CN111398582B - 海鲜产品检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种海鲜产品检测试剂盒及其制备方法，属于微生物检测领域，包括抗副溶血性弧菌免疫磁珠、CdSe/ZnS‑羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球。本发明提供的磁珠表面羧基修饰量较高，能够增加对抗体的偶联率，增加对副溶血性弧菌的捕获率；提供的CdSe/ZnS‑羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备方法能够减缓偶联速度，减少荧光微球的交联聚合，提高分散性，提高对抗体的偶联率，提高荧光强度值；利用本发明提供的海鲜产品检测试剂盒进行副溶血性弧菌的检测，具有较高的敏感度、准确度和可靠性。

Description

海鲜产品检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及海鲜产品检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性病原菌，其引发的食源性疾病暴发是当前面临的重要的公共卫生问题之一。为了使副溶血性弧菌得到有效控制，建立高效灵敏的分离检测方法显得十分重要。当食品中副溶血性弧菌浓度较低时，采用常规检测方法易造成漏检，而对于比较灵敏的ELISA或PCR等快速检测方法，由于食品样品成分相对复杂，易出现假阳性。因此，亟待建立一种方法弥补以上不足。免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。该技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，在外加磁场的作用下，达到快速分离和富集目标细菌。利用该技术可有效地收集、浓缩大量样品中的少量病原微生物，并使之与样品中的干扰物质分离，从而降低假阳性。免疫磁珠技术已在医学和生物学的骨髓移植、干细胞、细胞器、癌细胞、病原菌的识别和分离等方面取得了显著成绩，在食品和环境样品中的病原微生物的分离和检测工作中，也显示出良好的开发应用前景。
现有技术如授权公告号为CN 107045061 B的中国发明专利，公开了一种基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；利用该发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种功能化磁珠，该功能化磁珠表面羧基修饰量较高，能够提高对抗体的偶联率，且羧基具有较高的活性，与抗体上的氨基反应时无需活化。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供2-羟基戊酸和硫氰酸胍在提高免疫磁珠对目标菌捕获率中的用途。在硫氰酸胍引发下，2-羟基戊酸以较高的接枝率接枝在聚苯乙烯上，包覆磁性纳米粒，得到的磁珠表面羧基修饰量较高，能够增加对抗体的偶联率，增加对副溶血性弧菌的捕获率，提高检测的准确度和可靠性。且由于2-羟基戊酸的上与羧基基团相邻碳原子上存在的-OH具有一定的给电子能力，使得羧基对H的束缚能力较小，使得羧基具有较高的活性，与氨基反应时无需活化。
提供一种功能化磁珠，该功能化磁珠的制备方法包括以下步骤：
a、Fe3O4纳米粒子的制备；
b、油酸修饰的Fe3O4纳米粒子的制备；
c、吐温20修饰的Fe3O4聚集体的制备；
d、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的制备；
e、磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.08-0.1g SDS十二烷基硫酸钠及0.008-0.01g NaHCO3于容器中，加入28-32mL制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后72-74℃水浴搅拌，并通入氮气进行保护，待液体温度达到72-74℃时，加入1.8-2.0mL苯乙烯、90-300μL 2-羟基戊酸(1.12-1.45g/mL)、0.4-0.6mL硫氰酸胍(0.22-0.28g/mL)0.4-0.6mL过硫酸钾(0.026-0.031g/mL)反应7-8h，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀，再用超纯水洗涤，后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠。
作为优选，上述功能化磁珠的表面羧基修饰量至少为307μmol/g。
提供一种功能化磁珠在制备海鲜产品检测试剂盒中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备方法，该方法能够减缓偶联速度，抑制免疫微球的交联聚合，提高荧光微球对抗体的偶联率，进而增加提高荧光强度值。
提供一种CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备方法，包括：吸取CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入麦芽糖醇，用EDC、NHS进行活化后，离心去上清，用PBST洗涤，重悬于PBST中；加入抗体进行偶联，反应结束后，离心去上清；加入1％BSA封闭未与抗体共价偶联的羧基官能团，用PBS溶液洗涤后，重悬于PBS溶液。荧光微球共价偶联抗体时，采用EDC/NHS活化剂对表面羧基进行活化后，能够迅速与抗体上的氨基反应形成酰胺键，导致蛋白偶联太快而交联团聚，团聚会使其表面暴露的活性基团减少从而造成生物分子偶联量的降低。麦芽糖醇的羟基与能够与抗体上的氨基发生较弱的物理吸附，与荧光微球表面羧基竞争吸附位点，能够减缓偶联速度，减少荧光微球的交联聚合，提高分散性，提高对抗体的偶联率，提高荧光强度值，进而提高检测的准确度和可靠性。
提供一种快速检测副溶血性弧菌的方法，具体包括：
S1、多克隆抗体的制备；
S2、上述功能化磁珠与抗体偶联；
S3、CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球与抗体偶联；
S4、免疫磁珠富集分离副溶血性弧菌；
S5、免疫荧光微球的标记；
S6、检测。
作为优选，上述步骤S3中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球与抗体偶联的方法为：取14-16μL 0.05mM CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入9-12μL麦芽糖醇(1.8-2.3g/mL)，加入90-110μL 9.8-10.4mg/mL EDC、90-110μL 9.8-10.4mg/mL NHS和180-220μLPBST后利用垂直混合仪在室温下活化34-38min，12000rpm离心5-7min，弃上清，用PBST清洗1-2遍，重悬于450-550μL PBST中，加入110-150μg副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY，利用漩涡混合仪在室温下偶联反应3-3.5h，12000rpm离心5-7min。弃上清，用PBST清洗1-2遍，加入1mL 1％BSA封闭量子点表面未与IgY共价偶联的羧基官能团，利用漩涡混合仪在室温下孵育1-1.5h，用PBS溶液清洗1-2遍，重悬于450-550μL的PBS溶液中。
提供一种快速检测副溶血性弧菌的方法在制备海鲜产品检测试剂盒中的用途。
提供一种海鲜产品检测试剂盒，包括抗副溶血性弧菌免疫磁珠、CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球，上述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是利用上述功能化磁珠与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；上述CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球是利用上述羧基化CdSe@ZnS量子点与抗体偶联的方法制备所得。
本发明的有益效果为：
1)本发明在硫氰酸胍引发下，2-羟基戊酸以较高的接枝率接枝在聚苯乙烯上，包覆磁珠粒子，羧基具有较高的活性，与氨基反应时无需活化，得到的磁性纳米粒子表面羧基修饰量较高，能够增加对抗体的偶联率，增加对副溶血性弧菌的捕获率，提高检测的准确度和可靠性；
2)本发明中荧光微球共价偶联抗体时，麦芽糖醇的羟基与能够与抗体上的氨基发生较弱的物理吸附，与荧光微球表面羧基竞争吸附位点，能够减缓偶联速度，避免荧光微球的交联聚合，提高对抗体的偶联率，提高荧光强度值，进而提高检测的准确度和可靠性；
3)利用本发明的海鲜产品检测试剂盒对副溶血性弧菌进行检测，具有较高的敏感度、准确度和可靠性。
附图说明
图1为本发明实施例1中羧基功能化磁珠粒子的红外光谱图；
图2为本发明试验例1中磁珠表面的羧基含量的测定结果；
图3为本发明试验例1中磁珠对抗体的偶联量的测定结果；
图4为本发明试验例1中免疫磁珠的捕获率的测定结果；
图5为本发明试验例2中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的TEM图；
图6为本发明试验例2中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球对抗体的偶联量。
具体实施方式
本发明是根据免疫学中的抗体抗原特异性反应原理，利用免疫磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高等优点，结合量子点荧光标记技术，建立的一种具备多重信号放大、灵敏度高、特异性好、简便快速检测副溶血性弧菌的方法，具有较好的市场应用前景。以待检样品荧光强度与空白样品荧光强度比值(大于2.1)作为阳性检测结果的判定标准。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
对本发明的实施例进行具体的描述。实施中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：
1.副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG的制备：取浓度为1×109CFU·mL-1灭活菌液与等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂乳化完全，制备灭活疫苗。首次免疫取浓度为1×109CFU·mL-1弗氏完全佐剂疫苗免疫健康新西兰大白兔，采用背部皮下多点注射法，每只免疫2mL，在第二周、第三周采用同等剂量的弗氏不完全佐剂疫苗对兔进行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用灭活菌液加强免疫两次。每次免疫前兔耳缘静脉取血，测定血清效价。达到分离标准，兔心脏采血，分离血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对所述的抗血清中的多克隆抗体IgG进行纯化；采用间接ELISA法对纯化后抗体的效价进行测定，抗体效价达到1:120000，采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgG抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。
2.副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY的制备：按实施例1的方法制备副溶血性弧菌弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂疫苗即可用来免疫蛋鸡。采用肌肉多点注射的方式将疫苗接种于鸡胸。首次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗，每只鸡1mL，间隔两周后采用弗氏不完全佐剂疫苗进行第二次免疫，随后每隔两周进行一次强化免疫。收集免疫前后的鸡蛋，储存于4℃冰箱中备用。采用PEG 6000盐析法对鸡蛋中的卵黄抗体进行提取。采用间接ELISA法对纯化前后卵黄抗体的效价进行测定，经提取纯化后，最终获得的副溶血性弧菌IgY抗体效价可以达到1:132000，采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgY抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。
3.功能化磁珠的制备：
a、Fe3O4纳米粒子的制备：将150mL超纯水加入到250mL三颈瓶中，在50℃水浴下通氮气除氧15min。从三颈瓶中倒出40mL除氧水溶解4.3246g的FeCl3·6H2O及1.5909g的FeCl2·4H2O(Fe3+:Fe2+＝2:1mol/mol)后将混合溶液转移回三颈瓶中。在500rpm搅拌条件下将12.5mL氨水加入三颈瓶中，并在50℃水浴及氮气保护下反应30min。反应结束后，通过磁吸倾注法用除氧水清洗沉淀3遍。得到沉淀为Fe3O4纳米粒子。
b、油酸修饰的Fe3O4纳米粒子的制备：将上一步得到的Fe3O4纳米粒子充分超声分散于100mL除氧水中。在70℃水浴、300rpm搅拌及氮气保护的条件下，加入1mL油酸(OA)反应3h。
c、吐温20修饰的Fe3O4聚集体的制备：将0.3g的Fe3O4-OA用氮气吹干后重新溶解于1.7mL环己烷中，同时制备30mL浓度为5.6mg/mL的Tween-20。将两种溶液充分超声后混合，在25℃、120rpm的条件下超声反应15min。反应结束后，2800rpm离心8min弃去沉淀留上清液，上清液6000rpm离心5min进行离心分离。最后将沉淀重新超声分散于超纯水中，并通过烘干称量法计算Fe3O4聚集体浓度，4℃保存备用。
d、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的制备：用
Figure BDA0002396895440000051
反应体系，在30℃水浴中向装有50mL乙醇的三颈瓶中加入1mL水、1.5mL氨水和0.3mL TEOS。在氮气保护的条件下，300rpm预水解反应20min后，向三颈瓶中加入3mL 0.03g的Fe3O4聚集体，并反应35min。反应结束后，用超纯水洗涤沉淀5遍，得到的沉淀即为包覆有SiO2壳层的球形Fe3O4磁性纳米粒子。
e、磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.086gSDS十二烷基硫酸钠及0.008g NaHCO3于三颈瓶中，加入28mL水及制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后置于72℃水浴中，300rpm搅拌，并通入氮气进行保护。待三颈瓶内液体温度达到72℃时，加入2mL苯乙烯、200μL 2-羟基戊酸(1.3g/mL)、0.5mL硫氰酸胍(0.27g/mL)、0.5mL过硫酸钾(0.03g/mL)反应8h，待反应结束后，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀5遍，然后用超纯水再洗涤5遍，最后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠粒子。羧基功能化磁珠粒子的红外光谱图见图1。由图1可以看出1716cm-1处存在羧基的伸缩振动峰，1176cm-1处存在醇基的C-O的伸缩振动峰，说明2-羟基戊酸成功修饰到磁性纳米复合粒子的表面。
4.抗副溶血性弧菌免疫磁珠的制备：1mg/mL羧基功能化磁珠充分超声分散后，取500μL加至2mL进样瓶中，加入120μg副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG，并用PBST定容至500μL。利用垂直混合仪在室温下孵育2h后，用500μL PBST溶液清洗3遍。然后加入1mL 1％BSA在室温下孵育1h，封闭磁珠表面未与IgG发生共价偶联的羧基官能团。封闭结束后，用PBS溶液清洗3遍，并重悬于500μL的PBS溶液中，4℃保存备用。
5.CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备：本实验所用的CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，激发波长为350nm，发射波长为532nm。取15μL 0.05mM CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入10μL麦芽糖醇(2.1g/mL)，加入100μL 10mg/mL EDC、100μL10mg/mL NHS和200μL PBST后利用垂直混合仪在室温下活化36min，12000rpm离心5min，弃上清，用PBST清洗1遍，重悬于500μL PBST中，加入120μg副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY，利用漩涡混合仪在室温下偶联反应3h，12000rpm离心5min。弃上清，用PBST清洗1遍，加入1mL1％BSA封闭量子点表面未与IgY共价偶联的羧基官能团，利用漩涡混合仪在室温下孵育1h，用PBS溶液清洗1遍，重悬于500μL的PBS溶液中。
6.缓冲液的配置：PBS缓冲液：取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO40.24g，溶于800mL蒸馏水中，用NaOH调节pH至7.4，在定溶至1000mL。
7.菌液标准品的制备：取-80℃保存菌种，进行菌株活化。将活化后的菌株在3％氯化钠胰蛋白胨琼脂平板上划线分纯，37℃培养18～24h后，挑取单个菌落，接种3％氯化钠胰蛋白胨液体培养基，37℃振荡培养12～18h。取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用1％甲醛在室温下灭活10min，将灭活的菌液3000rpm离3min，收集菌体，然后用PBS溶液充分混匀，制成菌悬液并用PBS溶液调节菌悬液浓度为1.0×109CFU·mL-1，存于4℃冰箱中备用。
8.质控品的制备：1)阳性质控品：阳性质控品由含1.0×103-1.0×105灭活的副溶血性弧菌的PBS溶液构成；2)阴性质控品：阴性质控品由灭菌后的PBS溶液构成。
9.试剂盒的组装:由本实施例制备的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球、缓冲液、菌液标准品、质控品共同组成检测海鲜中副溶血性弧菌抗原的试剂盒。
10.试剂盒的检测方法：
10.1样品的处理：待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入试剂盒中的PBS缓冲液10mL，充分混匀。
10.2系列标准品的制备：用PBS缓冲液梯度稀释标准品，得到1.0×100、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106CFU·mL-1菌悬液。
10.3检测：取所制备的免疫磁珠40μL，分别加入1mL系列标准品、质控品，或待测样品，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集45min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，分别加100μL CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球，在25℃下避光孵育30min进行标记。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。
10.4制作标准曲线：以副溶血性弧菌标准品浓度的对数为横坐标，标准品测定荧光强度值为纵坐标，做出标准曲线；
评判质控品浓度：根据质控品的荧光强度值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；
计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的荧光强度值从标准曲线计算出待测样品的副溶血性弧菌浓度。
实施例2：
磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.086gSDS十二烷基硫酸钠及0.008g NaHCO3于三颈瓶中，加入28mL水及制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后置于72℃水浴中，300rpm搅拌，并通入氮气进行保护。待三颈瓶内液体温度达到72℃时，加入2mL苯乙烯、200μL 2-羟基戊酸(1.3g/mL)、0.5mL过硫酸钾(0.03g/mL)反应8h，待反应结束后，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀5遍，然后用超纯水再洗涤5遍，最后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠粒子。其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.086gSDS十二烷基硫酸钠及0.008g NaHCO3于三颈瓶中，加入28mL水及制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后置于72℃水浴中，300rpm搅拌，并通入氮气进行保护。待三颈瓶内液体温度达到72℃时，加入2mL苯乙烯、200μL丙烯酸、0.5mL过硫酸钾(0.03g/mL)反应8h，待反应结束后，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀5遍，然后用超纯水再洗涤5遍，最后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠粒子。
抗副溶血性弧菌免疫磁珠的制备：1mg/mL羧基功能化磁珠充分超声分散后，取500μL加至2mL进样瓶中。于磁力架上磁吸分离后弃去上清，并通过磁吸分离法用500μL MEST溶液清洗3遍，弃去上清，加入10mg/mL EDC和NHS溶液各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在室温下活化36min。活化结束后弃去上清，用400μL PBST清洗3遍，加入120μg副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG，并用PBST定容至500μL。利用垂直混合仪在室温下孵育2h后，用500μLPBST溶液清洗3遍。然后加入1mL 1％BSA在室温下孵育1h，封闭磁珠表面未与IgG发生共价偶联的羧基官能团。封闭结束后，用PBS溶液清洗3遍，并重悬于500μL的PBS溶液中，4℃保存备用。其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.076gSDS十二烷基硫酸钠及0.008g NaHCO3于三颈瓶中，加入28mL水及制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后置于72℃水浴中，300rpm搅拌，并通入氮气进行保护。待三颈瓶内液体温度达到72℃时，加入2mL苯乙烯、200μL丙烯酸、0.5mL过硫酸钾(0.03g/mL)反应8h，待反应结束后，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀5遍，然后用超纯水再洗涤5遍，最后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠粒子。其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备：取15μL 0.05mM CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入100μL 10mg/mL EDC、100μL 10mg/mL NHS和200μL PBST后利用垂直混合仪在室温下活化36min，12000rpm离心5min，弃上清，用PBST清洗1遍，重悬于500μLPBST中，加入120μg副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY，利用漩涡混合仪在室温下偶联反应3h，12000rpm离心5min。弃上清，用PBST清洗1遍，加入1mL 1％BSA封闭量子点表面未与IgY共价偶联的羧基官能团，利用漩涡混合仪在室温下孵育1h，用PBS溶液清洗1遍，重悬于500μL的PBS溶液中。其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的制备：取15μL 0.05mM CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入100μL 10mg/mL EDC、100μL 10mg/mL NHS和200μL PBST后利用垂直混合仪在室温下活化36min，12000rpm离心5min，弃上清，用PBST清洗1遍，重悬于500μLPBST中，加入120μg副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY，利用漩涡混合仪在室温下偶联反应3h，12000rpm离心5min。弃上清，用PBST清洗1遍，加入1mL 1％BSA封闭量子点表面未与IgY共价偶联的羧基官能团，利用漩涡混合仪在室温下孵育1h，用PBS溶液清洗1遍，重悬于500μL的PBS溶液中。其余部分和实施例4完全一致。
试验例1：
磁珠表面羧基的检测：采用电导率滴定法测定磁珠表面的羧基含量，取清洗过的羧基化聚苯乙烯微球，加入少量蒸馏水超声处理后加入过量的NaOH溶液，使pH值调节至12左右，让微球表面的羧基与NaOH充分反应。反应30min后，用1.01mM的盐酸标准液滴定，并使用电导率仪记录滴定过程中的电位数值。根据滴定曲线中平台期计算出磁珠表面的羧基含量。
磁珠对抗体的偶联率：分别取1mg实施例1、实施例2、实施例3中的磁珠及实施例4中活化后的磁珠，加入25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG，并用PBST定容至500μL，利用垂直混合仪在室温下孵育2h后，取上清，用BCA试剂盒检测上清剩余抗体量，由此计算磁珠对抗体的偶联量。
免疫磁珠的捕获率：将40μL制备好的免疫磁珠分别加入到四个含3×105CFU/mL副溶血性弧菌菌液的离心管中，37℃捕获30min，磁分离后，取50μL上清液涂布到麦康凯培养基中进行计数，以空白的偶联BSA的磁珠作对照，计算捕获率。
磁珠表面的羧基含量的测定结果见图2。磁珠对抗体的偶联量的测定结果见图3。免疫磁珠的捕获率的测定结果见图4。
由图2、图3、图4可以看出，实施例1中磁珠表面的羧基含量明显高于实施例2、实施例3、实施例4，实施例1的磁珠对抗体的偶联量明显高于实施例3、实施例4，实施例1的免疫磁珠的捕获率明显高于实施例3、实施例4，这说明，在硫氰酸胍引发下，2-羟基戊酸能够以较高的接枝率接枝在聚苯乙烯上，包覆磁性纳米粒，得到的磁性纳米粒子表面羧基修饰量较高，且由于2-羟基戊酸的上与羧基基团相邻碳原子上存在的-OH具有一定的给电子能力，使得羧基对H的束缚能力较小，使得羧基具有较高的活性，与氨基反应时无需活化，能够增加对抗体的偶联率，增加对副溶血性弧菌的捕获率。
试验例2：
CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的表征：用透射电子显微镜(TEM)对实施例1、实施例5中所制备的荧光免疫微球进行表征。
CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球对抗体的偶联率：取分别采用实施例1、实施例5中的方法对50μg、100μg、150μg、200μg、250μg的抗体进行偶联，反应结束后取上清，用BCA试剂盒检测上清剩余抗体量，由此计算CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球对抗体的偶联量。
CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的TEM图见图5。CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球对抗体的偶联量见图6。
由图5可以看出，实施例1中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球的较少发生聚集，分散性较好；由图6可以看出，实施例1中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球对抗体的偶联量明显高于实施例5，这说明，麦芽糖醇的羟基与能够与抗体上的氨基发生较弱的物理吸附，与荧光微球表面羧基竞争吸附位点，减缓偶联速度，能够减少荧光微球的交联聚合，提高分散性，提高对抗体的偶联率。
试验例3：
灵敏度评价：实施例1、实施例3、实施例5、实施例6中建立的副溶血性弧菌检测方法中所制备的标准曲线见表1。以待检样品荧光强度与空白样品荧光强度比值(大于2.1)作为阳性检测结果的判定标准。
准确度评价：用实施例1、实施例3、实施例5、实施例6中建立的副溶血性弧菌检测方法对1mL 1.0×104CFU·mL-1副溶血性弧菌菌液进行检测，使用荧光分光光度计在激发波长为350nm下检测反应产物的荧光强度，将检测到的荧光强度代入相应的标准曲线中，计算回收率。
计算公式如下：
回收率(％)＝(加标试样测得菌液浓度值/加标试样理论菌液浓度值)×100％
表1副溶血性弧菌检测方法的标准曲线及加标回收率
Figure BDA0002396895440000101
由表1可以看出，根据实施例1、实施例3、实施例5、实施例6所建立的副溶血性弧菌检测方法制备的标准曲线均具有良好的线性关系，且实施例1中的相关系数达到0.9998，最接近于1；且与实施例3、实施例5、实施例6的1.0×102CFU·mL-1的最低检出限相比，实施例1的最低检出限达到1.0×101CFU·mL-1；与实施例6向相比，实施例1、实施例3、实施例5的荧光强度值均明显较高，且实施例1的最高；实施例1的回收率高达99.07％，明显高于实施例3、实施例5、实施例6，且实施例3、实施例5的回收率高于实施例6，这说明，CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球偶联抗体时加入麦芽糖醇，或在硫氰酸胍引发下，将2-羟基戊酸接枝在聚苯乙烯上后包覆磁珠，直接偶联抗体，能够提高检测的准确度和可靠性；CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球偶联抗体时加入麦芽糖醇，且在硫氰酸胍引发下，将2-羟基戊酸接枝在聚苯乙烯上后包覆磁珠，直接偶联抗体，能够提高检测的敏感度、准确度和可靠性。
试验例4：
模拟样品的检测：将虾碾磨后，称取5g匀浆至10mL的PBS溶液中过夜后取得浸液。使用浸液配制成浓度为0、1.0×101CFU·mL-1、1.0×102CFU·mL-1、1.0×103CFU·mL-1、1.0×104CFU·mL-1、1.0×105CFU·mL-1、1.0×106CFU·mL-1的副溶血性弧菌菌液各1mL，然后实施例1的方法对模拟样品进行检测。另外向制备的模拟样滤液中加入4.0×105CFU·mL-1的副溶血性弧菌，评估该方法的回收率。
表2模拟样品检测方法的标准曲线及回收率
Figure BDA0002396895440000111
由表2可以看出，在1.0×101-1.0×106CFU·mL-1范围内，菌液浓度的对数值与反应产物的荧光强度值呈良好的线性关系，标准曲线方程为y＝157.68x+140.39，R2＝0.9989，测得的浓度为1.0×101CFU·mL-1的浸液的荧光强度值与空白样品荧光强度比值等于2.14，大于2.1，因此检测最低限为1.0×101CFU·mL-1，回收率达到98.96％，说明本发明提供的检测试剂盒可以用来检测海鲜产品，敏感性较高，结果可靠。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1. 2-羟基戊酸和硫氰酸胍在提高免疫磁珠对副溶血性弧菌捕获率中的用途。
2.一种功能化磁珠，其特征在于：所述功能化磁珠的制备方法包括以下步骤：
a、Fe3O4纳米粒子的制备；
b、油酸修饰的Fe3O4纳米粒子的制备；
c、吐温20修饰的Fe3O4聚集体的制备；
d、Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子的制备；
e、磁性纳米复合粒子的表面羧基功能化修饰：称取0.08-0.1g SDS十二烷基硫酸钠及0.008-0 .01g NaHCO3于容器中，加入28-32mL制备的Fe3O4@SiO2磁性纳米复合粒子，超声分散后72-74℃水浴搅拌，并通入氮气进行保护，待液体温度达到72-74℃时，加入1.8-2.0mL苯乙烯、90-300μL 1.12-1.45g/mL的2-羟基戊酸、0.4-0.6mL 0.22-0.28g/mL硫氰酸胍、0.4-0.6mL 0.026-0.031g/mL的过硫酸钾反应7-8h，通过磁吸倾注法用乙醇洗涤沉淀，再用超纯水洗涤，后将沉淀溶解于超纯水中，得到羧基功能化磁珠。
3.根据权利要求2所述的一种功能化磁珠，其特征在于：所述功能化磁珠的表面羧基修饰量至少为307μmol/g。
4.权利要求2所述的一种功能化磁珠在制备海鲜产品检测试剂盒中的用途。
5.一种快速检测副溶血性弧菌的方法，具体包括：
S1、多克隆抗体的制备；
S2、权利要求2所述的功能化磁珠与抗体偶联；
S3、CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球与抗体偶联；
S4、免疫磁珠富集分离副溶血性弧菌；
S5、免疫荧光微球的标记；
S6、检测。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球与抗体偶联的方法为：取14-16μL 0 .05mM CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯荧光微球，加入9-12μL 1.8-2.3g/mL的麦芽糖醇，加入90-110μL 9.8-10.4mg/mL EDC、90-110μL 9.8-10.4mg/mL NHS和180-220μL PBST后利用垂直混合仪在室温下活化34-38min，12000rpm离心5-7min，弃上清，用PBST清洗1-2遍，重悬于450-550μL PBST中，加入110-150μg副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY，利用漩涡混合仪在室温下偶联反应3-3.5h，12000rpm离心5-7min，弃上清，用PBST清洗1-2遍，加入1mL 1％BSA封闭量子点表面未与IgY共价偶联的羧基官能团，利用漩涡混合仪在室温下孵育1-1.5h，用PBS溶液清洗1-2遍，重悬于450-550μL的PBS溶液中。
7.一种海鲜产品检测试剂盒，包括抗副溶血性弧菌免疫磁珠、CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球，所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是利用权利要求2所述的功能化磁珠与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述CdSe/ZnS-羧基化聚苯乙烯免疫荧光微球是利用权利要求6所述的方法制备所得。
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