TWI487912B - 靜電紡絲葡萄糖感測膜及其製程方法 - Google Patents

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靜電紡絲葡萄糖感測膜及其製程方法
本發明是一種葡萄糖感測組件，尤其是關於一種靜電紡絲葡萄糖感測膜。
「生物感測器」為使用固定化之生物分子(immobilized biomolecules)結合傳感器，用以偵測生物體內、外之環境化學物質或特異性交互作用後，產生回應之一種裝置。其中葡萄糖感測器是許多生物感測器的重點，除了它的應用範圍廣泛，從醫療用途的血糖檢測裝置，到食品分析應用，同時它也提供研發新型生物感測器的技術平台。由於現代人飲食過量又缺乏運動，使得糖尿病的盛行率不斷攀升。據估計2000年全世界糖尿病患者數為1.71億人；在台灣糖尿病患者約占全體人口的4~5%，即全台約有100萬人罹患糖尿病。而目前診斷糖尿病主要依據血糖值高低來判斷，病人可以藉此控制血糖，因此攜帶型生物感測器顯得格外重要，此類型的感測器優點在於無需昂貴複雜的儀器設備，同時具有快速的訊號反應，加上電化學法的便利性有助於普及化，所以成為現今研究發展的熱門課題。
請參考第六圖，目前，用來進行葡萄糖感測器之核心－葡萄糖感測試紙，該葡萄糖感測試紙其為層狀組織，其包含一基材51以及依附固定鋪設於該基材51之一電極52、一阻絕層53、一感測層54、一附著層(未標示於圖中)及一親水層55，該葡萄糖感測試紙之感測層54接觸待測液體之後，其感測結果之電訊號由該電極傳導而出。
然而，因為既有之感測層54係利用傳統高分子薄膜的製造方式製成，其多數具有平滑的表面結構，使其比表面積受到限制而使其感測靈敏度不佳，透過該電極52傳導而出的電訊號相當微弱，使葡萄糖感測器之判讀結果可能出錯，不僅可能造成誤診，更因為需要經常重測而因此影響使用便利性。
配合解決既有之葡萄糖感測技術靈敏度不佳、容易造成誤診、使用不便等技術問題，本發明利用靜電紡絲聚乙烯醇(PVA)製作具有高比表面積之奈米纖維膜，大幅提昇葡萄糖生物感測之靈敏度，解決既有技術之缺點，改善使用不便、成效不彰的技術問題。
本發明提供一種靜電紡絲葡萄糖感測膜，其包含一生物相容之靜電紡絲元件以及與該靜電紡絲元件的固定結合之一葡萄糖氧化酵素，該靜電紡絲元件包含複數個以生物相容性材料製成之靜電紡絲纖維，該葡萄糖氧化酵素固定結合於各靜電紡絲纖維。
其中，該靜電紡絲纖維之材質為聚乙烯醇。
其中，該靜電紡絲元件為片體、塊體或線狀物。
其中，該固定結合為為該靜電紡絲纖維與葡萄糖氧化酵素產生交聯。
本發明再一種靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，其步驟包含：
(1)利用一靜電紡織方法產生包含複數個靜電紡絲纖維之一聚乙烯醇之靜電紡絲元件；
(2)將該靜電紡絲元件置於一含有葡萄糖氧化酵素之溶液中，該溶液之一製程溫度介於0～60 ℃；
(3)利用一交聯製程將該靜電紡絲纖維與該葡萄糖氧化酵素產生交聯。
其中，該製程溫度為50 ℃。
其中，該交聯製程為一熱處理交聯或一戊二醛蒸汽交聯。
其中，該戊二醛蒸汽交聯之時間60分鐘以內；該熱處理交聯之溫度為145 ℃。
本發明又提出一種靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，其步驟包含：
(1)將一葡萄糖氧化酵素與一聚乙烯醇混合，並透過一靜電紡絲製程產生包含該葡萄糖氧化酵素與該聚乙烯醇之一靜電紡絲元件；
(2)　利用一交聯製程將該靜電紡絲纖維與該葡萄糖氧化酵素產生交聯。
藉此，本發明利用靜電紡絲法製備聚乙烯醇(PVA)奈米纖維，成功應用於葡萄糖生物感測器，提供了生物感測器一全新加工製程加工視窗與技術。實驗結果證明無論是混合紡織之靜電紡絲製程所產生的靜電紡絲葡萄糖感測膜或以自組裝製程製造之靜電紡絲葡萄糖感測膜均可以比傳統聚乙烯醇片體具有非常高之感測靈敏性。由前述結果，可以證實纖維狀之感測薄膜確實有助於感測靈敏度的提升，讓本發明具備非常高的實用性，完全解決既有技術之諸多缺點。
本發明靜電紡絲葡萄糖感測膜之較佳實施例包含一生物相容之靜電紡絲元件以及與該靜電紡絲元件的固定結合之一葡萄糖氧化酵素(glucose oxidase，GOx)。該靜電紡絲元件之外觀形貌不限定，可以是片體、塊體或線狀物等；該靜電紡絲元件包含複數個以生物相容性材料製成之靜電紡絲纖維，該葡萄糖氧化酵素固定結合於各靜電紡絲纖維。所謂之固定結合，指將葡萄糖氧化酵素以物理性或化學性方法結合於該靜電紡絲元件之表面或內部之局部，讓該靜電紡絲葡萄糖感測膜與不同含量之一葡萄糖(glucose)接觸時，能產生不同的電子或化學訊號。
以下簡述利用葡萄糖氧化酵素感測葡萄糖含量之化學反應機制原理：葡萄糖氧化酵素(GOx)可與葡萄糖(glucose)進行酵素反應，還原態酵素再與氧氣進行電子轉移生成H2 O2 。透過偵測H2 O2 生成量進而估算葡萄糖含量。GOx之雙核酸腺嘌呤黃素(flavine adenine dinucleotide，FAD)雖具電化學活性中心，但FAD粒徑約為25，且易被蛋白質高分子包圍於內部，很難直接進行電子傳遞，必須藉由較小分子快速地進出酵素層傳遞電子促使其反應，故利用氧當電子媒介物感測之，其反應路徑如下：
(1)glucose+GOx(O×) →gluconic acid+GOx(red) ，式中的glucose與GOx反應使得氧化態的GOx-FAD轉變為還原態的GOx-FADH2 ，並生成葡萄糖酸(gluconic acid)。
(2)GOx(red) +O2 →GOx(OX) +H2 O2 ；溶液中的氧氣會將GOx-FADH2 氧化回GOx-FAD並生成H2 O2 ，而GOx-FAD又可再與glucose進行反應。
(3)H2 O2 →O2 +2H+ +2e- ；H2 O2 則會經由擴散來到電極表面，此時在電極表面施加足夠大的氧化電位可使H2 O2 在電極表面上進行氧化反應。由於電流的大小會與H2 O2 的濃度成正比，因此可以從電流的大小去推算H2 O2 的濃度再間接地定量glucose。
前述之靜電纺絲(或稱靜電紡織，Electronspinning)，是一種利用聚合物溶液或熔體在強電場作用下射流從一泰勒錐飛射出來，而可用來製備連續纖維的加工技術，可製備幾微米至幾十奈米的纖維。透過靜電紡絲之奈米纖維具有很高的表面積比和孔隙率，有很強的吸附能力。所謂的生物相容之靜電紡絲元件，指該靜電紡絲元件採用生物相容性材質製成，顧名思義其對生物之細胞或組織等屬於無毒性或低毒性材質，或是具有生物親和力、為水溶性之高分子，例如聚乙烯醇(PVA)、Polyvinylpyrrolidone(PVP)、polyethylene oxide(PEO)等。
本實施例使用之聚乙烯醇，其靜電紡絲之品質與聚乙烯醇的分子量、溶液酸鹼(PH)值、小分子添加劑等參數有關(Zhang C.,Yuan X.,Wu L. et al.,J. Euro. Polym.,2005,41,423-432；Koski A.,Yim K.,Shivkumar S.,Mater. Lett.,2004,58,493-497.；Lee J. S.,Choi K. H.,Ghim H. D. et al. J. Appl. Polym. Sci.,2004,93,1638-1646.；Son W. K.,Youk J. H.,Lee T.S. et al.,Mater. Lett.,2005,59,1571-1575.)。聚乙烯醇是一種無毒聚合物，具有較好的生物相容性、親水性、力學強度和柔性、化學和熱力學穩定性以及生物穩定性，且易製成薄膜，可用於製備固定酵素。由於聚乙烯醇之電導率不高，且利用傳統成形方式所製作的薄膜非常緻密(如第一A圖所示)，取之做為電流式生物感測組件之固定基材，非常不利於酵素與薄膜內之電子傳遞，故使傳統聚乙烯醇之酵素的感測靈敏性性能不佳。本實施例利用靜電紡絲之製成方法，將聚乙烯醇抽絲成為奈米尺寸等級的纖維，如此，讓包含複數個聚乙烯醇纖維之該靜電紡絲元件比之於傳統之緻密表面型態的聚乙烯醇片體有很高的比表面積、多孔隙等特性(如第一B圖所示)，故可讓附著該靜電紡絲元件之葡萄糖氧化酵素有更多的反應機會與訊號傳導途徑，藉此大幅提昇感測效果與靈敏度。
請配合參考第二圖、第三A圖、第三B圖、第四圖，在製程方面，可透過下列步驟將葡萄糖氧化酵素固定結合於靜電紡絲元件：
(1)備置包含葡萄糖氧化酵素之靜電紡絲元件：可以透過自組裝(dip coating)或混合靜電紡織(co-electrospinning)之製程，讓葡萄糖氧化酵素可以初步結合於靜電紡絲元件。
(1.1)自組裝：所謂的自組裝指將完成紡絲之生物相容之靜電紡絲纖維浸泡入含有葡萄糖氧化酵素之溶液中，讓葡萄糖氧化酵素可以自行附著於靜電紡絲纖維。葡萄糖氧化酵素自組裝於靜電紡絲纖維的一製程溫度為影響葡萄糖氧化酵素附著於靜電紡絲纖維之含量之重要參數，更進一步影響葡萄糖的感測靈敏度。經過實際試驗，在適當的製程溫度下，葡萄糖氧化酵素自組裝於靜電紡絲纖維之表面。以傳統製程聚乙烯醇片體作為對照組(film-0線段)，比較不同製程溫度下，本實施例之聚乙烯醇靜電紡絲在不同製程溫度(0~50℃，分別為fiber-0、fiber-15、fiber-30、fiber-50線段)下進行自組裝，其葡萄糖濃度(Glucose Conc.(mM)，橫座標)對感應電流(Current(uA)，縱座標)之電化學測量結果如第二圖所示。由此可知，隨著溫度增加，聚乙烯醇靜電紡絲纖維具有之感應電流相對較大，其中，最佳的製程溫度約為50度，如第三圖所示。
(1.2)混合靜電紡絲：係指將葡萄糖氧化酵素加入並混合於聚乙烯醇靜電紡絲之前的原始材料或溶液中，並透過靜電紡絲製程將混和有葡萄糖氧化酵素之靜電紡絲一起抽絲成形。如第二圖所示，本實施例之混合靜電紡絲(標示為GOD in fiber)所完成的靜電紡絲葡萄糖感測膜其葡萄糖濃度對感應電流之結果相較於傳統聚乙烯醇片體載體具有提升感應電流效果。
(2)固定結合(交聯)：將該靜電紡絲纖維與葡萄糖氧化酵素透過一交聯製程予以固定結合。交聯製程的方式可以是一熱處理交聯或一戊二醛蒸汽交聯。以混合靜電紡絲為例說明兩種交聯處理製程的差異：
(2.1)熱處理交聯：如第四圖所示，其為聚乙烯醇與葡萄糖氧化酵素混合紡織後以熱處理交聯(標示為fiber/GOx圖柱)之靈敏度，第四圖中亦加入各葡萄糖氧化酵素以不同製程溫度之自組裝製程之靈敏度量測結果做為比較，發現以145℃熱處理交聯後之聚乙烯醇靜電紡絲與葡萄糖氧化酵素混合紡絲之靈敏度相當優異，與以50℃製程溫度之自組裝方式差異不大。
(2.1)戊二醛蒸汽交聯：為避免熱處理交聯時之高溫可能造成葡萄糖氧化酵素失去活性，另外可以利用一戊二醛蒸汽交聯反應，讓葡萄糖氧化酵素完全與靜電紡絲纖維固定結合。在戊二醛蒸汽交聯反應，係將完成混合紡織的葡萄糖氧化酵素與聚乙烯醇靜電紡絲纖維置於戊二醛之蒸汽中，使葡萄糖氧化酵素與聚乙烯醇靜電紡絲得以進行交聯反應。本實施例採用蒸汽交聯之原因，係因為聚乙烯醇為水溶性之高分子，而本實施例又將聚乙烯醇製作成比表面積非常大的奈米等級靜電紡絲，為了避免聚乙烯醇靜電紡絲置於交聯溶液在完成交聯之前就已經因為急速溶脹而溶解於交聯溶液中，本實施例遂將戊二醛交聯液蒸汽化對葡萄糖氧化酵素與聚乙烯醇混合紡織之靜電紡絲纖維進行交聯。
請參考第五圖，其為葡萄糖氧化酵素與聚乙烯醇混合紡織之靜電紡絲纖維之蒸氣交鏈時間(cross-link time,橫軸)對於感測靈敏度(sensitivity,縱軸)關係圖，圖中顯示隨著蒸氣交鏈時間增加，聚乙烯醇之交聯度增大，但蒸氣交鏈時間超過一臨界值之後感測靈敏度開始下降。此一結果代表臨界值之前(約為5~15min)隨著交鏈度增加，葡萄糖氧化酵素固定化效果更佳而使靈敏度得以提升；而在15min時有一最佳化之靈敏度；超過臨界值(約為15~120min)後隨著交鏈度增加，本實施例之靈敏度反而驟降，這顯示葡萄糖氧化酵素於交聯時間臨界值之後開始快速的失去活性。由此可知，本實施例將蒸汽交聯時間控制於60分鐘內可以產生良好的靈敏度，但最佳之交聯時間約為15min左右，其可達到之最佳化靈敏度高達8.19μA/mM，比前述在0℃進行自組裝製程之靜電紡絲纖維高了14.6倍，也比最佳化之50℃之自組裝製程之靜電紡絲纖維高了4.4倍。
本發明利用靜電紡絲法製備聚乙烯醇(PVA)奈米纖維，成功應用於葡萄糖生物感測器，提供了生物感測器一全新加工製程加工視窗與技術。實驗結果證明無論是混合紡織之靜電紡絲製程所產生的靜電紡絲葡萄糖感測膜或以自組裝製程製造之靜電紡絲葡萄糖感測膜均可以比傳統聚乙烯醇片體具有非常高之感測靈敏性。由前述結果，可以證實纖維狀之靜電紡絲確實有助於感測靈敏度的提升，讓本發明具備非常高的實用性。
51．．．基材
52．．．電極
53．．．阻絕層
54．．．感測層
55．．．親水層
第一A圖為傳統聚乙烯醇片體之葡萄糖感測組件之表面電子顯微鏡圖。
第一B圖為本發明較佳實施例之聚乙烯醇靜電紡絲表面型態電子顯微鏡圖。
第二圖為本發明較佳實施例之葡萄糖濃度對感測電流之量測結果圖。
第三圖為本發明較佳實施例之自組裝製程溫度對感測靈敏度之量測結果圖。
第四圖為本發明較佳實施例之自組裝製程與混合紡織製程之量測靈敏度之比較圖。
第五圖為本發明較佳實施例之一蒸汽交聯時間對感測靈敏度之量測結果圖。
第六圖為既有之一葡萄糖感測試紙之層狀分解示意圖。

Claims (8)

  1. 一種靜電紡絲葡萄糖感測膜，其包含一生物相容之靜電紡絲元件以及與該靜電紡絲元件的固定結合之一葡萄糖氧化酵素，該靜電紡絲元件包含複數個以生物相容性材料製成之靜電紡絲纖維，該葡萄糖氧化酵素固定結合於各靜電紡絲纖維，該靜電紡絲纖維之材質為聚乙烯醇，該固定結合為該靜電紡絲纖維與葡萄糖氧化酵素以一熱處理交聯或一戊二醛蒸汽交聯而產生交聯，該戊二醛蒸汽交聯之時間60分鐘以內，其中，該靜電紡絲葡萄糖感測膜具有以下之特性：以145℃~155℃熱處理交聯，具有1.8μA/mM~2.0μA/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度；或以蒸汽交聯，交聯時間5~15分鐘時，具有8.0μA/mM~8.5μA/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的靜電紡絲葡萄糖感測膜，該靜電紡絲元件為片體或線狀物。
  3. 一種靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，其步驟包含；(1)利用一靜電紡織方法產生包含複數個靜電紡絲纖維之一聚乙烯醇之靜電紡絲元件；(2)將該靜電紡絲元件置於一含有葡萄糖氧化酵素之溶液中，該溶液之一製程溫度介於0~60℃；(3)利用一交聯製程將該靜電紡絲纖維與該葡萄糖氧化 酵素產生交聯，該交聯製程為一熱處理交聯或一戊二醛蒸汽交聯，該戊二醛蒸汽交聯之時間60分鐘以內，其中，該靜電紡絲葡萄糖感測膜具有以下之特性：以145℃~155℃熱處理交聯，具有1.8μA/mM~2.0μA/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度；或以蒸汽交聯，交聯時間5~15分鐘時，具有8.0μ A/mM~8.5μ A/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度。
  4. 如申請專利範圍第3項之靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，其中該製程溫度為50℃。
  5. 如申請專利範圍第3或4項之靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，該戊二醛蒸汽交聯之時間60分鐘以內；該熱處理交聯之溫度為145℃。
  6. 一種靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，其步驟包含：(1)將一葡萄糖氧化酵素與一聚乙烯醇混合，並透過一靜電紡絲製程產生包含該葡萄糖氧化酵素與該聚乙烯醇之一靜電紡絲元件；(2)利用一交聯製程將該靜電紡絲纖維與該葡萄糖氧化酵素產生交聯，該交聯製程為一熱處理交聯或一戊二醛蒸汽交聯，其中，該靜電紡絲葡萄糖感測膜具有以下之特性：以145℃~155℃熱處理交聯，具有1.8μA/mM~2.0μA/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度；或 以蒸汽交聯，交聯時間5~15分鐘時，具有8.0μ A/mM~8.5μ A/mM之葡萄糖濃度對應感應電流靈敏度。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，該戊二醛蒸汽交聯之時間60分鐘以內；該熱處理交聯之溫度為145℃。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的靜電紡絲葡萄糖感測膜之製造方法，該戊二醛蒸汽交聯之時間為15分鐘。
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