步骤B中，所述有机磷农药混合液A与乙酰胆碱酯酶的用量比为200μL:0.5mg，所述有机磷农药的浓度为0～10μM，所述PBS溶液体积与所述有机磷农药混合液A体积相等，所述PBS溶液中乙酰胆碱的浓度为1.5～4mg/mL，所述PBS溶液中胆碱氧化酶的浓度为1.5～4mg/mL；所述温育温度为32～38℃，温育时间为10～20min。
所述步骤C中，所述PBS溶液体积是所述步骤B中混合液B体积的4倍，所述PBS溶液中TMB的浓度为0.375～0.875mg/mL，CuFe2O4/GQDs分散液中CuFe2O4/GQDs的浓度为2～5mg/mL。
所述步骤A、B、C中，所述PBS溶液浓度均为1M，pH均为3～5。
本发明涉及合成一种新型铁酸铜/石墨烯量子点(CuFe2O4/GQDs)磁性类似过氧化物酶活性的碳基纳米复合材料，并基于酶抑制原理，构建一套对有机磷农药残留的比色检测方法，其特色和优点表述如下：
(1)将CuFe2O4和GQDs采用静电吸附，CuFe2O4单体纳米材料中掺杂GQDs，形成的新型复合材料CuFe2O4/GQDs，GQDs包裹着球状CuFe2O4，具有较大的比表面积，也提供了更多的活性中心；CuFe2O4和GQDs之间具有协同作用，相比其他的类过氧化物酶材料，具有更高的催化性能。另外，复合材料具有优异的电导率、良好的电子传输性能，催化效果显著增强，检测灵敏度进一步增强，同时由于GQDs表面带有一定量的亲水基团，因此GQDs的结合更易于CuFe2O4/GQDs在水中的分散。
(2)该方法使用了显色更灵敏且无致癌性的显色底物TMB，使用的CuFe2O4/GQDs纳米复合材料具有磁性，能够通过物理方法很简便地分离回收利用，符合绿色化学理念。
(3)乙酰胆碱酯酶催化分解乙酰胆碱生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化下产生中间产物H2O2，H2O2在类过氧化物酶纳米复合材料CuFe2O4/GQDs催化下加速氧化显色底物TMB显色，显色速度更快、显色更明显、吸光度值更大，根据酶抑制原理，当有机磷农药加入能抑制乙酰胆碱酯酶催化活性，乙酰胆碱分解量减少，产物胆碱减少，中间产物H2O2也减少，显色反应颜色减弱，根据吸光度反推H2O2量，再反推有机磷农药量，应用于有机磷农药残留检测，能有效提高检测速度、灵敏度、精度，并降低检测限，最终实现对有机磷农药残留的快速、高效、灵敏检测。
(4)证酶被抑制的唯一的原因只有机磷农药，另外将农药排出，排出农药后能够排除农药对后续所用试剂的干扰而影响最终的检测结果。
(5)与其他检测方法相比，所构建的有机磷农药的比色检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备便宜，灵敏度高，检测成本低廉，便于可视化等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备材料的XRD图谱，a为CuFe2O4单体的XRD图谱，b为CuFe2O4/GQDs复合材料的XRD图谱，c为CuFe2O4的标准卡片；
图2为本发明实施例1所制备的CuFe2O4/GQDs复合材料的的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中与不同浓度的有机磷农药反应后的乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱后对TMB显色的吸光度图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施1：
一、材料制备
(1)GQDs的制备：取2g固体柠檬酸(CA)加入容积为5mL烧杯中，加热到200℃，柠檬酸(CA)熔化成液体，随后，柠檬酸(CA)液体从无色变到淡黄色，最后变成橙色液体。最后在剧烈的搅拌下，将浓度为1MNaOH溶液逐滴滴入橙色液体中，直至pH达到7，继续加热，最后制备成GQDs溶液，所得GQDs溶液质量为m。
(2)CuFe2O4的制备：首先将0.2025gCuCl2·2H2O和0.4875gFeCl3·6H2O加入到20mL乙二醇(EG)中，搅拌至透明溶液，随后加入1.8g醋酸钠(NaAc)和0.5g聚乙二醇(PEG)搅拌30min，装入容量25mL的聚四氟反应釜，加热至200℃维持8h，反应后冷却至室温得到黑色产物，离心并用乙醇多次清洗，在温度为60℃下持续干燥6h，最终得到CuFe2O4。
(3)CuFe2O4/GQDs的制备：称取95mgCuFe2O4加入到(m/400)gGQDs溶液，分散均匀，静置12h，使CuFe2O4和GQDs通过静电作用充分吸附；将所得的固体离心分离得到固体沉淀，并分别用二次蒸馏水、乙醇洗涤3次，最后在45℃下真空干燥24h，即得到CuFe2O4/GQDs复合材料。
二、吸光度与H2O2的浓度对应关系
H2O2浓度与吸光度的对应关系：首先将800μL含有0.5mgTMB的0.1MPBS(pH＝4)分别和100μL梯度浓度(1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mM)的H2O2混合均匀，然后分别加入20μL4mg/mL的CuFe2O4/GQDs溶液，混合均匀后在37℃下温育15min。最后，通过磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
三、有机磷农药的检测
(1)酶抑制反应和双酶催化反应：每次称取0.5mg的乙酰胆碱酯酶分别与不同浓度(0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM)的有机磷农药常温下反应，排掉农药，并干燥排掉农药后的乙酰胆碱酯酶，干燥后将乙酰胆碱酯酶加入到200μL含有0.5mg的胆碱氧化酶(ChOx)和0.5mg乙酰胆碱的PBS(0.1M，pH＝4)并混合均匀，在37℃下，温育反应15min。
(2)有机磷残留浓度与吸光度的对应关系：800μL含0.5mgTMB和20μL4mg/mLCuFe2O4/GQDs的PBS(0.1M，pH＝4)，分别加入到步骤(1)温育后的溶液中，混合均匀，在37℃下温育15min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系，绘制标准曲线，得到在5×10–5～10μM有机磷农药范围内呈线性关系，检测限为1.67×10–5μM。
实施2：
一、材料制备
(1)GQDs的制备：取1g固体柠檬酸(CA)加入容积为5mL烧杯中，加热到150℃，柠檬酸(CA)熔化成液体，随后，柠檬酸(CA)液体从无色变到淡黄色，最后变成橙色液体。最后在剧烈的搅拌下，将浓度为1MKOH溶液逐滴滴入橙色液体中，直至pH达到6，继续加热，最后制备成GQDs溶液，所得GQDs溶液质量为m。
(2)CuFe2O4的制备：首先将0.135gCuCl2·2H2O和0.325gFeCl3·6H2O加入到20mL乙二醇(EG)中，搅拌至透明溶液，随后加入1.4g醋酸钠(NaAc)和0.3g聚乙二醇(PEG)搅拌30min，装入容量25mL的聚四氟反应釜，加热至150℃维持6h，反应后冷却至室温得到黑色产物，离心并用乙醇多次清洗，在温度为60℃下持续干燥6h，最终得到CuFe2O4。
(3)CuFe2O4/GQDs的制备：称取99mgCuFe2O4加入到(m/1000)gGQDs溶液中，分散均匀，静置12h，使CuFe2O4和GQDs通过静电作用充分吸附；将所得的固体离心分离得到固体沉淀，并分别用二次蒸馏水、乙醇洗涤3次，最后在45℃下真空干燥24h，即得到CuFe2O4/GQDs复合材料。
二、吸光度与H2O2的浓度对应关系
H2O2浓度与吸光度的对应关系：首先将800μL含有0.3mgTMB的0.1MPBS(pH＝4)分别和100μL梯度浓度(1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mM)的H2O2混合均匀，然后分别加入20μL2mg/mL的CuFe2O4/GQDs溶液，混合均匀后在32℃下温育10min。最后，通过磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
三、有机磷农药的检测
(1)酶抑制反应和双酶催化反应：每次称取0.3mg的乙酰胆碱酯酶分别与不同浓度(0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM)的有机磷农药常温下反应，排掉农药，并干燥排掉农药后的乙酰胆碱酯酶，干燥后将乙酰胆碱酯酶加入到200μL含有0.3mg的胆碱氧化酶(ChOx)和0.3mg乙酰胆碱的PBS(0.1M，pH＝4)并混合均匀，在32℃下，温育反应10min。
(2)有机磷残留浓度与吸光度的对应关系：800μL含0.5mgTMB和20μL4mg/mLCuFe2O4/GQDs的PBS(0.1M，pH＝4)，分别加入到步骤(1)温育后的溶液中，混合均匀，在37℃下温育15min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系，绘制标准曲线，得到在10–4～10μM有机磷农药范围内呈线性关系，检测限为3.3×10–5μM。
实施3
一、材料制备
(1)GQDs的制备：取4g固体柠檬酸(CA)加入容积为5mL烧杯中，加热到250℃，柠檬酸(CA)熔化成液体，随后，柠檬酸(CA)液体从无色变到淡黄色，最后变成橙色液体。最后在剧烈的搅拌下，将浓度为1MNaOH溶液逐滴滴入橙色液体中，直至pH达到8，继续加热，最后制备成GQDs溶液，所得GQDs溶液质量为m。
(2)CuFe2O4的制备：首先将0.27gCuCl2·2H2O和0.65gFeCl3·6H2O加入到20mL乙二醇(EG)中，搅拌至透明溶液，随后加入2.2g醋酸钠(NaAc)和0.7g聚乙二醇(PEG)搅拌30min，装入容量25mL的聚四氟反应釜，加热至250℃维持10h，反应后冷却至室温得到黑色产物，离心并用乙醇多次清洗，在温度为60℃下持续干燥6h，最终得到CuFe2O4。
(3)CuFe2O4/GQDs的制备：称取90mgCuFe2O4加入到(m/400)gGQDs溶液中，分散均匀，静置12h，使CuFe2O4和GQDs通过静电作用充分吸附；将所得的固体离心分离得到固体沉淀，并分别用二次蒸馏水、乙醇洗涤3次，最后在45℃下真空干燥24h，即得到CuFe2O4/GQDs复合材料。
二、吸光度与H2O2的浓度对应关系
H2O2浓度与吸光度的对应关系：首先将800μL含有0.7mgTMB的0.1MPBS(pH＝4)分别和100μL梯度浓度(1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mM)的H2O2混合均匀，然后分别加入20μL5mg/mL的CuFe2O4/GQDs溶液，混合均匀后在38℃下温育20min。最后，通过磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
三、有机磷农药的检测
(1)酶抑制反应和双酶催化反应：每次称取0.8mg的乙酰胆碱酯酶分别与不同浓度(0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM)的有机磷农药常温下反应，排掉农药，并干燥排掉农药后的乙酰胆碱酯酶，干燥后将乙酰胆碱酯酶加入到200μL含有0.8mg的胆碱氧化酶(ChOx)和0.8mg乙酰胆碱的PBS(0.1M，pH＝4)并混合均匀，在38℃下，温育反应20min。
(2)有机磷残留浓度与吸光度的对应关系：800μL含0.7mgTMB和20μL5mg/mLCuFe2O4/GQDs的PBS(0.1M，pH＝4)，分别加入到步骤(1)温育后的溶液中，混合均匀，在38℃下温育20min。然后，通过外磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系，绘制标准曲线，得到在10–3～1μM有机磷农药范围内呈线性关系，检测限为3.3×10–3μM。
实施例4
一、材料制备
(1)GQDs的制备：取1g固体柠檬酸(CA)加入容积为5mL烧杯中，加热到150℃，柠檬酸(CA)熔化成液体，随后，柠檬酸(CA)液体从无色变到淡黄色，最后变成橙色液体。最后在剧烈的搅拌下，将浓度为1MNaOH溶液逐滴滴入橙色液体中，直至pH达到6，继续加热，最后制备成GQDs溶液，所得GQDs溶液质量为m。
(2)CuFe2O4的制备：首先将0.135gCuCl2·2H2O和0.325gFeCl3·6H2O加入到20mL乙二醇(EG)中，搅拌至透明溶液，随后加入1.4g醋酸钠(NaAc)和0.3g聚乙二醇(PEG)搅拌30min，装入容量25mL的聚四氟反应釜，加热至150℃维持6h，反应后冷却至室温得到黑色产物，离心并用乙醇多次清洗，在温度为60℃下持续干燥6h，最终得到CuFe2O4。
(3)CuFe2O4/GQDs的制备：称取99mgCuFe2O4加入到(m/1000)gGQDs溶液中，分散均匀，静置12h，使CuFe2O4和GQDs通过静电作用充分吸附；将所得的固体离心分离得到固体沉淀，并分别用二次蒸馏水、乙醇洗涤3次，最后在45℃下真空干燥24h，即得到CuFe2O4/GQDs复合材料。
二、吸光度与H2O2的浓度对应关系
H2O2浓度与吸光度的对应关系：首先将800μL含有0.5mgTMB的0.1MPBS(pH＝4)分别和100μL梯度浓度(1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mM)的H2O2混合均匀，然后分别加入20μL4mg/mL的CuFe2O4/GQDs溶液，混合均匀后在37℃下温育15min。最后，通过磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
三、有机磷农药的检测
(1)酶抑制反应和双酶催化反应：每次称取0.5mg的乙酰胆碱酯酶分别与不同浓度(0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM)的有机磷农药常温下反应，排掉农药，并干燥排掉农药后的乙酰胆碱酯酶，干燥后将乙酰胆碱酯酶加入到200μL含有0.5mg的胆碱氧化酶(ChOx)和0.5mg乙酰胆碱的PBS(0.1M，pH＝4)并混合均匀，在37℃下，温育反应15min。
(2)有机磷残留浓度与吸光度的对应关系：800μL含0.5mgTMB和20μL4mg/mLCuFe2O4/GQDs的PBS(0.1M，pH＝4)，分别加入到步骤(1)温育后的溶液中，混合均匀，在37℃下温育15min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系，绘制标准曲线，得到在5×10–4～10μM有机磷农药范围内呈线性关系，检测限为1.67×10–4μM。
实施例5
一、材料制备
(1)GQDs的制备：取4g固体柠檬酸(CA)加入容积为5mL烧杯中，加热到250℃，柠檬酸(CA)熔化成液体，随后，柠檬酸(CA)液体从无色变到淡黄色，最后变成橙色液体。最后在剧烈的搅拌下，将浓度为1MNaOH溶液逐滴滴入橙色液体中，直至pH达到8，继续加热，最后制备成GQDs溶液，所得GQDs溶液质量为m。
(2)CuFe2O4的制备：首先将0.27gCuCl2·2H2O和0.65gFeCl3·6H2O加入到20mL乙二醇(EG)中，搅拌至透明溶液，随后加入2.2g醋酸钠(NaAc)和0.7g聚乙二醇(PEG)搅拌30min，装入容量25mL的聚四氟反应釜，加热至250℃维持10h，反应后冷却至室温得到黑色产物，离心并用乙醇多次清洗，在温度为60℃下持续干燥6h，最终得到CuFe2O4。
(3)CuFe2O4/GQDs的制备：称取90mgCuFe2O4加入到(m/400)gGQDs溶液中，分散均匀，静置12h，使CuFe2O4和GQDs通过静电作用充分吸附；将所得的固体离心分离得到固体沉淀，并分别用二次蒸馏水、乙醇洗涤3次，最后在45℃下真空干燥24h，即得到CuFe2O4/GQDs复合材料。
二、吸光度与H2O2的浓度对应关系
H2O2浓度与吸光度的对应关系：首先将800μL含有0.5mgTMB的0.1MPBS(pH＝4)分别和100μL梯度浓度(1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mM)的H2O2混合均匀，然后分别加入20μL4mg/mL的CuFe2O4/GQDs溶液，混合均匀后在37℃下温育15min。最后，通过磁铁去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
三、有机磷农药的检测
(1)酶抑制反应和双酶催化反应：每次称取0.5mg的乙酰胆碱酯酶分别与不同浓度(0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM)的有机磷农药常温下反应，排掉农药，并干燥排掉农药后的乙酰胆碱酯酶，干燥后将乙酰胆碱酯酶加入到200μL含有0.5mg的胆碱氧化酶(ChOx)和0.5mg乙酰胆碱的PBS(0.1M，pH＝4)并混合均匀，在37℃下，温育反应15min。
(2)有机磷残留浓度与吸光度的对应关系：800μL含0.5mgTMB和20μL4mg/mLCuFe2O4/GQDs的PBS(0.1M，pH＝4)，分别加入到步骤(1)温育后的溶液中，混合均匀，在37℃下温育15min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系，绘制标准曲线，得到在10–3～10μM有机磷农药范围内呈线性关系，检测限为3.3×10–3μM。
图1为本发明实施例1所制备材料的XRD图谱，a为CuFe2O4单体的XRD图谱，b为CuFe2O4/GQDs复合材料的XRD图谱，c为CuFe2O4的标准卡片；
图2为本发明实施例1所制备的CuFe2O4/GQDs复合材料的的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中检测有机磷农药的吸光度图谱。
图1为本发明实施例1所制备材料的XRD图谱，发现无论是CuFe2O4单体还是CuFe2O4/GQDs复合材料，均出现了与标准图谱相对应的衍射峰，说明CuFe2O4单体的制备和复合材料中CuFe2O4的存在，同时b曲线中，在2θ＝26°附近还出现了石墨烯量子点的特征峰，说明复合材料中石墨烯量子点的存在。进一步的，图2中可以清晰的观察到，在直径为50～100nm的球形CuFe2O4颗粒表面均匀覆盖有5～10nm的石墨烯量子点颗粒。由于石墨烯量子点覆盖于铁酸铜表面，当石墨烯量子点量较少时，不能起到很好的传导作用；而如果石墨烯量子点量过大，会将铁酸铜颗粒完全包埋，同样在检测中不能起到很好的效果；因此，在实验过程中，石墨烯量子点与铁酸铜质量比为5:95时达到了最好的检测效果。
图3是实施例1中与不同浓度的有机磷农药反应后的乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱后对TMB显色的吸光度图谱，所用有机磷农药的浓度依次为0、5×10–5、10–4、5×10–4、10–3、10–2、10–1、1、10μM。可以看出，有机磷农药的浓度越大，根据酶抑制原理，有机磷农药对乙酰胆碱酯酶催化活性抑制作用越明显，乙酰胆碱分解量减少，产物胆碱减少，最终的中间产物H2O2也减少，显色反应颜色也就越弱。
Claims (10)
1.一种铁酸铜/石墨烯量子点复合材料CuFe2O4/GQDs，其特征在于，所述CuFe2O4/GQDs复合材料是由质量比为1:99～10:90的GQDs和CuFe2O4复合而成；5～10nm的所述GQDs纳米颗粒均匀覆盖于所述CuFe2O4颗粒的表面，所述CuFe2O4颗粒为直径是50～100nm的球形。
2.一种制备权利要求1所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的方法，其特征在于，制备方法如下：
步骤1、GQDs的制备：取固体柠檬酸加热熔化，在搅拌下，滴入碱性溶液调节PH为6～8，继续恒温加热，制备成GQDs溶液；
步骤2、CuFe2O4的制备：称取CuCl2·2H2O和FeCl3·6H2O加溶解到乙二醇中，搅拌均匀，随后加入醋酸钠和聚乙二醇搅拌均匀，恒温热反应，冷却至室温得到黑色产物，离心、清洗、干燥后最终得到CuFe2O4；
步骤3、CuFe2O4/GQDs的制备：称取步骤2制备中的CuFe2O4加入到步骤1中制备的GQDs溶液中分散均匀，静置，离心分离得到固体沉淀，清洗，干燥即得到CuFe2O4/GQDs复合物。
3.根据权利要求2所述的一种制备铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的方法，其特征在于，步骤1中，所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液，所述熔化温度为150～250℃。
4.根据权利要求2所述的一种制备铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的方法，其特征在于，步骤2中，所述乙二醇溶液中CuCl2·2H2O的浓度为6.75～13.5mg/mL，CuCl2·2H2O和FeCl3·6H2O的物质的量比为1:2，所述醋酸钠的浓度为70～110mg/mL，聚乙二醇的浓度为15～35mg/mL，所述恒温温度为150～250℃，所述恒温时间为6～10h。
5.根据权利要求1所述的一种所述铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，所述铁酸铜/石墨烯量子点复合材料用于比色法检测有机磷农药。
6.根据权利要求5所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，使用方法包括如下步骤：
步骤A、H2O2浓度与反应体系吸光度的对应关系：将含有TMB的磷酸缓冲溶液PBS分别和梯度浓度的H2O2溶液混合均匀反应；然后加入CuFe2O4/GQDs分散液，混合均匀并反应，反应后磁性分离反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下分别测量并记录含不同浓度H2O2反应溶液的吸光度，绘制标准曲线；
步骤B、酶抑制反应和双酶催化反应：取固体乙酰胆碱酯酶AchE与不同浓度的有机磷农药混合液A反应后将农药排掉，将所述排掉农药后的乙酰胆碱酯酶干燥后加入至含有胆碱氧化酶(ChOx)和乙酰胆碱的PBS中，形成混合液B，温育；
步骤C、有机磷农药的浓度与吸光度的对应关系：将含有TMB和CuFe2O4/GQDs的PBS，分别加入到步骤B温育后的溶液中混合均匀并反应，反应完成后磁性分离反应体系中的CuFe2O4/GQDs，拍照观察颜色变化，并在652nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立有机磷农药浓度与吸光度的对应关系。
7.根据权利要求6所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，步骤A中，所述CuFe2O4/GQDs分散液体积:磷酸缓冲溶液体积:H2O2溶液体积为1:40:5，CuFe2O4/GQDs分散液中CuFe2O4/GQDs的浓度为2～5mg/mL，磷酸缓冲溶液中TMB的浓度为0.375～0.875mg/mL，H2O2溶液浓度为10-6～100mM；反应温度为32～38℃，反应时间为10～20min。
8.根据权利要求6所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，步骤B中，所述有机磷农药混合液A与乙酰胆碱酯酶的用量比为200μL:0.5mg，所述有机磷农药的浓度为0～10μM，所述PBS溶液体积与所述有机磷农药混合液A体积相等，所述PBS溶液中乙酰胆碱的浓度为1.5～4mg/mL，所述PBS溶液中胆碱氧化酶的浓度为1.5～4mg/mL；所述温育温度为32～38℃，温育时间为10～20min。
9.根据权利要求6所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，步骤C中，所述PBS溶液体积是所述步骤B中混合液B体积的4倍，所述PBS溶液中TMB的浓度为0.375～0.875mg/mL，CuFe2O4/GQDs分散液中CuFe2O4/GQDs的浓度为2～5mg/mL。
10.根据权利要求6所述的铁酸铜/石墨烯量子点复合材料的用途，其特征在于，步骤A、B、C中，所述PBS溶液浓度均为1M，pH均为3～5。
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