JP2009500620A - アスペルギルス感染のためのinvitro診断法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
免疫不全の集団における侵襲性アスペルギルス症発生のピークは、現在では、免疫系が再初期化される時期である移植6ヶ月後にその発現時期が変わってきている(Morgan et al., 2004, Med. Mycol. 00:1-10)。さらに、最近の臨床学的調査では、集中治療室において血液学的な悪性腫瘍のない患者におけるIAの罹患率の増加が示された(Meersseman et al., 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:621-625)。これらの、比較的免疫適格である患者におけるIAは、アスペルギルスに対する抗体力価の増加に関連している可能性がある。また、患者は、アスペルギルスに侵されていながら移植されている可能性があることも示唆されている(しかし、詳細には調べられてはいない)。移植される患者における免疫抑制に先立って認められる高い抗体力価は、既存のアスペルギルス感染を示唆するものであり、菌学的検査および/または抗真菌薬の予防的処置の指標となり得る。
a)前記抗体および前記抗原との間で得ることができる免疫複合体の形成のために、前記血清または血漿サンプルをアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、および、
b)アスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定すること、
を含み、
アスペルギルス抗原は、下記抗原:
リボヌクレアーゼ(RNU)抗原、
カタラーゼ(CA)抗原、および
ジペプチジルペプチダーゼV(DPPV)抗原、
の少なくとも2つの組合せからなる群から選択される、方法に関する。
これらの抗原を得るためには、例えば、精製、化学合成(固相法)または前記抗原をコードする核酸および発現ベクター(以下参照)を用いる分子生物学などの、当業者に十分公知のいずれの方法を用いてもよい。
a)前記血清または血漿サンプルを、ELISAプレート上にコーティングされたアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、
b)ELISAプレートからアスペルギルス抗原と結合していない前記血清または血漿サンプルの抗体を除去すること、
c)酵素とコンジュゲートさせた抗免疫グロブリン(抗Ig)抗体と接触させること(ここで、前記抗Ig抗体は、前記血清または血漿サンプルの該抗体と結合可能である)、
d)ELISAプレートから前記血清または血漿サンプルの該抗体と結合していない抗Ig抗体を除去すること、
e)酵素に対応する可溶性基質を加えること、および
f)ELISAプレートのウェルの吸光度の値をELISAリーダーにて適切な波長で読み取ること、
を含んでなり、
前記抗体の量が、得られた吸光度の値により決定される。
アルカリ性ホスファターゼおよび可溶性基質4−ニトロフェニルリン酸(PNPP);
ペルオキシダーゼおよび可溶性基質オルトフェニレンジアミン(OPD);
β−ガラクトシダーゼおよび可溶性基質2−ニトロフェニルβ−ガラクトシド(ONPG);または
グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼおよび可溶性基質グルコース−6−リン酸(G6P)
からなる群から選択される。
(a)下記アスペルギルス抗原:
RNU抗原、
CA抗原、および
DPPV抗原
の少なくとも2つの組み合わせを含んでなる、診断キットに関する。
(b)マーカーとコンジュゲートさせた抗Ig抗体を含有する溶液
をさらに含む。
(c)洗浄バッファー
をさらに含む。
(d)酵素に対応する可溶性基質を含有する溶液
をさらに含む。
RNU抗原、
CA抗原、および
DPPV抗原
の少なくとも2つの組合せの使用に関する。
1.菌株およびプラスミド
使用する菌株A.フミガーツスは、臨床由来の菌株CBS144.89である。組換え抗原を発現させるために、ピキア・パストリスGS115およびKM71、ならびに発現ベクターpKJ111(Monod M. et al, 1999)、pKJ113(Borg-von Zepelin M. et al., 1998)、pHILS1およびpPICZαA(Invitrogen)を用いた。総てのプラスミドクローニング実験は、大腸菌(E. coli)XL1blueにおいて行った。バクテリオファージλgt11(Promega)の増殖用には大腸菌LE392を使用した。
A.フミガーツス抗原のcDNAは、あらかじめ構築されたλgt11のcDNAライブラリーの106クローンから調製されたDNAを用い、PCRにより得た(Monod M. et al.,1991)。プライマーは、アルカリプロテアーゼALP(Monod M. et al., 1993, FEMS Microbiol Lett.106:39-46)、メタロプロテアーゼMEP(Jaton-Ogay et al., 1994, Mol. Microbiol. 14:917-928)、アスパラギン酸プロテアーゼPEP(Reichard et al., 1995, FEMS Microbiol. Lett. 130:69-74)、リボヌクレアーゼRNU(Paris et al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:31-36)、スーパーオキシドジスムターゼSOD(Holdom et al.,2000, J. Clin. Microbiol. 38:558- 562)、カタラーゼCAT(Calera et al., 1997, Infect. Immun. 65:4718-4724)、ジペプチジルペプチドIV DPPIV(Beauvais et al., 1997, Infect. Imm. 65:3042-3047)、およびジペプチジルペプチダーゼV DPPV(Beauvais et al., 1997, J. Biol. Chem.:6238-6244)をコードする遺伝子のゲノムDNA配列から得た(表1)。標的DNAを200ng、濃度42mMのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ10μl、およびデオキシヌクレオチド混合物(dNTPをそれぞれ10mM含有)8μlを、PCRバッファー(10mM Tris−塩酸 pH8.3、50mM 塩化カリウムおよび1.5mM塩化マグネシウム)100μlに溶解させた。それぞれの反応物に、2.5UのAmpliTAQ DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を加えた。反応混合物を94℃にて5分間インキュベートし、94℃にて0.5分間、55℃にて0.5分間、および72℃にて0.5分間の25サイクルを行い、最後に72℃にて10分間インキュベートした。
従前に記載されているように(Hearn et al, 1990, In R. A. Samson and J.I.Pitt (ed.), Modern concepts in Penicillum and Aspergillus classification, Plenum Press, London, New York)、A.フミガーツスを培養槽の中で40時間増殖させた。ヒドラジンの商品化が終了したため、GMの精製は別のプロトコールに従って行った。該培養濾液をエタノールで沈澱させ、その沈殿物を最初に、アミラーゼ(バチルス・リケニフォルミス(Bacilluslicheniformis)由来、Sigma A4551参照)を、100mMの酢酸ナトリウムバッファーpH5.6中、1:30の割合で(乾重量)で用いて37℃にて3日間消化し、次に、プロナーゼ(ストレプトミセス・グリセウス(streptomyces griseus)由来、Sigma P5147参照)を1:6の割合で(乾重量)37℃で3日間インキュベートした。反応混合物を100℃にて10分間沸騰させ、さらに水酸化ナトリウム(1M終濃度)の存在下で60℃にて1時間処理した。中和した後、GMを透析して凍結乾燥させた。GMの純度は、前述のように(Fontaine et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:27594-27607, Large et al., 1994, Infect. Immun. 62:5424-5433)ガスクロマトグラフィーにより確認した。
病変は、それぞれの病院で確立されている基準に従って、臨床症状に基づいて各施設で特定した。3つの施設で、57人のアスペルギルス腫患者、および41人の対照を採用した(トゥールーズ、グルノーブルおよびストラスブール)。さらに、トゥールーズの施設では、患者あたり2〜9(平均3.9)サンプルを連続して採取した。トゥールーズおよびグルノーブルの施設では、嚢胞性繊維症集団中の16人のABPA患者および51人の対照を分析した。嚢胞性繊維症ではない集団中の12人のABPA患者を27人の対照と比較した。トゥールーズにおいては、14人のABPA患者(嚢胞性繊維症または非嚢胞性繊維症バックグラウンド)の患者ごとの連続サンプル(3〜16、平均8.6)が利用可能であった。総てのIA患者は、セントルイス病院(パリ)由来であり:23人はIAであることが判明しているかまたはIAであると疑われ、21人はIAである可能性があり、および34人は対照であり、IA患者として免疫抑制または/および移植されていた。それぞれの一連の患者に対して、1〜5サンプル(平均7.5)、2〜11サンプル(平均6)、および1〜12サンプル(平均3.9)が、それぞれ、IAであると判明している/疑われる患者、IAである可能性がある患者、および対照患者について入手可能であった。移植前または免疫抑制療法開始前に、患者あたり1〜7血清もまた入手可能であった。
メーカーの取扱説明書に適応させた後、Beckman−IEP Paragon systemを用いて、高速の免疫電気泳動を行った。要するに、アスペルギルスの菌体抗原および代謝産物抗原(Sanofi Pasteur Diagnosis, Marnes la Coquette, France)の泳動を、100Vにて12分間行った。原血清と共に18〜24時間インキュベーションを持続させた。クエン酸ナトリウムで洗浄した後、カタラーゼ活性を持つ沈降素の存在を3%過酸化水素を用いて可視化し、乾燥させたゲルをクーマシーブルー染色またはパラゴンバイオレットアシッド染色した後に沈降素の総数を計数した。
カタラーゼは4μg/mlでコーティングした以外は、総ての抗原は1μの濃度で、総てのタンパク質抗原およびガラクトマンナンを用いてELISAプレート(Greiner Ref. 762070)をコーティングした。コーティングの後、ウェルを空にして、2%Tween20を添加したPBS300μlで満たした。室温にて1時間インキュベーションした後、PBS/Tween溶液を、5%グルコースおよび2.5%脱脂乳を含有するPBS300μlと交換し、プレートを室温にて2分間インキュベートした。ウェルを再び空にし、オーブン中で60℃にて10分間乾燥させた。乾燥後、プレートを凍結保存した。抗原のコーティング濃度およびプロトコールは、これらの濃度が抗アスペルギルス抗体を多量に含有することが知られているアスペルギルス腫患者由来の血清プールの最適なOD値の読み取りを保証することを示した予備試験に基づくものであった。患者血清は、0.05%Tween20および1%BSAを含有するPBS中で500倍希釈した。トゥールーズおよびセントルイス由来の血清は、発明者の研究所で分析した。グルノーブルおよびストラスブールの血清は、従来の以下の工程:患者血清と共に37℃にて1時間インキュベーションし;0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄し;ペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた二次抗IgG(H+L)抗体(Sigma)と共にインキュベーションし;5回洗浄し、OD値読み取りのためにオルトフェニレンジアミン(OPD)と共にインキュベーションすることを含む、パスツールで用いられているプロトコールに従って現地で試験した。実験は二重測定で行い、少なくとも1回は繰り返した。
データの統計学的解析は、JMPソフトウエア(SAS, Cary, NC)を用いて行った。平均値を算出し、標準誤差はコンピューターで計算した。用いた方法は、分散分析に続いて、スチューデントのt検定により解析された最小二乗平均差を用いる平均の順位付けであった。有意性を求めるために、ピアソン相関のr値を用いる密度楕円フィッティングを介して、1つの連続可変量の別の可変量に対する分布を分析する二変量解析を行った。判別分析では、抗原に対するOD値を、病変に基づいてあらかじめ定義された患者群に分類した。解析は、群の分類に最も適した、二次元においてポイントおよび多変量平均を示す正準プロットとして提示した。感度、特異性、陰性的中率および陽性的中率は、対照患者から計算した最適カットオフ値に基づいて推定した。
1.アスペルギルス腫
図1は、タンパク質抗原のうちで、DPPV、カタラーゼおよびリボヌクレアーゼ抗原が、患者と対照の間を最も判別することを示す。対照血清における抗体レベルは高いが、DPPIVもまた、アスペルギルス腫患者の同定に有用であった。一方では、プロテアーゼ(アスパラギン酸、メタロおよびセリン−プロテアーゼ)ならびにスーパーオキシドジスムターゼはアスペルギルス腫患者において特異的な液性応答反応を誘発しなかった(セリンプロテアーゼについてはデータは示されていない)。3元配置分散分析では、施設×抗原×病変の相互作用因子に関して有意な応答(p=0.03)が示された。これは、トゥールーズの患者では判別されたが、他の施設においては判別されなかったDPPIVに対する応答に起因するものであった(データは示されていない)。その一方で、リボヌクレアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびカタラーゼの判別効率は、3施設において良好であった。抗RNU、抗CATおよび抗DPPV抗体レベルは、試験を行った総ての3つの施設の患者集団において、対照集団よりも有意に高かった。表2は、試験に含められる抗原の数が増えると共に、試験の感度が高くなることを示している;3つの抗原を用いて得られたOD値をコンピューターで計算した場合、最大値95%に達した。その一方で、複数の抗原を使用した場合、特異性の値はわずかに低下した。
ABPAは嚢胞性繊維症患者ならびに非嚢胞性繊維症患者双方の主要な合併症である。嚢胞性繊維症患者は多くの場合、アスペルギルスが定着し、この定着が高いレベルの抗アスペルギルス抗体を伴っている場合があり、これが、嚢胞性繊維症集団において定着患者と本当のABPA患者を識別することを困難にしている。このため、本発明者らは、嚢胞性繊維症を有しない対照、嚢胞性繊維症を有する対照、嚢胞性繊維症を有しないABPAおよび嚢胞性繊維症を有するABPA、の4集団の患者を分析した。
免疫適格集団またはアトピー集団において病態を示した最も判別性の高い抗原がRNU、CATおよびDPPVであったことから、これら3つの抗原を試験し、侵襲性アスペルギルス症における抗体の状態を調べた。さらに、GMに対する抗体は、アスペルギルス腫患者の肺組織における真菌増殖に関連し(上記参照)、また、ガラクトマンナン抗原血症の検出に基づくIAの診断に用いられるPlateliaキットで得られる偽陰性の原因であることが示唆された(Hearn et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:982-986; Herbrecht et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20:1898-906)ことから、この抗体を分析した。IAであることが判明している、またIAが疑われる免疫不全患者および同じ臨床処置を受けたが真菌感染が見られなかった対照のコホートにおいて、これら4つの抗原に対する抗体レベルを測定した。
ELISA形式を用いた、種々のクラスのアスペルギルス症患者の抗体応答に関するこの研究では、本発明者らの研究室でこれまでに同定されたリボヌクレアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼVおよび菌糸カタラーゼ1である3つの組換え抗原の重要な診断可能性が示された(Beauvais et al., 1997, Infect. Imm. 65:3042-3047; Calera et al., 1997, Infect. Immun. 65:4718-4724; Large, J., 1999, Clin. Microbiol. Rev. 12:310-350; Paris, S. et al., 1993, FEMS Microbiol. Lett. 111:31-36)。
Claims (31)
- 被験体の血清または血漿サンプルにおいてアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定することによる、アスペルギルス感染のin vitro診断法であって、
a)前記抗体および前記抗原との間で得ることができる免疫複合体の形成のために、前記血清または血漿サンプルを、アスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、および、
b)該アスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定すること、
を含んでなり、該アスペルギルス抗原が、下記抗原:
リボヌクレアーゼ(RNU)抗原、
カタラーゼ(CA)抗原、および
ジペプチジルペプチダーゼV(DPPV)抗原、
の少なくとも2つの組み合わせからなる群から選択される、診断法。 - 工程(b)において、陰性参照の血清または血漿サンプルで得られた量と比較して、前記2つの抗原の少なくとも1つの抗原に対する抗体の有意に上回る量が決定されることが、アスペルギルス感染の指標となる、請求項1に記載の方法。
- アスペルギルス抗原が固相支持体上にコーティングされている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記抗原のそれぞれが、固相支持体上の異なる位置にコーティングされている、請求項3に記載の方法。
- 固相支持体が酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)プレートであり、該方法が、
a)前記血清または血漿サンプルを、該ELISAプレート上にコーティングされたアスペルギルス抗原と共にインキュベートすること、
b)ELISAプレートから、アスペルギルス抗原と結合していない前記血清または血漿サンプルの抗体を除去すること、
c)酵素をコンジュゲートさせた抗免疫グロブリン(抗Ig)抗体を接触させること(ここで、抗Ig抗体は、前記血清または血漿サンプルの抗体と結合できる、
d)ELISAプレートから、前記血清または血漿サンプルの抗体と結合していない抗Ig抗体を除去すること、
e)酵素に対応する可溶性基質を加えること、および
f)ELISAプレートのウェルの吸光度の値をELISAリーダーにて適切な波長で読み取ること、
を含んでなり、
前記抗体の量が、得られた吸光度の値により決定される、
請求項3または4に記載の方法。 - アスペルギルス抗原が、RNUおよびCA抗原の組み合わせを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- アスペルギルス抗原が、RNUおよびDPPV抗原の組み合わせを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- アスペルギルス抗原が、CAおよびDPPV抗原の組み合わせを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- アスペルギルス抗原が、RNU、CAおよびDPPV抗原の組み合わせを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- RNU、CAおよびDPPVアスペルギルス抗原の少なくとも1つが、組換え抗原である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの組換えアスペルギルス抗原が、発現ベクター中の対応するcDNAの増幅産物のクローニングにより得られる、請求項10に記載の方法。
- 対応するcDNAの増幅産物が、前記少なくとも1つのアスペルギルス抗原に特異的なプライマー対を用いて、アスペルギルス・フミガーツスのcDNAライブラリーから得られる、請求項11に記載の方法。
- RNU抗原に特異的なプライマー対が、配列番号lおよび配列番号2である、請求項12に記載の方法。
- CA抗原に特異的なプライマー対が、配列番号3および配列番号4である、請求項12または13に記載の方法。
- DPPV抗原に特異的なプライマー対が、配列番号5および配列番号6である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- アスペルギルス抗原が、さらにガラクトマンナン(GM)抗原を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- GM抗原が、アスペルギルス培養物から精製により得られる、請求項16に記載の方法。
- 特定のアスペルギルス菌株に対する検出シグナルの固有のプロフィールが決定される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- それぞれのアスペルギルス菌株に関して検出シグナルプロフィールと標準プロフィールを比較し、被験体が感染している菌株の同定を可能にすることをさらに含む、請求項18に記載の方法。
- アスペルギルス感染がアスペルギルス腫および/またはアレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)を引き起こす、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ABPAを引き起こすアスペルギルス感染が、嚢胞性繊維症に罹患している被験体ならびに嚢胞性繊維症に罹患していない被験体において診断される、請求項20に記載の方法。
- アスペルギルス感染が侵襲性アスペルギルス症であり、これが移植を受ける被験体において免疫抑制の前に診断可能である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫不全のヒトにおけるアスペルギルス感染の診断が可能である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 血清または血漿サンプルにおいてアスペルギルス抗原に対する抗体の量を決定するための診断キットであって、
(a)下記アスペルギルス抗原の少なくとも2つの組み合わせ:
RNU抗原、
CA抗原、および
DPPV抗原
を含んでなる、キット。 - 前記アスペルギルス抗原がコーティングされている固相支持体をさらに含む、請求項24に記載の診断キット。
- (b)マーカーをコンジュゲートさせた抗Ig抗体を含有する溶液
をさらに含んでなる、請求項24または25に記載の診断キット。 - (c)洗浄バッファー
をさらに含む、請求項24〜26のいずれか一項に記載の診断キット。 - アスペルギルス抗原が、RNU、CAおよびDPPV抗原の組み合わせを含んでなる、請求項24〜27のいずれか一項に記載の診断キット。
- アスペルギルス抗原が、GM抗原をさらに含んでなる、請求項24〜28のいずれか一項に記載の診断キット。
- 固相支持体がELISAプレートであり、マーカーが酵素である、請求項25〜29のいずれか一項に記載の診断キット。
- (d)酵素に対応する可溶性基質を含有する溶液
をさらに含んでなる、請求項30に記載の診断キット。
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