CN111235139B

CN111235139B - 木糖异构酶及其编码基因和制备方法、载体和宿主细胞以及他们的应用

Info

Publication number: CN111235139B
Application number: CN201811443186.2A
Authority: CN
Inventors: 熊强; 王梦; 刘劲松; 林海龙
Original assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd
Current assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: CN111235139A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体的，涉及木糖异构酶及其编码基因和制备方法、载体和宿主细胞以及他们的应用。该木糖异构酶的氨基酸序列相比于SEQ ID：NO.7所示的木糖异构酶的氨基酸序列，145位置的Asn被带负电的极性氨基酸取代和/或415位置的Lys被非极性氨基酸取代。本发明通过对野生型木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的突变的木糖异构酶。

Description

木糖异构酶及其编码基因和制备方法、载体和宿主细胞以及他们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的，涉及一种木糖异构酶及其编码基因和制备方法，以及含有该基因的重组载体和重组宿主细胞，以及他们在制备含有木糖异构酶的产品中的应用。

背景技术

木糖异构酶(Xylose isomerase，XI；EC 5.3.1.5)能够催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要作用，也具有极其广阔的工业应用价值。特别地，在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径(参见图1)。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa))等中，通过木糖异构酶的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。

其中，利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖来生产乙醇的重组菌株成为研究热点。源于真菌及嗜热细菌的木糖异构酶能够在微生物细胞中表达并显示出活性，并参与微生物细胞木糖代谢途径的构建。基于木糖异构酶特定的催化机理进行理性设计并提高其催化效率，对构建新型高效利用木糖的重组微生物细胞而言具有重要的应用意义和价值。

然而，如何有效地得到具有提高的催化活性的木糖异构酶，并将其在工业生产中加以应用，在本领域中仍罕有报道，不能满足实际需求。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有木糖异构酶催化活性较低的缺点，提供一种催化活性高的木糖异构酶。

本发明的第二个目的是提供编码该木糖异构酶的基因。

本发明的第三个目的是提供含有该基因的重组载体。

本发明的第四个目的是提供含有该重组载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供如上所述的木糖异构酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组宿主细胞在制备含有木糖异构酶的产品中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述木糖异构酶的制备方法。

本发明提供了一种木糖异构酶，该木糖异构酶的氨基酸序列相比于SEQ ID：NO.7所示的木糖异构酶的氨基酸序列，145位置的Asn被带负电的极性氨基酸取代和/或415位置的Lys被非极性氨基酸取代。

本发明提供了编码如上所述的木糖异构酶的基因。

本发明提供了一种重组载体，该重组载体含有如上所述的基因。

本发明提供了一种重组宿主细胞，该宿主细胞含有如上所述的重组载体。

本发明提供了如上所述的木糖异构酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组宿主细胞在制备含有木糖异构酶的产品中的应用。

本发明提供了一种木糖异构酶的制备方法，该方法包括培养如上所述的宿主细胞。

本发明通过对野生型木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的突变的木糖异构酶。

附图说明

图1示出了天然微生物中两种不同的木糖代谢途径。

图2示出了I类木糖异构酶与II类木糖异构酶晶体结构对比图。

具体实施方式

木糖异构酶基因所编码的氨基酸序列全长共包含439个氨基酸。根据文献中对XI序列的同源性分析的报道，木糖异构酶可分为两大类(如图2所示)：I类木糖异构酶通常含有约390个残基，序列同源性超过50％；II类木糖异构酶则含有约440个残基。与I类木糖异构酶相比，II类木糖异构酶在N-末端明显延长了约50个氨基酸残基；同时，二者的C-末端结构也有较大差异。本发明的发明人通过研究发现，通过对II类木糖异构酶中特定位点144和/或309的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的突变的木糖异构酶。

基于如上的发现，第一方面本发明提供了一种木糖异构酶，该木糖异构酶的氨基酸序列相比于SEQ ID：NO.7所示的木糖异构酶的氨基酸序列，145位置的Asn被带负电的极性氨基酸取代和/或415位置的Lys被非极性氨基酸取代。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。因此，SEQ ID：NO.7所示的木糖异构酶的氨基酸序列145位置的Asn可以被如上的任意一种带负电的极性氨基酸所取代，415位置的Lys可以被如上任意一种非极性氨基酸取代，并且可以预期取代后所获得的木糖异构酶均具有木糖异构酶活性。

优选的，所述带负电的氨基酸为Asp。

优选的，所述非极性氨基酸为Ala。

本发明提供的木糖异构酶还可以进行修饰，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指不影响本发明提供的木糖异构酶序列(通常不改变一级结构)的修饰形式。其中，术语“修饰形式”包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

所述木糖异构酶的氨基酸序列优选如SEQ ID：NO.1(Asn145Asp)、SEQ ID：NO.2(Lys415Ala)或SEQ ID：NO.3(Asn145Asp+Lys415Ala)所示。

本发明第二方面，提供了一种编码如上所述的木糖异构酶的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，也可以利用本文公开的DNA序列，通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述木糖异构酶活性一致的氨基酸序列。

优选情况下，编码本发明提供的木糖异构酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.5或SEQ ID：NO.6所示。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供了含有如上所述的基因的重组载体。

在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，优选地，所述载体选自pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K；进一步优选地，所述表达载体为pPIC9K。重组载体构建可采用载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。

本发明第四方面，提供了含有如上所述的重组载体的重组宿主细胞。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、感染或转染到宿主细胞中，其中，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中，常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法；感染是指用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，将该载体与目的DNA序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，从而以感染的方式使重组DNA进入宿主细胞中；转染是指通过CaCl₂、电穿孔等方法将细胞处理成感受态细胞，然后使该感受态细胞接受重组的噬菌体DNA。本发明优选选用转化的方法；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为真核细胞，更优选为酵母细胞，进一步优选毕赤酵母(Pichia)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、球拟酵母(Torulopsis)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和克鲁维酵母(Kluyveromyces)细胞中的至少一种，进一步优选地，所述重组细胞为毕赤酵母细胞，更优选为毕赤酵母GS115细胞。

本发明第五方面，提供了如上所述的木糖异构酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组宿主细胞在制备含有木糖异构酶的产品中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种制备木糖异构酶的方法，包括培养本发明提供的重组宿主细胞。

其中，所述培养条件可以为常规的培养条件，如BMGY培养基、25-40℃。由于本发明提供的重组宿主细胞中含有编码木糖异构酶的基因，可以高效地表达木糖异构酶。培养完之后，通过对培养物离心收集菌液，并通过盐析法、等电点沉淀、亲和层析、超滤等方式纯化蛋白，从而得到突变的木糖异构酶。

下面的实施例将对本发明作进一步的描述。

实施例

1.编码木糖异构酶基因片段的获得

首先，委托英潍捷基Invitrogen公司以NCBI数据库中野生型Prevotellaruminicola菌株木糖异构酶基因序列(JF496707)为参照，合成天然木糖异构酶基因片段，在其两端引入EcoRI酶和NotI酶切位点。利用EcoRI酶和NotI酶进行双酶切后，将其克隆到同样进行双酶切的PUC19载体的多克隆位点中。经转化、筛选、测序后，确认成功克隆了编码天然木糖异构酶的基因片段。

随后，委托英潍捷基Invitrogen公司分别合成编码木糖异构酶突变体Asn145Asp的DNA序列(SEQ ID No.7)、Lys415Ala的DNA序列(SEQ ID No.8)、Asn145Asp+Lys415Ala的DNA序列(SEQ ID No.9)，为克隆目的，在这3条DNA序列两端均引入EcoRI酶和NotI酶切位点。利用EcoRI酶和NotI酶进行双酶切后，将他们分别克隆到同样进行双酶切的PUC19载体的多克隆位点中。经转化、筛选、测序后，确认分别成功克隆了编码木糖异构酶突变体Asn145Asp、Lys415Ala和Asn145Asp+Lys415Ala的基因片段。

2.表达菌株构建和筛选

2.1载体构建

选取毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K进行构建和表达，对序列的酶切位点进行分析，选取EcoRI/NotI位点进行双酶切构建，选用毕赤酵母GS115菌株(买自北京华越洋生物有限公司)作为表达菌株。

2.1.1基因片段的PCR扩增

使用KOD Plus酶进行PCR扩增，基因片段的PCR体系和程序如下所示，PCR结束后通过DNA回收试剂盒(天根)对PCR产物进行回收。

2.1.2基因片段和载体的双酶切

使用NEB公司的EcoRI和NotI酶分别对回收后的PCR产物和载体进行双酶切，酶切反应体系如下所示：

37℃过夜酶切。

2.1.3基因片段和载体的连接

将酶切后的基因片段和pPIC9K载体胶回收后，按照片段:载体＝1:6的配比，使用NEB的T4DNA Ligase进行连接反应，反应体系和条件如下所示：

16℃连接2h。

2.1.4连接产物的转化及阳性克隆筛选

将连接产物转化至DH5α感受态细胞，转化步骤如下：

①从-80℃冰箱中取感受态细胞至于冰浴中，待其完全融化；

②往100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，轻轻混匀，在冰浴中静置30min；

③将冰浴后的感受态细胞置于42℃水浴中热激60s，然后快速转移到冰浴中，静置5min；

④加入800μl的无抗LB培养基，置于37℃摇床150rpm振荡培养45min；

⑤将离心管3000rpm离心3min，轻轻吸去多余的上清，留下约100μl培养基，轻轻的悬浮细胞，将100μl细胞全部均匀涂布至含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。

将平板上长出的克隆使用通用引物α-Factor和3’-AOX1进行菌落PCR验证，PCR鉴定体系及程序如下所示：

2.2重组菌株构建及筛选

2.2.1载体的线性化

使用Sal I对重组质粒进行线性化，用于下一步的电转化，线性化体系及条件如下所示：

37℃过夜酶切。

2.2.2线性化产物的乙醇沉淀

为了使得最后回收得到的线性化产物浓度尽可能的高，将线性化后的产物进行乙醇沉淀，具体步骤如下。

①加入1/10体积的3M乙酸钠(PH＝5.2)于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3M；

②加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀，置于-20℃中过夜；

③12,000g离心10min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

④加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2min，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

⑤室温下将开盖的EP管的置于实验桌上使残留的液体挥发干净；

⑥加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

2.2.3毕赤酵母的电转化

毕赤酵母的电转化步骤具体如下：

①接种GS115单菌落到含有5mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃过夜培养；

②转接至含有100mL YPD液体培养基的500ml三角瓶，接种量1％，30℃培养过夜，直到OD600＝1.3～1.5；

③1500g，4℃条件下离心20ml培养液5min，弃上清液，再用20mL冰浴的双蒸水重悬细胞；加入8ml的预处理液，室温放置30min；

④1500g，4℃条件下离心5min，弃上清液，然后用1.5mL冰浴的1M sorbitol重悬细胞，转移到1.5ml的EP管中；

⑤1500g，4℃条件下离心5min，弃上清液，然后重复两次操作5，共用1.5mL冰浴的1M sorbitol洗涤三次；

⑥1500g，4℃条件下离心5min，弃上清液，然后用80μL冰浴的1M sorbitol重悬细胞，使菌悬液终浓度达到1010cells/ml；

⑦将80μL处理好的感受态细胞和5-20μg经过线性化了的DNA(溶解在双蒸水中，体积为5～10μL)加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀。然后把混合液转移入预先冰浴的转化杯中(0.2cm型)；冰浴装有转化混合液的转化杯5min；

⑧按照如下参数设置电转化仪，并启动电脉冲：

Cuvette Gap 0.2cm

Voltage 1.5kV

Field Strength 7.5kV/cm

Capacitor 25μF

Resistor(Pμlse Controller)400

Time Constant approximately 6.0msec

⑨脉冲后立即往转化杯中加入1mL冰浴的1M的山梨醇溶液，然后把转化液转入一个新的1.5mL离心管中；30℃静置培养1～2h；

⑩吸取GS115的转化液50～200μL涂布MD平板；30℃培养，直到转化子出现。

2.2.4重组酵母的鉴定

使用5’AOX1引物和3’AOX1引物进行PCR鉴定，如果是Mut+表型，可以得到两条带：①约2.2kb的AOX1基因；②比目的基因略大的条带。

3.重组酵母的诱导表达

①挑选单菌落，置于装有60ml BMGY培养基的500ml摇瓶中，于30℃、250rpm培养至OD600＝2-6(16-18h)；

②室温下1500g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600＝1.0左右；

③将步骤2所得的菌液置于2L的摇瓶中，用八层纱布封口，放置于28℃、250rpm的摇床上继续生长；

④每24h向培养基中添加100％的甲醇至终浓度为1.0％；

⑤培养96小时后，取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心3min，收集上清，用于分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

测试例1

1.目的蛋白的表达量

将所取样品进行SDS-PAGE电泳分析，上样量10μl，分析目的蛋白的表达量，结果见表1。

2.酶活测定

采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法(Kuyper M et al.2003)：100mM，pH7.5Tris-HCl，500mM xylose，10mM MgCl2，粗酶液10μl，1U SDH，0.15mM NADH，上下颠倒试管充分混匀，30℃下测定A340，并计算酶活，酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADH的μmol L^-1数，即U mg^-1蛋白，结果见表1。

表1

	酶活(U/mg)	表达量(mg/L)
			野生型	1.32	290
Asn145Asp	1.40	306
			Lys415Ala	1.43	313
Asn145Asp+Lys415Ala	1.37	324

由表1可以看出，本发明提供的木聚糖酶突变体的催化活性能够得到显著提高，并且具有较高的表达量。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 国投生物科技投资有限公司

<120> 木糖异构酶及其编码基因和制备方法、载体和宿主细胞以及他们的应用

<130> I53549GTS

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 439

<212> PRT

<213> 木糖异构酶Asn145Asp

<400> 1

Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys

20 25 30

Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala

35 40 45

Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln

50 55 60

Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala

65 70 75 80

Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr

100 105 110

Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln

115 120 125

Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala

130 135 140

Asp Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro

145 150 155 160

Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile

165 170 175

Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly

180 185 190

Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys

195 200 205

Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro

225 230 235 240

Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu

245 250 255

Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn

260 265 270

His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala

275 280 285

Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala

290 295 300

Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu

305 310 315 320

Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly

325 330 335

Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu

340 345 350

Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala

355 360 365

Leu Met Asn Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Pro Ala Met

370 375 380

Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe

385 390 395 400

Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys

405 410 415

Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr

420 425 430

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435

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> 木糖异构酶Lys415Ala

<400> 2

Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys

20 25 30

Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala

35 40 45

Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln

50 55 60

Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala

65 70 75 80

Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr

100 105 110

Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln

115 120 125

Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala

130 135 140

Asn Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro

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Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile

165 170 175

Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly

180 185 190

Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys

195 200 205

Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro

225 230 235 240

Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu

245 250 255

Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn

260 265 270

His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala

275 280 285

Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala

290 295 300

Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu

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325 330 335

Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu

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Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala

355 360 365

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Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe

385 390 395 400

Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Ala Lys

405 410 415

Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr

420 425 430

Ile Val Ala Leu His Cys Lys

435

<210> 3

<211> 439

<212> PRT

<213> 木糖异构酶Asn145Asp+Lys415Ala

<400> 3

Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys

20 25 30

Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala

35 40 45

Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln

50 55 60

Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala

65 70 75 80

Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr

100 105 110

Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln

115 120 125

Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala

130 135 140

Asp Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro

145 150 155 160

Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile

165 170 175

Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly

180 185 190

Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys

195 200 205

Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro

225 230 235 240

Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu

245 250 255

Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn

260 265 270

His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala

275 280 285

Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala

290 295 300

Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu

305 310 315 320

Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly

325 330 335

Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu

340 345 350

Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala

355 360 365

Leu Met Asn Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Pro Ala Met

370 375 380

Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe

385 390 395 400

Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Ala Lys

405 410 415

Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr

420 425 430

Ile Val Ala Leu His Cys Lys

435

<210> 4

<211> 439

<212> PRT

<213> 木糖异构酶野生型

<400> 4

Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys

20 25 30

Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala

35 40 45

Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln

50 55 60

Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala

65 70 75 80

Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr

100 105 110

Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln

115 120 125

Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala

130 135 140

Asn Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro

145 150 155 160

Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile

165 170 175

Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly

180 185 190

Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys

195 200 205

Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro

225 230 235 240

Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu

245 250 255

Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn

260 265 270

His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala

275 280 285

Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala

290 295 300

Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu

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Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly

325 330 335

Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu

340 345 350

Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala

355 360 365

Leu Met Asn Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Pro Ala Met

370 375 380

Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe

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405 410 415

Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr

420 425 430

Ile Val Ala Leu His Cys Lys

435

<210> 5

<211> 1320

<212> DNA

<213> 木糖异构酶Asn145Asp编码基因

<400> 5

atggcaaaag aatattttcc gtttactggt aaaattcctt tcgagggaaa ggatagtaaa 60

aatgtaatgg ctttccatta ttacgagccc gagaaagtcg tgatgggaaa gaagatgaag 120

gactggctga agttcgcaat ggcctggtgg cacacactgg gaggcgcttc tgcagaccag 180

ttcggtggtc aaactcgcag ctatgagtgg gacaaggctg aatgccccgt acagcgtgca 240

aaggataaga tggacgctgg tttcgagatc atggataagc tgggtatcga gtacttctgc 300

ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360

aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420

tggggtaccg cagatgtatt cggcaacaag cgttatgcca atggcgcttc taccaacccc 480

gatttcgatg tggttgctcg tgcgattgtt cagatcaaga actctatcga cgctaccatc 540

aagcttggtg gtaccaacta tgtgttctgg ggtggtcgtg agggctacat gagcctgttg 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggctacga tgctgggtat ggctcgtgac 660

tatgctcgcg ctaagggatt caagggtacg ttcctgattg agccgaagcc gatggagcct 720

tcaaagcacc agtatgatgt ggacacagag accgtgattg gcttcctgaa ggcacatggt 780

ctggataagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ctacattggc tggtcacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg tgctgttgac gctggtatgc tgggttctat cgacgctaac 900

cgcggtgatg cccagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa ctttgagctg 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaac ggtggtctgg gcaatggcgg taccaatttc 1020

gacgccaaga tccgtcgtaa ttctaccgac ctcgaggatc tcttcatcgc tcatatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgccctgatg aatgcagccg atattcttga gaactctgaa 1140

ctgcccgcaa tgaagaaggc tcgctacgca agcttcgaca gcggtatcgg taaggacttc 1200

gaggatggca agctgacctt cgagcaggtt tacgagtatg gtaagaaggt tgaagagccg 1260

aagcagacct ctggcaagca ggagaagtac gagacaatcg tcgccctcca ctgcaaataa 1320

<210> 6

<211> 1320

<212> DNA

<213> 木糖异构酶Lys415Ala编码基因

<400> 6

atggcaaaag aatattttcc gtttactggt aaaattcctt tcgagggaaa ggatagtaaa 60

aatgtaatgg ctttccatta ttacgagccc gagaaagtcg tgatgggaaa gaagatgaag 120

gactggctga agttcgcaat ggcctggtgg cacacactgg gaggcgcttc tgcagaccag 180

ttcggtggtc aaactcgcag ctatgagtgg gacaaggctg aatgccccgt acagcgtgca 240

aaggataaga tggacgctgg tttcgagatc atggataagc tgggtatcga gtacttctgc 300

ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360

aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420

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<400> 7

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ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360

aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420

tggggtaccg cagatgtatt cggcaacaag cgttatgcca atggcgcttc taccaacccc 480

gatttcgatg tggttgctcg tgcgattgtt cagatcaaga actctatcga cgctaccatc 540

aagcttggtg gtaccaacta tgtgttctgg ggtggtcgtg agggctacat gagcctgttg 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggctacga tgctgggtat ggctcgtgac 660

tatgctcgcg ctaagggatt caagggtacg ttcctgattg agccgaagcc gatggagcct 720

tcaaagcacc agtatgatgt ggacacagag accgtgattg gcttcctgaa ggcacatggt 780

ctggataagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ctacattggc tggtcacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg tgctgttgac gctggtatgc tgggttctat cgacgctaac 900

cgcggtgatg cccagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa ctttgagctg 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaac ggtggtctgg gcaatggcgg taccaatttc 1020

gacgccaaga tccgtcgtaa ttctaccgac ctcgaggatc tcttcatcgc tcatatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgccctgatg aatgcagccg atattcttga gaactctgaa 1140

ctgcccgcaa tgaagaaggc tcgctacgca agcttcgaca gcggtatcgg taaggacttc 1200

gaggatggca agctgacctt cgagcaggtt tacgagtatg gtgcaaaggt tgaagagccg 1260

aagcagacct ctggcaagca ggagaagtac gagacaatcg tcgccctcca ctgcaaataa 1320

Claims

1.一种木糖异构酶，该木糖异构酶的氨基酸序列相比于SEQ ID：NO. 4所示的木糖异构酶的氨基酸序列，145位置的Asn被Asp取代和/或415位置的Lys被Ala取代。

2.编码权利要求1所述的木糖异构酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ ID：NO. 5、SEQ ID：NO. 6或SEQ ID：NO. 7所示。

4.一种重组载体，该重组载体含有权利要求2或3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述载体为pPICZ、pGAPZ、或pPIC9K。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述载体为pPICZα或pGAPZα。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其中，所述载体为pGAPZαA。

8.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞含有权利要求4-7中任意一项所述的重组载体；

其中，所述重组细胞为毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、多型汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、裂殖酵母细胞和克鲁维酵母细胞中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞为毕赤酵母细胞。

10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其中，所述重组细胞为毕赤酵母GS115细胞。

11.权利要求1所述的木糖异构酶、权利要求2或3所述的基因、权利要求4-7中任意一项所述的重组载体、权利要求8-10中任意一项所述的重组宿主细胞在制备含有木糖异构酶的产品中的应用。

12.一种木糖异构酶的制备方法，该方法包括培养权利要求8-10中任意一项所述的重组宿主细胞。