CN104655695A

CN104655695A - 一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器

Info

Publication number: CN104655695A
Application number: CN201510072397.XA
Authority: CN
Inventors: 孙秀兰; 蒋卉; 张银志
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104655695B

Abstract

本发明公开了一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器，属于致病菌快速检测技术领域。本发明通过将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化学传感技术相结合而构建一类新型磁性分子印迹电化学传感器，同时具备分子印迹技术的特异性、磁分离技术的可再生性和分离快速性、电化学分析的快速性和灵敏性，能准确地进行低含量的革兰氏阴性菌信号分子的检测。本发明还公开了该磁性分子印迹电化学传感器的制备方法以及运用，可实现对部分革兰氏阴性菌的间接检测，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低廉，适用于食品工业和医疗行业等领域检测革兰氏阴性菌。

Description

一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器

技术领域

本发明涉及一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器，属于致病菌快速检测技术领域。

背景技术

食品中的肠道致病菌，是引起人类食源性疾病的主要原因之一，是人类健康的一大杀手。熟肉类食品、面包糕点，极易直接引起食源性疾病，而水产类食品，因受到水中各种微生物的污染和侵袭，也是引起人类食源性疾病的一大隐患。食品中的肠道菌多属于革兰氏阴性菌(Gram-negative)，最常见的有沙门菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌、产气夹膜杆菌和副溶血性弧菌等。革兰氏阴性菌，泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。

而预防致病菌的危害，首要条件是能够快速准确地检测出食品是否受产致病菌的污染。目前，致病菌的检测方法主要包括传统的检测方法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR及RT-PCR技术、DNA探针技术等。传统的检测方法包括增菌培养筛选及后续计数检测、生化反应鉴定或血清学鉴定等环节，这些传统方法技术成熟、准确性高、所需设备简单，但实验操作繁琐，检测周期长，准备和收尾工作繁重、特异性不足、灵敏度低，而且需要专业操作人员等。ELISA需要特殊的仪器设备，检测步骤较为繁琐、费用高、检测时间长，且易出现假阳性。多重PCR、实时荧光定量PCR的分子水平的检测方法的发展虽然比传统方法具有优越性，但所需仪器设备昂贵、检测过程复杂、成本较高、对检测环境和操作人员专业技术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，且由于产毒基因的复杂性使此方法特异性欠佳。DNA探针技术快速、灵敏度高，但是该技术存在一定的局限性：第一，经过食物加工已经死亡的细菌或亚致死细菌，其DNA仍可能存在并被检测到，但这并不表明一定有活的致病微生物在；第二，有些致病菌引起的食物中毒是由于摄取了细菌产生的毒素所造成的，因此针对毒素基因的DNA探针或PCR方法得到的阳性结果也只表示带有这些基因序列的致病微生物存在，存在潜在产毒可能性，但并不代表一定有活的细胞存在、或基因已被表达、或已经产生了毒素。

因此建立一种有效、灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。

本发明的磁性分子印迹电化学传感器是将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化学传感技术相结合而构建的一类新型传感器。细菌群体感应(Quorum sensing，QS)是指细菌之间通过产生、释放并感知信号分子，从而进行细菌信息交流的现象。革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone，AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达，造成细菌性病害。随着对群体感应系统系统研究的深入，已经证实该信号系统在调控革兰氏阴性菌各种毒力因子表达中起重要作用。近年来更有研究提示密度感知系统本身就可能是一种毒力因子，并且可以直接作用于宿主细胞，抑制宿主免疫反应，从而导致机体更易于被感染。因此利用检测信号分子达到间接检测致病菌的目的，使得对致病菌的检测更加准确无误。由于信号分子的浓度极低，一般手段无法检测出来。目前国内外检测信号分子AHL的方法通常有4种：①理化手段，主要通过高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC－MS)技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外还能鉴定AHL的性质；②利用传感菌的生物学方法，即AHL产生菌诱导细菌生物感应器产生特征性的表型变化来检测AHL的存在，如紫色的产生和β-半乳糖苷酶的大量表达等。但不同的细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHL敏感性不同，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)对酰基侧链C-3羰基取代的AHL敏感性最强，而紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)对短链的C-3没有取代基的AHL比较敏感，由此可见一种细菌生物感应器不能检测所有的AHL分子。其次，报告菌的检测灵敏度还受报告菌本身状态的影响；③结合物理化学手段和生物发光的薄层层析；④利用免疫学方法，合成AHL半抗原衍生物和全抗原，制备AHL相应抗体，建立AHL免疫检测新方法。不同细菌产生不同的AHL信号分子(包括C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL等)，但它们具有共同的典型特征，即含有保守的高丝氨酸内酯环，因此可用其结构类似物呋喃酮制备分子印迹聚合物。分子印迹聚合物作为一种具有较高富集分离能力和特异性识别能力的材料，本发明将其应用于革兰氏阴性菌群体感应信号分子检测中，不仅检测速度比较快，并且检测结果的准确度也比较高，结合电化学还可提高检测的灵敏度。

与传统的分子印迹电化学传感器相比，本发明的新型磁性分子印迹电化学传感器通过引入磁电极和磁性纳米材料，轻松解决了电极的再生性问题，十分适合于构建电化学传感器。本发明的磁性分子印迹电化学传感器，用于检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子，具有样品处容易、所用仪器设备简单的优点，而且磁性分离的力量大、效率高，特别适合大规模操作。本发明的传感器可应用于革兰氏阴性菌群体感应信号分子的检测，从而达到间接检测革兰氏阴性菌的目的。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化学传感技术相结合而构建一类新型磁性分子印迹电化学传感器。本发明提供了一种检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用。具体是基于印迹聚合物MIPs的印迹空穴位点对目标分子具有专一的吸附识别特性，用于检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器的制备方法，包括：(1)以呋喃酮为模板分子，制备出“核-壳”结构的多功能磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP；(2)将适量所述磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP加入到样本溶液中，室温下吸附；(3)将磁性玻碳电极插入到步骤2的溶液中，吸附，然后通过磁吸附作用，实现磁性分子印迹聚合物在磁性电极表面的固定，即得到磁性分子印迹电化学传感器。

所述Fe₃O₄SiO₂-MIP的制备，在本发明的一种实施方式中，是以呋喃酮为模板分子、Fe₃O₄MNPs为内核、SiO₂外为壳，在得到的“核-壳”型磁球Fe₃O₄SiO₂表面嫁接氨基NH₂，并在氨基化的核壳型磁球Fe₃O₄SiO₂-NH₂的表面进行聚合。

所述Fe₃O₄MNPs，在本发明的一种实施方式中，通过溶剂热法制备。

所述Fe₃O₄SiO₂，在本发明的一种实施方式中，通过Stober法制备。

所述Fe₃O₄SiO₂-NH₂，在本发明的一种实施方式中，通过硅烷试剂KH550对“核-壳”型磁球表面进行接枝氨基。

所述Fe₃O₄SiO₂-MIP的制备，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)将模板分子呋喃酮：功能单体甲基丙烯酸：交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩尔比1：(1-8)：(10-30)的比例混合，加入适量乙腈中，超声；(2)按每毫摩尔模板分子，加入100-300mg的Fe₃O₄SiO₂-NH₂磁性纳米粒子，10-30mg的引发剂偶氮二异丁腈，超声至均匀；(3)在N₂氛围下，60-80℃油浴反应12-36h，反应结束后，用外部磁场富集聚合的纳米颗粒，用甲醇/乙酸溶液洗至无模板分子检测出来为止，干燥即得到Fe₃O₄SiO₂-MIP。Fe₃O₄SiO₂-NIP除不加模板分子外，其余操作同上。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中，室温下吸附是吸附5-10min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中插入磁性玻碳电极的吸附是吸附1-10min。

所述制备方法，在本发明的一种实施方式中，还包括将传感器从溶液中拿出，洗涤以去除电极表面物理性吸附物质。

本发明的第二个目的是提供一种所述方法得到的用于检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器。

本发明的第三个目的是提供一种利用所述磁性分子印迹传感器的应用。

所述应用，是用来检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是：(1)使用所述磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP对含有不同浓度的革兰氏阴性细菌的群体信号分子标准品溶液进行吸附得到磁性分子印迹电化学传感器，采用微分脉冲伏安法(DPV)测定电流，得到革兰氏阴性细菌的群体信号分子浓度与电流值的标准曲线；(2)将适量所述分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP加入到待测样本中，吸附得到待测样本的磁性分子印迹电化学传感器，采用微分脉冲伏安法(DPV)测定电流，再根据步骤1得到的标准曲线，定量待测样本中革兰氏阴性菌群体感应信号分子浓度，实现对革兰氏阴性菌的间接检测。

所述测定电流，在本发明的一种实施方式中，是将磁性分子印迹电化学传感器置于电解池底液中，设定适宜的扫描参数，进行循环伏安法(CV)和/或微分脉冲伏安法(DPV)测定。

所述电解池底液，在本发明的一种实施方式中，为含1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液。

所述微分脉冲伏安法DPV的测试条件，在本发明的一种实施方式中，为：电压扫描范围为-0.1V到0.65V，脉冲幅度为25mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为5mV，所有测试均在室温下进行。

所述革兰氏阴性细菌的群体信号分子标准品，在本发明的一种实施方式中，为C4-HSL。

以C4-HSL标准品浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，绘制峰电流与标准品浓度之间的关系曲线。实验结果显示随着C4-HSL标准品浓度的增加，其峰电流值降低。

所述标准曲线，在本发明的一种实施方式中，为：y＝-0.2417x+83.808。C4-HSL标准品浓度在2×10^-9-1.02×10^-7mol/L范围内具有良好的线性相关，线性相关系数R²＝0.9941。所述待测样品中信号分子浓度的最低检测限可达到6×10^-10mol/L。

针对嗜水气单胞菌(G-)、铜绿假单胞菌(G-)、鼠伤寒沙门氏菌(G-)、大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)检测，结果显示，任何数量的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的上清液用本发明的方法均无法检出群体感应信号分子，而在嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌的上清液中均可以检出群体感应信号分子。嗜水气单胞菌(初始接种量10³CFU/mL)培养12h后可测得其群体感应信号分子为10.0nM/10ml上清液。铜绿假单胞菌(初始接种量10³CFU/mL)培养12h后可测得其群体感应信号分子为18.8nM/10ml上清液。这是由于鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，具有检测AHL信号分子的受体，可以感受其它革兰氏阴性菌的数量，但自身并不能产生AHL信号分子，故而检测不到。而金黄色葡萄球菌本身属于革兰氏阳性菌，故而检测不到AHL信号分子。磁性分子印迹电化学传感器显示了较好的特异性，仅能检测出革兰氏阴性菌，但是受到部分革兰氏阴性菌自身不能产生群体感应信号分子的限制，本发明只能应用在部分革兰氏阴性菌的检测中。正因此，也缩小了待测样品中可能污染革兰氏阴性菌的种类，不失为一种快速的鉴别方法。

本发明的磁性分子印迹电化学传感器能够用于检测以下革兰氏阴性菌：嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等一些单胞菌及其它未知的革兰氏阴性菌。

本发明有如下的有益效果：

(1)能特异性地识别革兰氏阴性菌群体感应信号分子，并能保证检测样品为活细菌产生且该菌具有产生毒力因子的能力的特点，这是因为群体感应信号分子只能由活细菌产生，当群体感应信号分子增加到一定浓度时，可启动菌体中相关基因的表达，调控细菌的行为，如产生毒素、形成生物膜等)；

(2)利用磁电极吸附磁性纳米分子印迹聚合物构建具有高度选择性的分子印迹电化学传感器，与常规的恒电位沉积法制备分子印迹电化学传感器相比，具有电极再生性强、可重复使用、实现快速分离、操作简单等优点；

(3)磁性分子印迹电化学传感器具有特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低廉等特点，通过对信号分子的检测实现对革兰氏阴性菌的间接检测，且准确性较高；

(4)适用于食品工业和医疗行业等领域快速检测出革兰氏阴性菌，以有效地预防革兰氏阴性菌污染带来的危害。

附图说明

图1是磁性分子印迹电化学传感器制备及使用示意图；

图2是磁性分子印迹聚合物红外表征图；其中：(a)Fe₃O₄；(b)Fe₃O₄SiO₂；(c)Fe₃O₄SiO₂-MIP；(d)Fe₃O₄SiO₂-NIP；

图3是磁性分子印迹聚合物电镜表征图；其中：透射电镜：(a)Fe₃O₄；(b)Fe₃O₄SiO₂；(c)Fe₃O₄SiO₂-MIP；扫描电镜：(d)Fe₃O₄；(e)Fe₃O₄SiO₂；(f)Fe₃O₄SiO₂-MIP；

图4是磁性分子印迹电化学传感器电化学性能研究；其中：(A)裸电极(a)、吸附磁珠的电极(b)、MNIP传感器(c)、MMIP传感器模板分子去除前(d)后(e)在1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中的循环伏安图；(B)25nM C4-HSL通过MMIP吸附到电极表面产生信号的微分脉冲伏安图(a)、25nM C4-HSL通过MNIP吸附到电极表面产生信号的微分脉冲伏安图(b)、25nM C4-HSL吸附到裸电极表面产生信号的微分脉冲伏安图(c)、裸电极产生信号的微分脉冲伏安图(d)；

图5是磁性分子印迹电化学传感器对不同浓度C4-HSL标准品的DPV响应；其中：(a)0mM(b)0.025mM(c)0.05mM(d)0.1mM(e)0.2mM(f)0.4mM(g)0.8mM(h)1.6mM。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1 磁性分子印迹电化学传感器的制备

磁性分子印迹电化学传感器制备及使用示意图如图1所示。

步骤一，磁性分子印迹聚合物的制备：通过溶剂热法制备Fe₃O₄MNPs，通过Stober法制备Fe₃O₄SiO₂，通过硅烷试剂KH550对“核-壳”型磁球表面进行接枝氨基得到Fe₃O₄SiO₂-NH₂。将模板分子呋喃酮：功能单体甲基丙烯酸：交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩尔比1：(1-8)：(10-30)的比例混合，加入适量乙腈中，超声；按每毫摩尔模板分子，加入100-300mg的Fe₃O₄SiO₂-NH₂磁性纳米粒子，10-30mg的引发剂偶氮二异丁腈，超声至均匀；在N₂氛围下，60-80℃油浴反应12-36h，反应结束后，用外部磁场富集聚合的纳米颗粒，用甲醇/乙酸溶液洗至无模板分子检测出来为止，真空干燥即得到Fe₃O₄SiO₂-MIP。Fe₃O₄SiO₂-NIP除不加模板分子外，其余操作同上。得到的磁性分子印迹聚合物的红外表征结果如图2所示。

由图2(a)可以看出，在434,、582、和628cm^-1出现了Fe—O的振动带，3420cm^-1出现了Fe—OH键，证明成功合成Fe₃O₄。由图2(b)可以看出，在1098cm^-1出现了Si—O—Si的非对称振动吸收峰，证明成功在Fe₃O₄表面包覆SiO₂。由图2(c)和(d)可以看出，在4000—400cm^-1范围内出现一下吸收峰：–OH,–CH(在3600–3000cm^-1范围内),–C＝O(接近1700cm^-1)，这些吸收峰说明MIP和NIP成功接枝到Fe₃O₄SiO₂-NH₂表面。

此外，得到的磁性分子印迹聚合物的照片如图3所示。由图3可以看出，与烷基化Fe₃O₄(图3e)相比Fe₃O₄SiO₂-MIP(图3f)表面发生了明显变化，出现颗粒状的结构，进一步说明了聚合反应的成功。

步骤二，将适量磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP加入到待测样本溶液中，室温下吸附，然后将预处理后的磁性玻碳电极插入到上述溶液中，通过磁吸附作用，实现磁性分子印迹聚合物在磁性电极表面的固定，得到检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器。

实施例2 磁性分子印迹电化学传感器的电化学性能研究

本实验在1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中对磁性分子印迹电化学传感器进行了性能研究，结果如图4所示。

步骤一，由于分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP(简称MMIP)为非导电性材料，且呋喃酮及AHL为非电活性物质，所以选用铁氰化钾-亚铁氰化钾作为底液和电极之间的探针来表征磁性分子印迹电化学传感器的电化学性能。MMIP经过洗脱后，留下的印迹孔穴可为探针离子提供传质通道，当电极置于C4-HSL溶液中进行吸附时，由于印迹孔穴对C4-HSL的特异性识别，C4-HSL进入印迹孔穴中，从而阻碍了底液和玻碳电极表面之间的电子传质过程，导致电流相应信号发生相应的改变，通过以上变化可以得出铁氰化钾-亚铁氰化钾在传感器上的电流响应信号与C4-HSL浓度之间的关系。

图4(A)是裸电极和改性后电极在1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中的循环伏安图，并用氧化还原峰来评价此过程。图中曲线a和曲线b分别为裸电极和吸附磁珠的电极在铁氰化钾缓冲液中的循环伏安曲线，曲线b的峰电流稍低于曲线a，说明Fe₃O₄本身为导电性材料；曲线c是吸附模板分子洗脱前的MMIP的电极在铁氰化钾缓冲液中的循环伏安曲线，这一变化过程是由于吸附在电极表面的Fe₃O₄包覆了分子印迹膜从而增大了探针离子在电极表面上的氧化还原反应的难度，因此，曲线b的峰电流直接降低到曲线c；d是电极吸附模板分子洗脱后的MMIP在铁氰化钾缓冲液中的循环伏安曲线，该过程是将模板分子(呋喃酮)从印迹膜上洗脱下来，所形成的印迹孔穴为探针离子提供大量的传质通道，使曲线d的峰电流明显大于曲线c的峰电流；曲线e是重吸附后的循环伏安曲线，即洗脱模板分子后的传感器对C4-HSL进行重新吸附的过程，C4-HSL进入分子印迹膜上的印迹孔穴，堵塞了传质通道使得峰电流降低并接近曲线c。从曲线a、b、c、d、e的变化过程可以得出以下结论：该磁性分子印迹传感器的分子印迹膜对革兰氏阴性菌信号分子(AHL)具有特异性识别功能。同样，将非分子印迹传感器进行同样的洗脱、重吸附试验，由于非分子印迹膜上没有模板分子，洗脱前后印迹膜没有发生变化，所以其在铁氰化钾缓冲液中的循环伏安曲线几乎不变。

步骤二，建立了检测方法后，将合成的MMIP纳米材料分散于C4-HSL溶液中，吸附5-10min；经预处理后的磁性玻碳电极插入上述溶液中，吸附1-10min，从溶液中拿出，用重蒸水仔细洗涤20s出去电极表面物理性吸附物质(包括未结合的样本)。将上述处理后电极置于电解池中，在含1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中用微分脉冲伏安法测定得到一个较好的C4-HSL氧化峰，用于革兰氏阴性菌信号分子的测定。将同样的实验应用于以Fe₃O₄SiO₂-NIP(简称MNIP)作为吸附剂和MMIP与MNIP均未加入的情况下。结果见图4(B)，可看出曲线a的峰电流明显大于曲线b，说明MMIP作为吸附剂获得的峰电流明显高于MNIP作为吸附剂时。由于MNIP在聚合过程中没有加入模板分子，所以MNIP作为吸附剂产生的信号可归咎于C4-HSL在聚合物壳的表面吸附。因此，MMIP电化学传感器和MNIP电化学传感器获得的DPV信号的差别是由分子印迹膜的C4-HSL选择性位点造成的。不加入任何吸附剂的实验是用来评价裸电极表面产生的非选择性C4-HSL信号的，由曲线c和曲线d可以看出这部分的影响较小。

实施例3 磁性分子印迹电化学传感器对C4-HSL标准品的检测

在不同浓度的(0mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.6mM)待测样本中加入适量分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP，室温下吸附5-10min；经预处理后的磁性玻碳电极插入上述溶液中，吸附1-10min，从溶液中拿出，用重蒸水仔细洗涤20s出去电极表面物理性吸附物质(包括未结合的样本)。磁性分子印迹电化学传感器置于电解池中，在含1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中进行DPV测定。DPV的测试条件：电压扫描范围为-0.1V到0.65V，脉冲幅度为25mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为5mV，所有测试均在室温下进行。峰电流与待分析浓度之间有定量关系，以C4-HSL标准品浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，在一定范围内可得到线性曲线，实现对C4-HSL标准品的检测。

结果如图5所示。实验结果显示随着C4-HSL标准品浓度的增加，其峰电流值降低，得到的线性曲线为：y＝-0.2417x+83.808。C4-HSL标准品浓度在2×10^-9-1.02×10^-7mol/L范围内具有良好的线性相关，线性相关系数R²＝0.9941。所述待测样品中信号分子浓度的最低检测限可达到6×10^-10mol/L。

实施例4 磁性分子印迹电化学传感器对嗜水气单胞菌群体感应信号分子的测定

磁性分子印迹电化学传感器对嗜水气单胞菌群体感应信号分子的检测：嗜水气单胞菌(ATCC 7966)接种于LB培养基，于30℃摇床震荡培养至一定浓度，培养液离心10000rpm15min得上清。上清用0.4μm的滤膜过滤得到无菌上清液。取10ml无菌上清液与10ml酸化乙酸乙酯(添加0.5％甲酸)混匀，剧烈震荡，至少静置30min，使有机相和水相完全分开，得有机相。按同法提取三次，把三次的有机相混合，氮吹挥发干溶剂。用2ml酸化乙酸乙酯复溶AHL信号分子，再次氮吹挥发干溶剂。用0.5ml酸化乙酸乙酯复溶AHL信号分子，-20℃保存备用。铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌群体感应信号分子提取方法与上述相同。在待测样本中加入适量分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP中，室温下吸附5-10min；经预处理后的磁性玻碳电极插入上述溶液中，吸附1-10min，从溶液中拿出，用重蒸水仔细洗涤20s出去电极表面物理性吸附物质(包括未结合的样本)。磁性分子印迹电化学传感器置于电解池中，在含1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液中进行。查标准曲线得到C4-HSL浓度。

分别对培养12h的嗜水气单胞菌无菌上清液和铜绿假单胞菌无菌上清液中群体感应信号分子进行检测，同时进行加标回收实验(重复试验5次)，结果见表1。结果表明，信号分子标准品(C4-HSL)在嗜水气单胞菌无菌上清液和铜绿假单胞菌无菌上清液中的平均回收率分别为98.4％和100.5％，满足检测要求。RSD值分别为2.2％和2.7％，在误差允许的范围内，说明该法测定群体感应信号分子的数据可信。

表1 嗜水气单胞菌和铜绿假单胞菌无菌上清液中群体感应信号分子的检测(n＝5)

*加标体积与试样体积相同。

**回收率(％)＝(加标试样浓度-试样浓度×试样体积/加标试样体积)/(加标用标准溶液浓度×加标体积/加标试样体积)×100

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器的制备方法，包括：(1)以呋喃酮为模板分子，制备出“核-壳”结构的多功能磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP；(2)将适量所述磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP加入到样本溶液中，室温下吸附；(3)将磁性玻碳电极插入到步骤2的溶液中，吸附，然后通过磁吸附作用，实现磁性分子印迹聚合物在磁性电极表面的固定，即得到磁性分子印迹电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄SiO₂-MIP的制备，是以呋喃酮为模板分子、Fe₃O₄MNPs为内核、SiO₂外为壳，在得到的“核-壳”型磁球Fe₃O₄SiO₂表面嫁接氨基NH₂，并在氨基化的核壳型磁球Fe₃O₄SiO₂-NH₂的表面进行聚合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄MNPs通过溶剂热法制备；所述Fe₃O₄SiO₂通过Stober法制备；所述Fe₃O₄SiO₂-NH₂通过硅烷试剂KH550对“核-壳”型磁球表面进行接枝氨基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄SiO₂-MIP的制备包括：(1)将模板分子呋喃酮：功能单体甲基丙烯酸：交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩尔比1：(1-8)：(10-30)的比例混合，加入适量乙腈中，超声；(2)按每毫摩尔模板分子，加入100-300mg的Fe₃O₄SiO₂-NH₂磁性纳米粒子，10-30mg的引发剂偶氮二异丁腈，超声至均匀；(3)在N₂氛围下，60-80℃油浴反应12-36h，反应结束后，用外部磁场富集聚合的纳米颗粒，用甲醇/乙酸溶液洗至无模板分子检测出来为止，干燥即得到Fe₃O₄SiO₂-MIP。

5.权利要求1-4任一所述方法得到的磁性分子印迹传感器。

6.权利要求5所述传感器的应用。

7.一种权利要求5所述磁性分子印迹传感器的应用，其特征在于，所述是：(1)使用所述磁性分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP对含有不同浓度的革兰氏阴性细菌的群体信号分子标准品溶液进行吸附得到磁性分子印迹电化学传感器，采用微分脉冲伏安法测定电流，得到革兰氏阴性细菌的群体信号分子浓度与电流值的标准曲线；(2)将适量所述分子印迹聚合物微球Fe₃O₄SiO₂-MIP加入到待测样本中，吸附得到待测样本的磁性分子印迹电化学传感器，采用微分脉冲伏安法测定电流，再根据步骤1得到的标准曲线，定量待测样本中革兰氏阴性菌群体感应信号分子浓度，实现对革兰氏阴性菌的间接检测。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述测定电流是将磁性分子印迹电化学传感器置于电解池底液中，设定适宜的扫描参数，进行循环伏安法和/或微分脉冲伏安法测定；所述电解池底液为含1.0M KCl的2.5mM的铁氰化钾缓冲液。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微分脉冲伏安法的测试条件为：电压扫描范围为-0.1V到0.65V，脉冲幅度为25mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电势增量为5mV，所有测试均在室温下进行。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品溶液C4-HSL溶液；所述为标准曲线为：y＝-0.2417x+83.808，C4-HSL标准品浓度在2×10^-9-1.02×10^-7mol/L范围内具有良好的线性相关，线性相关系数R²＝0.9941。