CN115902211A - 一种快速检测食源性致病菌的方法 - Google Patents

一种快速检测食源性致病菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品安全领域,公开了一种快速检测食源性致病菌的方法,其步骤包括:(1)目标细菌捕获:将修饰细菌印迹薄膜的电极浸于待测样品液体中,孵育并清洗电极,得到捕获目标微生物的修饰电极;(2)电化学信号放大探针修饰:在捕获目标细菌的修饰电极表面滴加电化学信号放大探针,孵育后清洗电极去除多余的探针,得到夹心式复合膜电极;所述电化学信号放大探针为修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金;(3)电化学检测:以夹心式复合膜电极为工作电极,采用三电极体系,运用差分脉冲伏安法,测量峰值电流。本方法不需要对样品进行复杂前处理,受样品基质影响小,实现了对食源性致病菌的快速、高灵敏度、低成本检测。

Description

一种快速检测食源性致病菌的方法
技术领域
本发明属于食品安全领域,是一种基于纳米材料和适配体的分子印迹电化学传感器高灵敏快速检测食源性致病菌的方法。
背景技术
食品安全是在世界范围内备受关注的公共卫生问题。在食品安全问题中,较为常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌等。由致病菌引起的感染性疾病通常发病急、感染症状进展快,以细菌性脑膜炎为例,诊断时间与患者生存或严重后遗症如耳聋、失明和四肢功能丧失的发生几率存在明显的相关性。此外,由于致病菌的感染剂量往往较低,如对于大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7),每克食物或环境样本仅需10个细胞,就可引起突发性剧烈腹痛和出血性腹泻。根据GB 29921食品中致病菌限量规定在预包装食品中金黄色葡萄球菌(S.aureus)限量为100CFU/g(mL)。此外,尽管抗生素已在全球范围内广泛使用,但仍存在高致病率和死亡率的主要原因是致病菌感染的诊断延迟或结果不准确。
传统的检测方法微生物培养法,其结果准确度高,价格低廉,但致病菌的富集、分离和计数过程,大大延长了检测时间。快速检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、ATP荧光检测,其检测相对于微生物培养法具有高度的特异性,高效率,不需要大型仪器设备,操作简便。但是其成本高,且在复杂的食品样品环境和致病菌低剂量的存在下,为提高检测性能需要进行富集处理。
常用的识别元件有抗体、适配体(Aptamer)、分子印迹聚合物(Molecularlyimprinted polymer,MIP)等。抗体对目标物具有很高的选择性和结合亲和力,因此最常用做致病菌检测的识别元件。但对外环境极为敏感,需要低温储存,作为识别元件修饰到电极表面的过程,通常会使抗体部分变性或失活,从而使传感器的灵敏度和选择性降低。Aptamer是指通过指数富集的配体系统进化技术从体外筛选得到的单链DNA或RNA,它是指可以与待测物特异性结合的单链寡聚核苷酸链。这类“化学抗体”已被广泛的应用在生物识别领域。
鉴于用于生物传感识别元件的性价比,和基于人工合成材料的生物识别元件研究兴起。MIP相较于抗体具有更好的机械/化学稳定性,具有一定的可重用性,重现性,重复性。目前,MIP在电化学传感器的研究范围很广,包括小分子、病毒、细菌、细胞等;对于大尺寸的细菌印迹在电化学的应用,多数采用阻抗的读出方式,但复杂的食品基质严重影响传感器的灵敏检出。
CN111693586A公开了一种细菌分子印迹聚合物以及用这种聚合物检测细菌的方法,将细菌模板分子和吡咯混合液在电极表面聚合,得到修饰细菌分子印迹聚合物的电极,可用于检测致病性微生物。但是该方法用于检测食品时,尤其是牛奶,需要进行前处理,否则会因其中脂肪和蛋白质干扰检测;而预处理又容易导致样本失真,导致假阴性。
因此,开发一种高灵敏、快速的分子印迹电化学传感器是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在提供一种快速检测食源性致病菌的方法,基于纳米金增加对氧化还原分子和适配体(Aptamer)的负载的信号放大探针以及分子印迹电化学传感器,旨在进一步提高的灵敏度。
一种快速检测食源性致病菌的方法,步骤包括:
(1)目标细菌捕获:将修饰细菌印迹薄膜的电极浸于待测样品液体中,孵育并清洗电极,得到捕获目标微生物的修饰电极;
(2)电化学信号放大探针修饰:在捕获目标细菌的修饰电极表面滴加电化学信号放大探针,孵育后清洗电极去除多余的信号放大探针,得到夹心式复合膜电极;所述电化学探针为修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金;
(3)电化学检测:以夹心式复合膜电极为工作电极,采用三电极体系,运用差分脉冲伏安法,测量峰值电流。
步骤(1)中,待测样品液体的pH值为7-7.6,优选为7.3-7.5;在本发明的一个优选方式中,pH为7.4。
修饰细菌印迹膜的电极的制备方法为:将电极浸入含有目标细菌和3-噻吩乙醇的缓冲液中,采用电沉积技术,在电极表面聚合8-15个周期;清洗去除作为模板的目标微生物。优选的,所述缓冲液为pH=6.3-6.8的磷酸缓冲液,目标细菌含量5*108-5*109CFU/mL;3-噻吩乙醇含量6-10mmol/L。
所述的电极为玻碳电极(GCE)。并且在修饰前用氧化铝浆料抛光电极至镜面光洁度。
步骤(2)中,所述的电化学信号放大探针制备方法为:纳米胶体金与巯基修饰的适配体混合后孵育,得到的适配体-纳米胶体金溶解于乙醇的水溶液中,滴加(二茂铁基)己硫醇,使(二茂铁基)己硫醇吸附在适配体-纳米胶体金上,得到修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金。
所述纳米胶体金的粒径为10-22nm,优选为15-17±5nm;
所述的适配体用于捕获目标细菌。
优选的,适配体与纳米胶体金的用量比为13-18nmol/μg,更优选为15-16nmol/μg;(二茂铁基)己硫醇与纳米胶体金的用量比为18-22μL/μg,更优选为19-20μL/μg。
步骤(3)中,通过与空白对照组峰值电流的比较进行定性检测,通过标准曲线进行定量检测。
一种用于快速检测食源性致病菌的试剂盒,包括修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金及修饰细菌印迹膜的电极中的至少一种。
采用本方法可以检测常见的食源性致病菌,例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等。
本发明针对现有分子印迹电化学传感器灵敏度低(单个细菌细胞检测困难),以及难以实现复杂食品基质检测的问题,提出了一种基于纳米金和Aptamer的分子印迹电化学传感器,实现了对食源性致病菌的快速、高灵敏度、低成本检测。基于纳米金增加对氧化还原分子和Aptamer的负载的信号放大探针,提供检测食源性致病菌的分子印迹电化学传感器,可进一步提高传感器的灵敏度。(二茂铁基)己硫醇(FcHT)与末端修饰巯基的Aptamer通过Au-S键共价结合到纳米金(Au NPs)表面,形成电化学探针(Au@Fc-Apt)。以待测的细菌为模板分子、3-噻吩乙醇(TE)为功能单体,采用电化学聚合法在电极(例如玻碳电极GCE)上制备细菌印迹聚合物,经过模板洗脱留下对待测细菌有特异性识别的细菌印迹膜(Bacterialimprinted film,BIF)实现对致病菌的捕获。再通过滴加Au@Fc-Apt对致病菌进行再捕获,获得“三明治型”分子印迹电化学传感器,再运用差分脉冲伏安法(DPV),测量峰值电流,实现对致病菌的检出。通过纳米金对Aptamer捕获致病菌后FcHT的信号放大,比原来无标记检测的信号有了显著的提高,进而提高了该传感器的灵敏度。也比基于量子点的有标记分子印迹电致发光检测快速。本发明传感器的制备可以实现高效、高灵敏度地快速检测单菌落食源性致病菌。尤其适用于基质复杂的待测样品,例如乳制品、果汁等饮料。采用本方法,样品的预处理简单,可以直接进行检测,受样品基质影响小,检测限降低。以纯水为检测对象,检测限可以达到1CFU/mL;以稀释10倍的牛奶为检测对象,响应值可以达到10CFU/mL。
本方法为构建新型的信号增强型分子印迹电化学传感器检测食源性致病菌,提供了新的平台。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理图
图2为实施例3中,不同细菌浓度牛奶的检测结果。
图3为实施例3中,检测含不同浓度金黄色葡萄球菌牛奶中的标准曲线。
图4为实施例4中,加入电化学信号放大探针的BIF/GCE检测细菌单细胞结果。
图5为实施例4中,不加入电化学信号放大探针的BIF/GCE检测细菌单细胞结果。
具体实施方式
实施例1 Au@Fc-Apt的制备
(1)Au NPs的合成:根据柠檬酸三钠水热合成法制备。
将HAuCl4溶液(50μL,10wt%含量约5.56μg)添加到50.0mL去离子水中,并通过连续搅拌加热至沸腾。
然后,快速添加柠檬酸钠水溶液(1.25mL,1wt%),并持续搅拌30min。待反应完全后,获得酒红溶液(25.0mL,含Au NPs约3.22μg),标志着成功合成纳米胶体金Au NPs。然后将所得的Au NPs溶液冷却,储存在4℃的冰箱中以供进一步使用,所得到的Au NPs粒径为16±5nm。
(2)Au@Fc-Apt的制备:
取1mL Au NPs(约0.13μg)溶液于2mL离心管中,加入巯基修饰的金黄色葡萄球菌适配体Aptamer(20μL,100μM,含量0.002μmol),并在恒温金属浴中25℃、300rpm孵育12h;所得产物为Au@Apt(适配体-纳米胶体金)。
之后将溶液离心(12000rpm,15分钟)去除上清液,取沉淀溶解在1.0mL乙醇/水(10%,v/v)中。再滴加2.5μL FcHT,超声5min。加入200μL正己烷萃取多余的FcHT,在旋涡搅拌器上搅拌24小时。在正己烷/水相边界,FcHT分子吸附在Au@Apt上。在此培养时间后,溶液离心(12000rpm,10分钟),并用正己烷和PBS(0.01M,pH 7.4)清洗3次。最终产物为修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金Au@Fc-Apt,即电化学信号放大探针,分散在PBS(250μL,0.01M,pH 7.4)中,并在4℃下贮存以备进一步使用。
以革兰氏阴性菌代表性菌株金黄色葡萄球菌S.aurues为检测对象,适配体用巯基修饰,由生工生物工程(上海)有限公司合成,其序列为:
5′-TCCCTACGGCGCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCACCGTGCTACAAC-(CH)6-SH-3′
实施例2细菌印迹膜(BIF)的制备
使用0.05μm氧化铝浆料将玻碳电极GCE(直径3mm)连续抛光至镜面光洁度。
制备BIF:将GCE电极浸入含有109CFU/mL S.aureus和8mmol/L 3-噻吩乙醇(TE)的PBS(0.1M,pH 6.5)溶液中。采用电沉积技术,以100mV s-1的扫描速率,通过CV法在GCE(直径3mm)表面聚合10个周期。参比电极为饱和甘汞电极,电沉积的电势范围为-0.6~1.0V。用去离子水清洗修饰电极以去除残余试剂,干燥。然后,用含有10mM CTAB的HAc(36%,v/v)清洗电极以去除细菌模板,在恒温金属浴37℃,400rpm下保持10min。用去离子水清洗修饰电极以去除残余试剂,干燥。得到的修饰电极记为BIF/GCE。
实施例3检测食源性致病菌
检测原理示意图如图1所示。
目标物捕获:以牛奶为样品加入S.aureus菌液,配制成含不同浓度S.aureus的样品;对照组为不含S.aureus的牛奶。
用PBS缓冲液(0.01M,pH 7.4)稀释10倍后,吸取250μL置于1.5mL离心管中,将实施例2得到的BIF/GCE浸于其中,在恒温金属浴37℃,250rpm下孵育10min。用去离子水清洗电极以去除未绑定的细菌,干燥。得到的修饰电极记为S.aureus/BIF/GCE。
电化学信号放大探针修饰:将上述实施例1制备好的Au@Fc-Apt溶液振荡混匀,取5μL滴加于S.aureus/BIF/GCE表面,孵育1h。待重捕获反应完全后,用去离子水清洗电极以去除多余的Au@Fc-Apt,干燥。得到的夹心式复合膜电极记为Au@Fc-Apt/S.aureus/BIF/GCE。
电化学检测:采用三电极体系,参比电极为饱和甘汞电极,对电极为铂片电极,工作电极为Au@Fc-Apt/S.aureus/BIF/GCE(直径3mm)。选用DPV,电势范围0.1~0.6V,振幅0.05V。在PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液中进行电化学测量,记录峰值电流ip。
结果如图2所示,经过稀释的牛奶样品中,S.aureus的检测响应值达到10CFU/mL;含不同浓度细菌的牛奶样品,标准曲线如图3所示,显示具有良好的线性;峰值电流与S.aureus的浓度呈现正相关。从而可以定量的检测S.aureus的浓度。
实施例4单细胞检测
实验组:含S.aureus 1CFU/mL的PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液,浸在以实施例2的BIF/GCE电极中,滴加Au@Fc-Apt孵育1h,检测Au@Fc-Apt/S.aureus/BIF/GCE DPV,计算峰值电流ip。
对照组:用同样的方法检测电极识别PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液的DPV(对照组组),计算峰值电流ip。采用T值检验是否有显著性差异。
无电化学信号放大探针实验组:采用同样的BIF/GCE电极,不使用Au@Fc-Apt进行孵育,检测S.aureus/BIF/GCE阻抗(实验组),记为R。
无电化学信号放大探针对照组:用同样的方法检测电极识别PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液的阻抗(对照组组),记为R0。采用T值检验,实验组与对照组的R-R0/R0(ΔR/R0)是否有显著性差异。
检测结果如图4和图5所示,采用BIF/GCE电极并滴加Au@Fc-Apt探针孵育的方式,实验组与对照组的ip有显著性差异,可以检测出单细胞的食源性致病菌;而无信号放大探针的分子印迹电化学传感器,实验组与对照组的ΔR/R0没有显著性差异,则无法检测出单细胞的食源性致病菌。

Claims (10)

1.一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,步骤包括:
(1)目标细菌捕获:将修饰细菌印迹薄膜的电极浸于待测样品液体中,孵育并清洗电极,得到捕获目标微生物的修饰电极;
(2)电化学信号放大探针修饰:在捕获目标细菌的修饰电极表面滴加电化学信号放大探针,孵育后清洗电极去除多余的加电化学信号放大探针,得到夹心式复合膜电极;所述电化学信号放大探针为修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金;
(3)电化学检测:以夹心式复合膜电极为工作电极,采用三电极体系,运用差分脉冲伏安法,测量峰值电流。
2.根据权利要求1所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,步骤(1)中,修饰细菌印迹膜的电极的制备方法为:将电极浸入含有目标细菌和3-噻吩乙醇的缓冲液中,采用电沉积技术,在电极表面聚合8-15个周期;清洗去除作为模板的目标微生物。
3.根据权利要求2所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,所述缓冲液为pH=6.3-6.8的磷酸缓冲液,目标细菌含量5*108-5*109CFU/mL;3-噻吩乙醇含量6-10mmol/L。
4.根据权利要求2所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,所述的电极为玻碳电极。
5.根据权利要求1所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,待测样品液体的pH值为7-7.5。
6.根据权利要求1所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述的电化学信号放大探针制备方法为:纳米胶体金与巯基修饰的适配体混合后孵育,得到的适配体-纳米胶体金溶解于乙醇的水溶液中,滴加(二茂铁基)己硫醇,使(二茂铁基)己硫醇吸附在适配体-纳米胶体金上,得到修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金。
7.根据权利要求6所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,所述胶体金的粒径为10-22nm;所述的适配体用于捕获目标细菌。
8.根据权利要求6所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,适配体与纳米胶体金的用量比为13-18nmol/μg,(二茂铁基)己硫醇与纳米胶体金的用量比为18-22μL/μg。
9.根据权利要求1所述一种快速检测食源性致病菌的方法,其特征在于,步骤(3)中,通过与空白对照组峰值电流的比较进行定性检测,通过标准曲线进行定量检测。
10.一种用于快速检测食源性致病菌的试剂盒,其特征在于,包括修饰有适配体和(二茂铁基)己硫醇的纳米胶体金及修饰细菌印迹膜的电极中的至少一种。
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