CN115656518A

CN115656518A - 一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒

Info

Publication number: CN115656518A
Application number: CN202211310263.3A
Authority: CN
Inventors: 邹继华; 邵绯霞; 刘献文; 仇玲玲; 方亮; 邹炳德
Original assignee: Medical System Biotechnology Co ltd
Current assignee: Medical System Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-01-31

Abstract

本发明公开了一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，属于外诊断试剂、生物工程技术交叉领域，本发明提供的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，本试剂盒可消除同源样本干扰，可用于尿液样本检测，具有检测速度快、线性范围好、稳定性好的特点。

Description

一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂、生物工程技术交叉领域，具体而言，涉及一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒。

背景技术

肝素结合蛋白(Heparin Binding Protein，HBP)又名天青杀素(AZU)、阳离子抗菌蛋白(CAP37)，是一种具有杀菌作用和趋化特性的多功能单链糖蛋白，由活化的中性粒细胞(PMN)释放，主要存在于中性粒细胞的分泌颗粒和嗜天青颗粒中，是唯一存在于中性粒细胞中的可分泌蛋白质。研究表明HBP分子由222个氨基酸残基构成，相对分子质量为24000，其氨基酸序列与人类中性粒细胞弹性蛋白酶具有45％同源性，与蛋白水解酶3具有42％的同源性，与组织蛋白酶G具有32％的同源性，它们都是丝氨酸蛋白酶家族的成员。

当病原微生物侵入机体时，中性粒细胞活化聚集到感染部位，释放HBP，血浆和尿液中HBP含量升高。HBP含量随病情严重程度逐渐升高，在严重脓毒症及脓毒症休克患者的血浆HBP水平会明显的升高，因此，监测重症患者的HBP水平可以辅助判断病情的严重程度。有研究发现血浆HBP浓度≥20ng/ml可作为严重脓毒症的诊断指标，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.1％、95.1％、88.4％和94.5％。有学者进行了尿HBP、IL-6、白细胞、亚硝酸盐比较的试验，结果表明尿HBP作为诊断尿路感染的敏感度和特异度分别为89.2％和89.8％，阳性预测值和阴性预测值分别为90.2％和88.8％，与其他标志物相比是诊断尿路感染最好的标志物。可见分别检测人体血浆和尿液中肝素结合蛋白的含量有着其各自的重要临床意义。

目前临床上广泛使用的肝素结合蛋白的检测试剂盒为荧光免疫干式法和免疫比浊法。荧光免疫干式法检测操作繁琐且检测效率较低；免疫比浊法适用于全自动生化分析仪，操作方便，检测快速，但是却没有检测尿液的指标说明。

申请号为CN202110206856.4的中国专利公开了一种“肝素结合蛋白测定试剂盒”，该发明是一种免疫荧光层析法，检测操作繁琐且检测效率较低。同时，申请号为202010795512.7的中国专利公开了“一种HBP的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法”，该发明中是检测血液样本中的肝素结合蛋白(HBP)浓度的化学发光免疫分析检测试剂盒，没有凸显出肝素结合蛋白的浓度变化在尿路感染上的临床意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒。

本发明提供的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1为抗人体血浆和尿液中同源蛋白干扰的阻断剂、盐类和防腐剂组成的工作液；所述试剂R2为两种大粒径聚苯乙烯胶乳微球、保护剂和防腐剂组成的工作液；所述两种大粒径聚苯乙烯胶乳微球分别包被有高特异性抗人肝素结合蛋白单克隆抗体、酶切抗人肝素结合蛋白抗体；所述酶切为用胃蛋白酶对抗体进行处理，去掉F(c)片段，留下F(ab)₂片段。

进一步地，所述试剂R1中的阻断剂为抗人IgM和IgG的酶切抗体的混合物。

进一步地，所述抗人IgM和IgG的酶切抗体的混合物，是含有功能部位的F(ab)₂抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、单克隆抗体。

胃蛋白酶水解抗体的部位在铰链区二硫键连接的重链近C端，可将抗体裂解为F(ab)₂和一个些小片段F(c)，F(ab)₂由两个Fab及铰链区组成，为双价，可同时结合两个抗原表位，因而形成凝集反应或沉淀反应，F(c)片段不能发挥生物学效应，故在本发明中被除去，这在一定程度上改善了多克隆抗体特异性较差的问题。单克隆抗体主要用于提高试剂的线性检测范围，而酶切抗人多克隆抗体主要用于提高试剂的灵敏度，使试剂能兼顾灵敏度和线性的要求。

进一步地，所述功能部位，是能特异性结合与肝素结合蛋白同源性较高的蛋白物质而不与肝素结合蛋白反应的重组氨基酸序列。

通过阻断剂和上述重组氨基酸序列的作用，可以达到检测血浆和尿液中肝素结合蛋白的目的。

进一步地，所述包被有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球的粒径为250-400nm，所述高特异性抗人肝素结合蛋白单克隆抗体是含有能与人肝素结合蛋白的特异性结合的Fab功能部位的单克隆完整抗体，其包被方法为聚苯乙烯胶乳微球表面的羧基通过EDAC活化然后与抗人肝素结合蛋白单克隆抗体结合，使聚苯乙烯胶乳微球表面覆盖上抗人肝素结合蛋白单克隆抗体。

进一步地，所述包被有酶切抗人肝素结合蛋白抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球的粒径为250-400nm，所述酶切抗人肝素结合蛋白抗体为含有能与人肝素结合蛋白特异性结合的Fab功能部位的抗人抗体，其包被方法为聚苯乙烯胶乳微球表面的羧基通过EDAC活化然后与酶切抗人肝素结合蛋白抗体结合，使聚苯乙烯胶乳微球表面覆盖上酶切抗人肝素结合蛋白抗体。

粒径在250-400nm之间的聚苯乙烯乳胶微球中乳胶羧基含量高，结合抗体的效率高，同时，上述偶联方法可以使抗体更牢固的结合到胶乳上，从而增加试剂的长期稳定性和开瓶稳定性。

进一步地，所述校准品包括浓度范围在0-600ng/mL的5-6个不同浓度水平的重组人肝素结合蛋白溶液。

优选地，所述工作液的缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液和2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液的其中任一种。

优选地，所述保护剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油、牛血清白蛋白、甘氨酸中的一种或多种。

保护剂一般为糖、多羟基化合物和氨基酸、蛋白质、聚合物等物质，可以有效增加溶液的稳定性。

优选地，所述防腐剂为Proclin-300或叠氮钠。

本发明原理为：

先将含有抗人体血浆和尿液中同源蛋白干扰的阻断剂的试剂R1与样本混合，使样本中的同源蛋白与R1中阻断剂的功能部位结合，将同源干扰清除。再将含有包被有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球和包被有酶切抗人肝素结合蛋白的兔多克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球的试剂R2与试剂R1和样本的混合液混合，使肝素结合蛋白与抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体和酶切多克隆抗体特异性结合，形成不溶性的聚苯乙烯胶乳微球-抗原-聚苯乙烯胶乳微球复合物乳浊液，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的肝素结合蛋白浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测肝素结合蛋白的含量。

本发明具备的有益效果：

本发明公开的一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，首先，试剂R2是含有包被有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球和包被有酶切抗人肝素结合蛋白的兔多克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球，使试剂具有高特异性的情况下同时具备较高的线性范围和高灵敏度；其次，试剂R1为含有抗人体血浆和尿液中同源蛋白干扰的阻断剂，可消除同源样本的抗扰，使其能同时检测血浆和尿液样本。本试剂为胶乳增强免疫比浊法，可在全自动生化分析仪上进行测试，分析速度更快。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中实施例3的校准曲线；

图2为本发明具体实施方式中实施例5的线性范围曲线；

图3为本发明具体实施方式中实施例7的相关性分析结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。需要说明的是，以下各实施例仅用于说明本发明的实施方法和典型参数，而不用于限定本发明所述的参数范围，由此引申出的合理变化，仍处于本发明权利要求的保护范围内。

需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

为解决背景技术中的现有技术存在的问题，本发明具体实施方式提供一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，该试剂盒由试剂R1、试剂R2和校准品组成，试剂R1为含有抗人体血浆和尿液中同源蛋白干扰的阻断剂，盐类和防腐剂的工作液；试剂R2为含有包被有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球和包被有酶切抗人肝素结合蛋白的兔多克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球、保护剂和防腐剂的的工作液；校准品包括浓度范围在0-600ng/mL的5-6个不同浓度水平的重组人肝素结合蛋白溶液。

实施例1

一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒的校准物质，原料组分及用量如下：

校准物质1：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠；

校准物质2：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠，10ng/ml重组肝素结合蛋白；

校准物质3：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠，30ng/ml重组肝素结合蛋白；

校准物质4：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠，100ng/ml重组肝素结合蛋白；

校准物质5：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠，300ng/ml重组肝素结合蛋白；

校准物质6：15mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)、9g/L氯化钠、20g/L BSA、1g/L叠氮化钠，600ng/ml重组肝素结合蛋白；

实施例2

一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其各试剂原料组分及配置工艺如下：

试剂R1：含100mM HEPES缓冲液，3％氯化钠，0.1％Proclin 300，5％的阻断剂和0.2％的乙二胺四乙酸二钠。

试剂2：

标记有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球的制备：将粒径为300nm的胶乳颗粒，用15mM MES(pH＝6.0)缓冲液稀释胶乳到0.15％，加入EDAC 0.1mg/ml和NHS 0.06mg/ml，室温反应0.5小时，制备成胶乳活化液。然后在胶乳活化液和加入0.3mg/ml的抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体，室温反应3小时，然后，12000rpm转速离心30min，去上清，沉淀悬浮于50mM HEPES(Ph＝7.6)中，超声分散，加入2％BSA，室温封闭1小时。离心去上清，用50mM HEPES Ph7.6+0.2％BSA+0.2％吐温20+20％甘油+2％蔗糖+0.2％甘氨酸+0.1％Proclin 300的保存液溶解胶乳，超声分散,制备成试剂R2-1。

标记酶切抗人肝素结合蛋白的兔多克隆抗体的大粒径聚苯乙烯胶乳微球的制备：将粒径为300nm的胶乳颗粒，用15mM MES(pH＝6.0)缓冲液稀释胶乳到0.15％，加入EDAC0.1mg/ml和NHS 0.06mg/ml，室温反应0.5小时，制备成胶乳活化液。然后在胶乳活化液和加入0.1mg/ml的酶切抗人肝素结合蛋白的兔多克隆抗体，室温反应3小时。然后，12000rpm转速离心30min，去上清，沉淀悬浮于50mM HEPES(Ph＝7.6)中，超声分散，加入2％BSA，室温封闭1小时。离心去上清，用50mM HEPES Ph7.6+0.2％BSA+0.2％吐温20+20％甘油+2％蔗糖+0.2％甘氨酸+0.1％Proclin 300的保存液溶解胶乳，超声分散,制备成试剂R2-2。

然后将试剂R2-1和试剂R2-2按照2:1比例混合，制备成试剂R2。

实施例3

一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其测定方式如下：

采用本发明所述的试剂盒测定血浆和尿液中肝素结合蛋白含量时，先将样本与试剂R1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂R2，立即读取第一点吸光度值(A1)，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值(A2)，计算两点吸光度差值，根据校准曲线得到样本中肝素结合蛋白的含量。

本实施例采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线，如图1。

本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线，如图1。

实施例4灵敏度试验

一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其检测样本性能试验如下：

以水为空白样本，选取一份低值样本进行倍比稀释，配制出不同浓度的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果如表1所示，灵敏度为5mg/L。

表1灵敏度试验结果

HBP(ng/mL)	0.00	2.5	5	10	20
						平均值	0.00	2.480	5.040	10.700	20.140
SD	0.00％	0.386	0.325	0.318	0.287
						CV	0.00％	15.56％	6.45％	2.97％	1.43％

实施例5线性范围试验

用HBP纯品配制成浓度为600ng/mL的高值样本用纯水按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的稀释比例进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图2。

根据理论值与检测均值求出该浓度的线性偏差，结果表明本发明试剂盒对样本HBP的检测上限可达到600ng/mL。

实施例6稳定性试验

在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月、12月和14月对同一样本进行测定，每个样本测10次，结果见表2。4月，8月，12月，14月与0月相比，测得值差异小，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。

试剂开封后放在全自动生化仪上，分别在0天、3天、7天、14天、21天和30天对同一样本进行测定，每个样本测10次，结果见表3。样本分装后，储存于-20℃。3天、7天、14天、21天、30天与0天相比，测得值差异小，说明本发明的检测试剂盒在开瓶后2-8℃条件下可稳定一个月。

表2稳定性试验结果(1)

HBP	0月	4月	8月	12月	14月
						试剂空白吸光度A<sub>0</sub>	0.8427	0.8463	0.8592	0.8542	0.8774
样本测得值	12.82	11.85	13.17	12.65	13.37
						与0月偏差(％)		-7.57％	2.73％	-1.33％	4.29％

表3稳定性试验结果(3)

HBP	0月	3天	7天	14天	21天	30天
							试剂空白吸光度A<sub>0</sub>	0.8418	0.8321	0.8345	0.8380	0.8581	0.8652
样本测得值	12.10	12.30	12.10	11.30	12.40	12.40
							与0月偏差(％)		1.65％	-1.63％	-6.61％	2.48％	2.48％

实施例7相关性分析

采用实施例1配制的试剂盒检测同源的血浆样本和尿液样本，对测定的同源样本的值进行相关分析，结果如表4所示。由图3可知，本发明试剂测定同源的血浆和尿液的相关系数为R²＝0.9988，回归方程为y＝1.0189x-0.1215)。该结果表明本发明试剂可兼测血浆和血清样本。

表4相关性分析结果

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1包括抗人体血浆和尿液中同源蛋白干扰的阻断剂、盐类和防腐剂；所述试剂R2包括第一聚苯乙烯胶乳微球、第二聚苯乙烯胶乳微球、保护剂和防腐剂；所述第一聚苯乙烯胶乳微球包被有高特异性抗人肝素结合蛋白完整单克隆抗体，所述第二聚苯乙烯胶乳微球包被经酶切处理的抗人肝素结合蛋白抗体，酶切处理为用胃蛋白酶对抗体进行处理，去掉F(c)片段，留下F(ab)₂片段。

2.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的阻断剂为经酶切处理的抗人IgM和经酶切处理的抗人IgG的混合物。

3.如权利要求2所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的阻断剂是含有功能部位的F(ab)₂抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体和单克隆抗体。

4.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述第一聚苯乙烯胶乳微球的粒径为250-400nm，所述第一聚苯乙烯胶乳微球包被有高特异性抗人肝素结合蛋白的单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述第二聚苯乙烯胶乳微球的粒径为250-400nm，所述第二聚苯乙烯胶乳微球包被有酶切抗人肝素结合蛋白抗体。

6.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包括5-6个不同浓度水平的重组人肝素结合蛋白溶液，所述重组人肝素结合蛋白溶液的浓度为0-600ng/mL。

7.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸缓冲液和2-吗啉乙磺酸缓冲液中的任一种。

8.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油、牛血清白蛋白、甘氨酸中的一种或多种。

9.如权利要求1所述的测定人血浆和尿液中肝素结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为Proclin-300或叠氮钠。