CN111157592A - 一种静电纺丝葡萄糖探测膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感器领域，涉及葡萄糖探测组件，特别是指一种静电纺丝葡萄糖探测膜及其制备方法。包括具备生物相容性的静电纺丝元件以及与该静电纺丝元件固定结合的葡萄糖氧化酶，该静电纺丝元件包括复数个由生物相容性材料制成的静电纺丝纤维，所述葡萄糖氧化酶固定结合于各静电纺丝纤维，所述静电纺丝纤维的材质采用聚乙烯醇；本发明利用热交联或戊二醛蒸汽交联制备工艺，以使得葡萄糖氧化酶与静电纺丝元件产生较好的固定连接效果，大幅提升探测灵敏度。

Description

一种静电纺丝葡萄糖探测膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物传感器领域，涉及葡萄糖探测组件，特别是指一种静电纺丝葡萄糖探测膜及其制备方法。
背景技术
生物传感器是一种由固定化的生物敏感材料作识别元件如酶、抗体、抗原微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质，适当的理化换能器以及信号放大装置等构成的分析工具或系统，是一种用以探测生物体内、外环境化学物质或特异性交互作用后产生回应的一种装置。其中，葡萄糖传感器是许多生物感测器的研究重点，其应用范围广泛，从具有医疗用途的血糖检测装置，到食品分析应用领域，同时它也提供了研发新型生物传感器的技术平台。由于现代人饮食过量又缺乏运动，使得糖尿病的发病率不断攀升。据估计2018年全国糖尿病患者数为1.14亿人；约每10个人中就有1个糖尿病患者。而目前诊断糖尿病主要依据血糖值高低，患者可以借此控制血糖，因此便携性生物传感器显得格外重要，此类传感器优点在于无需昂贵复杂的仪器设备，同时具有快速的信号反应，加上电化学法的便利性有助于普及化，所以成为现今研究发展的热门课题。
目前，用来进行葡萄糖探测的主要方式为葡萄糖检测试纸，该葡萄糖感测试纸一般为层状组织，其包含一基材以及固定铺设在该基材上的一电极、一阻绝层、一检测层、一附着层及一亲水层，该葡萄糖感检测试纸的检测层接触待测液体之后，其探测结果的电信号由电极传导而出。
然而，现有技术中常规的检测层一般采用传统高分子薄膜的制造方式制成，其一般具有平滑的表面结构，使其比表面积受到限制而使其感测灵敏度不佳，通过该电极传导而出的电信号相当微弱，使葡萄糖传感器的检测结果可能出错，造成误诊，更因为需要经常重测而因此影响使用的便捷性。
发明内容
为解决现有技术中葡萄糖检测技术灵敏度不佳、容易造成误诊、使用不便等技术问题，本发明提供一种静电纺丝葡萄糖探测膜及其制备方法，利用静电纺丝聚乙烯醇制作了一种具有高比表面积的纳米纤维膜，大幅提升葡萄糖生物检测灵敏度。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种静电纺丝葡萄糖探测膜，包括静电纺丝元件及与静电纺丝元件固定结合的葡萄糖氧化酶；其中静电纺丝元件为包含复数个由生物相容性材料制成的静电纺丝纤维；其中生物相容性材料为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚氧化乙烯；所述固定结合指葡萄糖氧化酶与静电纺丝元件以热处理交联或以戊二醛蒸汽交联而产生的交联结合。
所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，步骤如下：
（1）以生物相容性材料为原料制备纺丝液，通过静电纺丝方法制备静电纺丝元件；
（2）将步骤（1）制备的静电纺丝元件置于葡萄糖氧化酶溶液中进行拉涂；
（3）经步骤（2）处理的静电纺丝元件，经交联工艺，静电纺丝元件中的纺丝纤维与葡萄糖氧化酶交联，得到静电纺丝葡萄糖探测膜。
所述步骤（1）中纺丝液中生物相容性材料的质量体积比为12-18%。
所述步骤（2）中葡萄糖氧化酶溶液的质量体积比为20%，温度为36-60℃，时间为45min。
所述步骤（3）中交联工艺为热处理交联或戊二醛蒸汽交联，其中热处理交联温度130℃-160℃，时间60min，戊二醛蒸汽交联的温度设置为25℃，时间设置在10-60min。
所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，步骤如下：
a. 将葡萄糖氧化酶与生物相容性材料混合制备纺丝液，通过静电纺丝工艺制备静电纺丝纤维膜；
b. 利用交联工艺将步骤a的静电纺丝纤维膜中的静电纺丝纤维和葡萄糖氧化酶进行交联反应。
所述步骤a中葡萄糖氧化酶与生物相容性材料的质量比为（6-9）：10，其中生物相容性材料的质量体积比为12-18%。
所述步骤b中交联工艺为热处理交联或戊二醛蒸汽交联；其中热处理交联温度130℃-160℃，时间60min；戊二醛蒸汽交联的温度设置为25℃，时间设置在10-60min。
静电纺丝的工艺参数为：温度25℃，湿度20%-30%，工作电压15kv，工作距离12cm，溶液流速0.5mL/h。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用静电纺丝法制备生物相容性材料的纳米纤维，并将其应用于葡萄糖生物传感器，提供了一种生物传感器的全新加工和制备工艺。实验结果证明无论是混合纺织的静电纺丝制备工艺所制造的静电纺丝葡萄糖探测膜或以拉涂法工艺制造的静电纺丝葡萄糖探测膜均比传统聚乙烯醇片体具有更高的探测灵敏性。静电纺丝葡萄糖感测膜具有以下特性：以145℃-155℃热处理交联，具有1.8μA/mM-2.0μA/mM的葡萄糖浓度对应感应电流灵敏度；或以蒸汽交联，交联时间5-15min时，具有8.0μ A/mM-8.5μA/mM的葡萄糖浓度对应感应电流灵敏度。本申请制备的纤维状探测薄膜有助于感测灵敏度的提高，使得本发明具备非常高的实用性，能够解决现有技术的诸多缺点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为通过拉涂法制备在不同温度下生产的静电纺丝葡萄糖探测膜中葡萄糖浓度对应感应电流的关系图。
图2为通过拉涂法制备的静电纺丝葡萄糖探测膜中温度对于探测膜灵敏度的关系图。
图3为聚乙烯醇与葡萄糖氧化酶混合纺织后以热处理交联固定结合的灵敏度对于温度的关系图。
图4为葡萄糖氧化酶与聚乙烯醇混合纺织的静电纺丝纤维的蒸气交联时间对于探测灵敏度关系图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明静电纺丝葡萄糖探测膜的实施例为包括一具备生物相容性的静电纺丝元件以及与所述静电纺丝元件固定结合的一葡萄糖氧化酶。所述静电纺丝元件的结构形状不限定，可以是片体、块体或线状物等；所述静电纺丝元件包含复数个采用由生物相容性材料制成的静电纺丝纤维，所述葡萄糖氧化酶固定结合于各静电纺丝纤维。所述固定结合方式，具体是指将葡萄糖氧化酶以物理性或化学性方法结合于所述静电纺丝元件的表面或内部的一部分，以使得静电纺丝葡萄糖探测膜与不同含量的葡萄糖接触时，能产生不同的电子或化学信号。
以下简述利用葡萄糖氧化酶感测葡萄糖含量的化学反应机理：葡萄糖氧化酶GOx可与葡萄糖glucose进行酶反应，还原态酶再与氧气进行电子转移生成H2O2 。通过检测H2O2生成量进而估算葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶的双核酸腺嘌呤黄素FAD虽然具有电化学活性中心，但双核酸腺嘌呤黄素FAD粒径约为25nm，且易被蛋白质高分子包围于内部，很难直接进行电子传递，必须藉由较小分子快速地进出酶层传递电子促使其反应，因此利用氧作为电子媒介物检测，其反应过程如下：
（1）glucose+GOx(O×) →gluconicacid+GOx(red)，式中的glucose与GOx反应使得氧化态的GOx-FAD转变为还原态的GOx-FADH2 ，并生成葡萄糖酸gluconic acid。
（2）GOx(red) +O2→GOx(OX) +H2O2；溶液中的氧气会将GOx-FADH2氧化回GOx-FAD并生成H2O2，而GOx-FAD又可再与glucose进行反应。
（3）H2O2→O2+2H++2e-；H2 O2 则会经由扩散来到电极表面，此时在电极表面施加足够大的氧化电位可使H2 O2 在电极表面上进行氧化反应。由于电流的大小会与H2O2 的浓度成正比，因此可以从电流的大小去推算H2O2的浓度再间接地定量glucose。
所述静电纺丝或称静电纺织，为一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下射流从一泰勒锥飞射出来而可用来制备连续纤维的加工技术，可制备几微米至几十纳米的纤维。透过静电纺丝的纳米纤维具有很高的表面积比和孔隙率，有很强的吸附能力。所述生物相容的静电纺丝元件，指所述静电纺丝元件采用生物相容性材质制成，顾名思义其对生物细胞或组织等属于无毒性或低毒性材质，或是具有生物亲和力、为水溶性高分子，例如PVA、PVP、PEO等。
本实施例使用聚乙烯醇，其静电纺丝的品质与聚乙烯醇的分子量、溶液酸碱(PH)值、小分子添加剂等参数有关。聚乙烯醇是一种无毒聚合物，具有较好的生物相容性、亲水性、力学强度和柔性、化学和热力学稳定性以及生物稳定性，且易制成薄膜，可用于制备固定酶。由于聚乙烯醇的电导率不高，且利用传统成形方式所制作的薄膜非常致密，采用该材料作为电流式生物探测组件的固定基材，不利于酶与薄膜内的电子传递，使得传统聚乙烯醇的酶探测灵敏性性能不佳。本实施例利用静电纺丝的制成方法，将聚乙烯醇抽丝成为纳米尺寸等级的纤维，如此，让包含复数个聚乙烯醇纤维的静电纺丝元件比采用传统的致密表面型态的聚乙烯醇片体有更高的比表面积、多孔隙等特性，因此能够使附着在所述静电纺丝元件的葡萄糖氧化酶有更多的反应机会和信号传导途径，由此能够大幅提高探测效果与灵敏度。
配合参考图1、图2、图3、图4，在制备方面，可通过如下步骤将葡萄糖氧化酶固定结合于静电纺丝元件：
（1）备置包含葡萄糖氧化酶的静电纺丝元件：可以透过拉涂法或混合静电纺织的制备工艺，让葡萄糖氧化酶可以初步结合于静电纺丝元件。
（1.1）拉涂法：所述拉涂法是指将完成纺丝的生物相容性静电纺丝纤维浸泡入含有葡萄糖化酶的溶液中，让葡萄糖氧化酶可以自行附着于静电纺丝纤维。将15%（w/v）的聚乙烯醇/水溶液在室温25℃，湿度25%，工作电压15kv，工作距离12cm，溶液流速0.5mL/h的静电纺丝工艺下生产包含复数个静电纺丝纤维的静电纺丝元件。将所述静电纺丝元件置于浓度为20%（w/v）的葡萄糖氧化酶/水溶液中，时间为45min，在该制备过程中制备温度为影响葡萄糖氧化酶附着于静电纺丝纤维的含量的重要参数，由此会影响葡萄糖的探测灵敏度。经过实际试验，在适当的制备温度下，葡萄糖氧化酶拉涂于静电纺丝纤维的表面。以传统制备方法制造聚乙烯醇片体作为对照组(film-0线段)，比较不同制备温度下，本实施例的聚乙烯醇静电纺丝在不同制备温度(0-50℃，分别为fiber-0、 fiber-15、fiber-30、fiber-50线段)下进行拉涂，其葡萄糖浓度(Glucose Conc.(mM)，横座标)对感应电流(Current(uA)，纵座标)的电化学测量结果如图1所示。由此可知，随着温度增加，聚乙烯醇静电纺丝纤维具有的感应电流相对较大，其中，最佳的制备温度约为50℃，如图2所示。
（1.2）混合静电纺丝：指将葡萄糖氧化酶加入并混合于聚乙烯醇静电纺丝之前的原始材料或溶液中，并通过静电纺丝制备工艺将混和有葡萄糖氧化酶的静电纺丝一起抽丝成形。制备浓度15%（w/v）的聚乙烯醇/葡萄糖氧化酶/水溶液（葡萄糖氧化酶：水=20:100，w/v），在室温25℃，湿度25%，工作电压15kv，工作距离12cm，溶液流速0.5mL/h的静电纺丝工艺下制备包含所述葡萄糖氧化酶与所述聚乙烯醇的静电纺丝纤维膜。
如图1所示，本实施例的混合静电纺丝(标记为GOD in fiber)所完成的静电纺丝葡萄糖探测膜其葡萄糖浓度对感应电流的结果相较于传统聚乙烯醇片体载体具有提升感应电流的效果。
（2）固定结合(交联)：将所述静电纺丝纤维与葡萄糖氧化酶通过一交联制备工艺以固定结合。交联制备工艺的方式可以是热处理交联或戊二醛蒸汽交联。以混合静电纺丝为例说明两种交联处理工艺的差异：
（2.1）热处理交联：如图3所示，其为聚乙烯醇与葡萄糖氧化酶混合纺织后以热处理交联(标示为fiber/GOx图柱)的灵敏度，图3中加入各葡萄糖氧化酶以不同制备温度的拉涂法工艺的灵敏度测量结果做为比较，发现以交联温度145℃，交联时间60min的热处理交联后的聚乙烯醇静电纺丝与葡萄糖氧化酶混合纺丝的灵敏度最高，与以50℃制备温度的拉涂法方式得到的静电纺丝葡萄糖探测膜差异不大。
（2.2）戊二醛蒸汽交联：为避免热处理交联时的高温可能造成葡萄糖氧化酶失去活性，另外可以利用戊二醛蒸汽交联反应，让葡萄糖氧化酶完全与静电纺丝纤维固定结合。戊二醛蒸汽交联反应，为将完成混合纺织的葡萄糖氧化酶与聚乙烯醇静电纺丝纤维置于25℃戊二醛之蒸汽中，使葡萄糖氧化酶与聚乙烯醇静电纺丝得以进行交联反应。本实施例采用蒸汽交联的原因在于聚乙烯醇为水溶性高分子，而本实施例又将聚乙烯醇制作成比表面积非常大的纳米等级静电纺丝，为了避免聚乙烯醇静电纺丝置于交联溶液在完成交联之前就已经因为急速溶胀而溶解于交联溶液中，本实施例将戊二醛交联液蒸汽化对葡萄糖氧化酶与聚乙烯醇混合纺织的静电纺丝纤维进行交联。
参见图4，其为葡萄糖氧化酶与聚乙烯醇混合纺织的静电纺丝纤维的蒸汽交联时间(cross-link time,横轴)对于探测灵敏度(sensitivity,纵轴)关系图，图4显示随着蒸汽交联时间增加，聚乙烯醇的交联度增大，但蒸汽交联时间超过一临界值之后感测灵敏度开始下降。该检测数据显示临界值之前(约为5-15min)随着交联度增加，葡萄糖氧化酶固定化效果更佳而使灵敏度得以提升；而在15min时有一最佳灵敏度；超过临界值(约为15-120min)后随着交联度增加，本实施例的灵敏度反而骤降，这显示葡萄糖氧化酶于交联时间临界值之后开始快速失去活性。由此可知，本实施例将蒸汽交联时间控制于60min内可以产生良好的灵敏度，但最佳的交联时间约为15min左右，其可达到的最佳化灵敏度高达8.19μA/mM，比在0℃进行自组装制备工艺得到的静电纺丝纤维高了14.6倍，也比最佳化的50℃的拉涂工艺制备的静电纺丝纤维高了约4.4倍。
本发明利用静电纺丝法制备聚乙烯醇(PVA)纳米纤维，成功应用于葡萄糖生物探测器，提供了生物探测器的全新加工工艺。实验结果证明无论是混合纺织的静电纺丝制备工艺所制造的静电纺丝葡萄糖探测膜或以拉涂法制造的静电纺丝葡萄糖探测膜均比传统聚乙烯醇片体具有更高的感测灵敏性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种静电纺丝葡萄糖探测膜，其特征在于：包括静电纺丝元件及与静电纺丝元件固定结合的葡萄糖氧化酶；其中静电纺丝元件为包含复数个由生物相容性材料制成的静电纺丝纤维；其中生物相容性材料为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚氧化乙烯；所述固定结合指葡萄糖氧化酶与静电纺丝元件以热处理交联或以戊二醛蒸汽交联而产生的交联结合。
2.权利要求1所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）以生物相容性材料为原料制备纺丝液，通过静电纺丝方法制备静电纺丝元件；
（2）将步骤（1）制备的静电纺丝元件置于葡萄糖氧化酶溶液中进行拉涂；
（3）经步骤（2）处理的静电纺丝元件，经交联工艺，使静电纺丝元件中的纺丝纤维与葡萄糖氧化酶交联，得到静电纺丝葡萄糖探测膜。
3.根据权利要求2所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中纺丝液中生物相容性材料的质量体积比为12-18%。
4.根据权利要求2所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中葡萄糖氧化酶溶液的质量体积比为20%，温度为36-60℃，时间为45min。
5.根据权利要求2所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中交联工艺为热处理交联或戊二醛蒸汽交联，其中热处理交联温度130℃-160℃，时间60min，戊二醛蒸汽交联的温度设置为25℃，时间设置在10-60min。
6.权利要求1所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于，步骤如下：
a. 将葡萄糖氧化酶与生物相容性材料混合制备纺丝液，通过静电纺丝工艺制备静电纺丝纤维膜；
b. 利用交联工艺将步骤a的静电纺丝纤维膜中的静电纺丝纤维和葡萄糖氧化酶进行交联反应。
7.根据权利要求6所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于：所述步骤a中葡萄糖氧化酶与生物相容性材料的质量比为（6-9）：10，其中生物相容性材料的质量体积比为12-18%。
8.根据权利要求6所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于：所述步骤b中交联工艺为热处理交联或戊二醛蒸汽交联；其中热处理交联温度130℃-160℃，时间60min；戊二醛蒸汽交联的温度设置为25℃，时间设置在10-60min。
9.权利要求2-8任一项所述的静电纺丝葡萄糖探测膜的制备方法，其特征在于，静电纺丝的工艺参数为：温度25℃，湿度20%-30%，工作电压15kv，工作距离12cm，溶液流速0.5mL/h。
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