CN111693586A - 一种细菌分子印迹聚合物及其制备方法以及细菌检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌分子印迹聚合物及其制备方法以及细菌检测的方法，属于生物化学技术领域。所述的细菌分子印迹聚合物的制备方法包括如下步骤：a)将细菌模板分子、功能单体、掺杂剂按一定比例混合加入到电解池缓冲液中形成混合液，将电极插入到上述混合液中进行电化学聚合得到导电聚合物；将步骤a)所得的导电聚合物放入洗脱液中洗脱，保护气体干燥得到细菌分子印迹聚合物。本发明所制备的细菌分子印迹聚合物，将CuPcTs有效提高PPy的导电率和分子印迹聚合物对印迹分子进行特异性识别的机制相结合，具有良好的分子识别性能，大大地提高了检测细菌的灵敏度和选择性。

Description

一种细菌分子印迹聚合物及其制备方法以及细菌检测的方法
技术领域
本发明涉及一种细菌分子印迹聚合物及其制备方法以及细菌检测的方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
防治食源性病原体对公共卫生安全尤其重要，食源性病原体中90％以上是细菌。据美国疾病控制与预防中心(CDC)称，每年约有940万例食源性疾病，这些疾病导致约5万人住院，1500人死亡。常见食品致病菌主要有致病性大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等。
食品中致病菌限量标准是食品安全基础标准的重要组成部分。2012年9月25日卫生部在网站公布食品安全国家标准《食品中致病菌限量》征求意见稿，首次制定食品中致病菌限量标准。标准提出了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌等几种主要致病菌在肉制品、水产制品、粮谷类制品、即食加工果蔬、饮料及冷冻饮品等多类食品中的限量要求。其中，公众比较熟悉的沙门氏菌在各类食品中的限量值均为0，也就是说，样品中不得检出这类病菌，金黄色葡萄球菌在各类食品中的限量值均为100CFU/g。
传统的细菌检测技术，如酶联免疫吸附试验、放射免疫检定法和实时定量聚合酶链反应等反应速度非常缓慢、样品制备复杂、设备昂贵且体积庞大、敏感性和选择性有限，需要熟练的人员对样品进行收集、标记和分析。因此，开发一种快速、成本低、灵敏度高、特异性强的致病菌检测方法对确保公众健康和食品安全具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提出了一种细菌分子印迹聚合物及其制备方法，同时，本发明还提出了一种细菌检测方法，以实现对致病菌的高灵敏度、高特异性的识别。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
一种细菌分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：
a)将细菌模板分子、功能单体、掺杂剂按一定比例混合加入到电解池缓冲液中形成混合液，将电极插入到上述混合液中进行电化学聚合得到导电聚合物；
b)将步骤a)所得的导电聚合物放入洗脱液中洗脱模板分子后，保护气体干燥得到本发明的细菌分子印迹聚合物。
进一步地，所述细菌模板分子为单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌O157:H7。
进一步地，所述掺杂剂为铜钛菁-3,4',4",4"'-四磺酸四钠盐(CuPcTs)。
进一步地，所述功能单体为吡咯。
进一步地，所述细菌模板分子、功能单体、掺杂剂的体积比为500:17:0.05～0.25，优选为500:17:0.1。
进一步地，所述电解池缓冲液是含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液。
进一步地，所述电化学聚合方法是循环伏安法，即将电极置于步骤a)所述的含细菌模板分子、功能单体和掺杂剂的电解池缓冲液中，设置扫描参数和循环圈数，电解引发聚合。
进一步地，所述扫描参数为扫描速率为0.05V/s、循环电压为-0.4V到+0.7V，所述循环圈数为5～20圈，优选为15圈，聚合反应温度为室温。
进一步地，所述洗脱液是5％w SDS/HAc。
进一步地，所述步骤a)中电极为玻碳电极，其需进行预处理，即将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和有机溶剂(乙醇、丙酮等)中各超声清洗30s-1min，保护气体干燥。
一种如上述方法制备得到的细菌分子印迹聚合物。
一种细菌的检测方法，包括如下步骤：
使用上述细菌分子印迹聚合物对样品中的细菌检测，采用电化学阻抗法测定阻抗，得到样品中的细菌回收率。
进一步地，所述电化学阻抗法的测试条件为：频率为0.1-100000Hz，振幅为5mV，测试在室温下进行。
进一步地，所述样品中的细菌为单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌O157:H7。
电化学聚合能够控制聚合物膜厚度，得到均匀的分子印迹层，并且能使分子印迹层很好地附着在电极表面。聚吡咯(PPy)具有低的非特异性吸附、良好的导电性、优异的稳定性以及在温和条件下的高效聚合性等优点，同时，其对细菌外层细胞结构的化学位点具有敏感性，因而具有良好的选择性和通用性。
为了进一步提高分子印迹聚合物对细菌的高灵敏度、高特异性，我们通过研究发现了一种超分子导电材料CuPcTs作为掺杂剂用于分子印迹聚合物的制备。CuPcTs是一种良好的有机半导体，可增强PPy的链间电荷运输，使掺杂CuPcTs的PPy的导电率比未掺杂CuPcTs的PPy的导电率提高两个量级，进而导电能力显著提高。
因此，本发明选择了吡咯作为功能单体，将CuPcTs有效提高PPy的导电率和分子印迹聚合物对印迹分子进行特异性识别的机制结合在一起，制备得到的细菌分子印迹聚合物对目标分子具有更高的选择性，从而提高了细菌检测的灵敏度和准确性。
本发明的有益效果是：
本发明所制备的细菌分子印迹聚合物，将CuPcTs有效提高PPy的导电率和分子印迹聚合物对印迹分子进行特异性识别的机制结合在一起，具有良好的分子识别性能，大大地提高了对细菌的灵敏度和选择性。本发明提供的细菌分子印迹聚合物的制备方法快速、简单、高效，为细菌分子印迹聚合物的制备提供了一种可行的制备方法。本发明还提供了细菌检测方法，以实现对致病菌的高灵敏度、高特异性的识别。
附图说明
图1为PPy-CuPcTs-MIP在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液的EIS曲线和PPy-CuPcTs-MIP识别大肠杆菌O157:H7(106CFU/mL)后在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液的EIS曲线。
图2对CuPcTs的浓度、聚合循环圈数、模板去除时间、对细菌的识别时间等的优化。
图3(A)为PPy-CuPcTs-MIP生物传感器检测10-108CFU/mL大肠杆菌O157:H7的阻抗谱图。
图3(B)为EIS响应与大肠杆菌O157:H7对数浓度的标准曲线。
图4为不同PPy-CuPcTs-MIP与相应模板菌和三种干扰菌的EIS响应三维数据图。
图5为GCE/bare、GCE/PPy、GCE/PPy-CuPcTs在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液中的EIS曲线。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取9mL饮用水与1mL用PBS(pH＝7.4)稀释的大肠杆菌O157:H7溶液混合均匀，使得最终浓度为103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL，制成被人为污染的实际样品溶液。取250μL实际样品溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到实际样品溶液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。考察该细菌分子印迹聚合物对大肠杆菌O157:H7识别特异性和回收效果，结果见表1。
实施例2：
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取9mL橙汁与1mL用PBS(pH＝7.4)稀释的大肠杆菌O157:H7溶液混合均匀，使得最终浓度为103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL，制成被人为污染的实际样品溶液。取250μL实际样品溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到实际样品溶液中识别2h，所有测试都通过电化学阻抗法检测。考察该细菌分子印迹聚合物对大肠杆菌O157:H7识别特异性和回收效果，结果见表1。
实施例3：
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
牛奶中存在的成分，如脂肪和蛋白质可能会干扰细菌的检测，因此，需要对牛奶进行离心和过滤，首先离心分离出上清液层，然后用无菌微孔膜对上清液层进行过滤。取9mL过滤后的牛奶上清液与1mL用PBS(pH＝7.4)稀释的大肠杆菌O157:H7溶液混合均匀，使得最终浓度为103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL，制成被人为污染的实际样品溶液。取250μL实际样品溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到实际样品溶液中识别2h，所有测试都通过电化学阻抗法检测。考察该细菌分子印迹聚合物对大肠杆菌O157:H7识别特异性和回收效果，结果见表1。
表1大肠杆菌O157:H7分子印迹聚合物在不同实际样品中的回收率结果
Figure BDA0002521181850000061
通过表1可以PPy-CuPcTs-MIP生物传感器对饮用水中的大肠杆菌O157:H7的回收率为97.9％-100.8％，RSD为1.10％-3.37％；对橙汁中的大肠杆菌O157:H7的回收率为90.7％-102.6％，RSD为1.21％-3.53％；对牛奶中的大肠杆菌O157:H7的回收率为95.3％-102.2％，RSD为1.52％-2.35％。这表明PPy-CuPcTs-MIP生物传感器可以应用于检测实际样品中的大肠杆菌O157:H7。
实施例4
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。将制备得到的细菌分子印迹聚合物插到电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)中，通过电化学阻抗法检测，结果见图1。
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。结果见图1。
图1为PPy-CuPcTs-MIP在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液的EIS曲线和PPy-CuPcTs-MIP识别大肠杆菌O157:H7(106CFU/mL)后在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液的EIS曲线。由图1可知，PPy-CuPcTs-MIP的阻抗为50Ω，PPy-CuPcTs-MIP识别大肠杆菌O157:H7(106CFU/mL)后的阻抗为9000Ω。
实施例5
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.05-0.25μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。结果见图2。如图2所示，传感性能随着CuPcTs浓度的增加(0.05-0.10mol/L)的增加而逐渐改善，当CuPcTs浓度进一步增加为0.15-0.25mol/L时，其对模板细菌的反应降低，因此CuPcTs浓度为0.10mol/L是电化学聚合的最佳条件。
实施例6
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为5-20圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。结果见图2。如图2所示，传感性能随着聚合周期(5-15)的增加而逐渐改善，当聚合周期进一步增加为20时，其对模板细菌的反应降低，因此15个聚合周期为电化学聚合的最佳条件。
实施例7
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物0.5-2h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。结果见图2。如图2所示，洗脱时间对模板的去除是有影响的，Rct值随着洗脱时间的增加(0.5-1.5h)而减少，当进一步将洗脱时间延长至2h时，Rct值几乎没有变化，因此，用5％w SDS/HAc洗脱1.5h是去除模板的最佳条件。
实施例8
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7溶液，装入1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别1-2.5h，再通过电化学阻抗法检测。结果见图2。如图2所示，识别时间是另一个影响传感性能的参数，随着识别时间的增加(1.0-2.0h)，响应信号逐渐增强，进一步将识别时间延长至2.5h，响应信号并没有较大变化，因此将识别时间2h为最佳。
实施例9标准曲线的建立
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
用PBS(pH＝7.4)连续10倍依次稀释大肠杆菌O157:H7菌液，使得最终浓度为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL。分别取250μL稀释后的菌液，装入1mL离心管中，将实施例1制备得到的细菌分子印迹聚合物插入到菌液中识别2h，再通过电化学阻抗法检测。
根据不同的大肠杆菌O157:H7对数浓度下的EIS响应绘制标准曲线。图3(A)为PPy-CuPcTs-MIP生物传感器检测10-108CFU/mL大肠杆菌O157:H7的阻抗谱图；图3(B)为EIS响应与大肠杆菌O157:H7对数浓度的标准曲线。标准曲线的线性方程为△R/R(Ω)＝10.83log10C-9.40，线性范围为10-108CFU/mL，最低检出浓度为10CFU/mL，线性相关系数(R2)为0.9938。如要准确的确定样品中的大肠杆菌O157:H7的浓度值，大肠杆菌O157:H7的浓度值不超过108CFU/mL的范围，不在此范围时稀释或浓缩即可。
实施例10
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
再分别取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌液均装入一支1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到离心管中识别2h，再通过电化学阻抗法检测，结果见图4。
实施例11
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL单增李斯特菌、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
再分别取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌液均装入一支1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到离心管中识别2h，再通过电化学阻抗法检测，结果见图4。
实施例12
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL金黄色葡萄球菌、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
再分别取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌液均装入一支1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到离心管中识别2h，再通过电化学阻抗法检测，结果见图4。
实施例13
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。分别取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、0.5mL细菌模板分子106CFU/mL沙门氏菌、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥。采用5％w SDS/HAc洗脱制得的聚合物1.5h，再用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到细菌分子印迹聚合物。
再分别取250μL106CFU/mL大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌液均装入一支1mL离心管中，将洗脱后的细菌分子印迹聚合物插入到离心管中识别2h，再通过电化学阻抗法检测，结果见图4。
图4为不同PPy-CuPcTs-MIP与相应模板菌和三种干扰菌的EIS响应三维数据图。如图4所示，当模板细菌分子为大肠杆菌O157:H7时，PPy-CuPcTs-MIP对大肠杆菌O157:H7的EIS响应远远高出对其他干扰细菌的EIS响应；同理，当模板细菌分子为单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌或沙门氏菌时，PPy-CuPcTs-MIP对其模板菌的EIS响应也远远高出对其他干扰细菌的EIS响应。由此可以得出PPy-CuPcTs-MIP生物传感器具有优异的选择性以及通用性。
对比例1
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥，得到GCE/bare。将GCE/bare插到电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)中，通过电化学阻抗法检测。
对比例2
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。取17μL功能单体吡咯与4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到GCE/PPy。将GCE/PPy插到电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)中，通过电化学阻抗法检测。
对比例3
将玻碳电极表面用0.3-0.05μm氧化铝悬浮液抛光打磨后，先后在去离子水和乙醇中各超声清洗30s，氮气干燥。取17μL功能单体吡咯、0.1μL掺杂剂CuPcTs、4mL电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)混合均匀，装入5mL烧杯中。将玻碳电极插到混合液中通过循环伏安法进行电化学聚合，扫描速率为0.05V/s，循环电压为-0.4V到+0.7V，聚合循环圈数为15圈，所有聚合均在室温下进行。将制备好的电极取出，用去离子水反复冲洗，氮气干燥，得到GCE/PPy-CuPcTs。将GCE/PPy-CuPcTs插到电解池缓冲液(含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液)中，通过电化学阻抗法检测。
图5为GCE/bare、GCE/PPy、GCE/PPy-CuPcTs在含1mmol/L铁氰化钾溶液/1mmol/L亚铁氰化钾溶液的0.1mol/L KCl溶液中的EIS曲线。由图5可知，GCE/bare的阻抗为150Ω，GCE/PPy的阻抗为200Ω，GCE/PPy-CuPcTs的阻抗为40Ω。因此，添加了CuPcTs的PPy-CuPcTs膜的阻抗比裸电极降低了3.75倍，比单一的PPy膜降低了5倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而己，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的均等修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明/实用新型的专利涵盖范围内。

Claims (10)

1.一种细菌分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)将细菌模板分子、功能单体、掺杂剂按一定比例混合加入到电解池缓冲液中形成混合液，将电极插入到上述混合液中进行电化学聚合得到导电聚合物；
b)将步骤a)所得的导电聚合物放入洗脱液中洗脱，保护气体干燥得到细菌分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细菌模板分子为单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌O157:H7。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述掺杂剂为铜钛菁-3,4',4",4"'-四磺酸四钠盐。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述功能单体为吡咯。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的制备方法，其特征在于，细菌模板分子、功能单体、掺杂剂的体积比为500:17:0.05～0.25。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电化学聚合方法是循环伏安法，即将电极插入到混合液中，设置扫描参数和循环圈数，电解引发聚合。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述扫描参数为扫描速率为0.05V/s、循环电压为-0.4V到+0.7V，所述循环圈数为5～20圈。
8.一种如权利要求1-7所述的方法制备的细菌分子印迹聚合物。
9.一种细菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用权利要求8的细菌分子印迹聚合物对样品中的细菌检测，采用电化学阻抗法测定阻抗，得到样品中的细菌回收率。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述电化学阻抗法的测试条件为：频率为0.1-100000Hz，振幅为5mV。
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