CN102732490A

CN102732490A - 一种温度适性广的中性脂肪酶lipg及其基因和应用

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Publication number: CN102732490A
Application number: CN2011100818280A
Authority: CN
Inventors: 詹志春; 张菁
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种温度适性广的中性脂肪酶LIPG及其基因和应用。本发明提供了一种温度适应性广的中性脂肪酶LIPG，及其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得中性脂肪酶，其在pH6.5～8.5的范围内均具有高的酶活性，其在25℃～80℃的范围内均具有高的酶活性，最适温度为65℃，并且在30℃时仍然具有约60％的脂肪酶活性；同时该脂肪酶还具有极好的热稳定性，90℃处理半小时仍然具有90％的酶活性剩余，因此其可以有效地抵御饲料制粒的高温。这些性质使其适用于淡水鱼类饲料中。

Description

一种温度适性广的中性脂肪酶LIPG及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种温度适性广的中性脂肪酶LIPG及其基因和应用。

背景技术

脂肪在畜禽体内的作用主要是氧化供能，它含有的能量是碳水化合物的2.25倍，可满足动物体对较高能量浓度的要求。脂肪是脂溶性维生素和某些激素的溶剂，促进对这些物质的吸收和利用，同时为畜禽提供必需的不饱和脂肪酸，保证畜禽的健康生长；添加脂肪还可减少饲料加工过程中的粉尘，改善饲料外观，在高温条件下，还有利于提高能量摄入量，降低畜禽的体热增耗，减缓热应激；此外，添加脂肪可有效地提高饲料的适口性。因此，在猪、鸡和奶牛饲料中添加脂肪是比较普遍的作法。

脂肪酶(lipase)，也称为三脂酰甘油水解酶(triacylglycerol hydrolase，EC 3.11.3)，能够分解生物产生的各种天然的油和脂肪，自然界中广泛存在。脂肪酶是脂肪代谢最基本的酶，若缺乏将会危及机体健康。单胃动物自身能够分泌内源性消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。但幼禽、幼畜消化机能尚未发育健全，内源性消化酶分泌量不足。在现代养猪生产中，早期断奶甚至超早期断奶在养猪生产中普遍实施，但早期断奶后，幼畜消化酶分泌产生不良影响，消化酶分泌急剧减少，断奶2周后才逐渐恢复并增加。断奶后2周内消化酶分泌不足是断奶仔猪生长阻滞的主要因素之一；雏鸡大多数消化酶在2周龄左右才发育到高峰，因此，消化酶分泌不足也是雏鸡对饲料利用的主要限制因素之一。在幼禽、幼畜日粮中添加外源性淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，能补充体内内源酶的不足，并能减轻断奶仔猪的断奶应激，提高动物的生产性能。有研究表明，外源性脂肪酶可提高饲料中的脂肪消化率，可提饲料的表观代谢能值和饲料转化率。

脂肪酶应用在不同领域中的选择性是基于它的底物特异性、位置特异性、定向性、温度和pH特性等。和大部分饲养酶制剂一样，应用在饲料行业的脂肪酶需要具备一些特殊的性质。真正适合在饲料中使用的脂肪酶，必须具有好的热稳定性而同时在常温下具有高活性；最适pH在酸性同时在整个酸性和中性的pH范围内又能维持较高的活性；对动物胃、胰蛋白酶和别的蛋白酶都具有较好的抗性等综合性质。对于淡水养殖的主要鱼类-鲤科鱼类来说，因为它们没有胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的肠道，因而与其他畜禽饲料添加的脂肪酶相比，在鱼类饲料中添加的脂肪酶必需使用在中性pH值条件下。另外由于水产养殖环境得水体温度一般在0-30℃之间，投放到养殖池塘的脂肪酶需要在低温具有较高的活性。而到目前为至，几乎没有在低温及中性的环境下具有高酶活性脂肪酶的报道。因此，开发温度适应性广的中性脂肪酶具有较好的科学理论价值，也具有较大的应用潜力和产业价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用于淡水鱼类的温度适性广的高温中性脂肪酶。

本发明的再一目的是提供编码上述温度适性广的中性脂肪酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述温度适性广的中性脂肪酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述温度适性广的高温中性脂肪酶的应用。

本发明提供了一种温度适性广的高温中性脂肪酶LIPG，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

MRRGIVSTIT IVSVLAGILW LGGFAMGIQD QFFSAAMPPA GTTKYTKEKK

ADNREIYIVA 60

LGDSLTRGTG DESGKGYIGY MVDSLRKKTT KPIRVTNLAI KGQRSDGLLK

QLGQAEIKRQ 120

LKMADIIVMT IGGNDLFQGG EALKLAPKQI EQAKNAYLHN LDRIFQTIRS

VNKDAVVFYI 180

GLYNPFSDLG DAKKTSAIVR QWNFASAETA ARYPNIIAVP IFDLFELHVN

DYLYSDHFHP 240

NKEGYKRIGE RVASLITWTE EDKQ 264

本发明提供了编码上述温度适性广的高温中性脂肪酶的基因LipG。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。

atgagacgcg gtattgtaag caccatcacg attgtatccg tgctggcggg aatattatgg 60

cttggcggtt ttgccatggg cattcaagat caattttttt ccgccgcgat gccgccagca 120

ggcacgacga aatatacaaa agagaaaaaa gcggacaacc gtgaaattta cattgtcgct 180

cttggcgact cgctgacaag gggaacggga gacgaaagcg gaaaagggta tattggctat 240

atggtcgatt ctctccgtaa aaaaacaacg aaaccgattc gtgtaacaaa cttggctatt 300

aaaggacagc gatctgacgg actccttaag caattaggac aagctgagat aaagaggcag 360

ctaaaaatgg ctgacatcat cgtgatgacg atcggcggga atgatttgtt tcaaggcgga 420

gaagcgctaa agcttgcgcc aaagcaaatc gagcaggcaa aaaacgcgta tttacacaac 480

ttagaccgta tttttcaaac gattcgcagc gtcaataaag atgcagttgt tttttacatc 540

gggctttaca atccgtttag cgacctcggt gacgcaaaga agacatccgc gatcgtaagg 600

cagtggaatt ttgcttcggc agaaacggca gctcgctatc caaatatcat tgctgtgccg 660

atattcgatt tgtttgagct tcatgtgaat gattatttgt acagcgacca tttccatccg 720

aataaggaag gctataaacg cattggcgaa cgtgtcgctt ctttaattac gtggacggag 780

gaggacaaac aatga 795

本发明还提供了包含上述温度适性广的高温中性脂肪酶的基因LipG的重组载体，优选为pET-28a-LipG。

本发明还提供了包含上述温度适性广的高温中性脂肪酶的基因LipG重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

本发明还提供了一种制备温度适性广的高温中性脂肪酶LIPG的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组脂肪酶表达；以及

3)纯化所表达的脂肪酶LIPG。

本发明还提供了上述脂肪酶LIPG的应用。

本发明获得一种温度适性广的高温中性脂肪酶，pH6.5～8.5的范围内均具有高的酶活性，其在25℃～80℃的范围内均具有高的酶活性，最适温度为70℃，并且在30℃时仍然具有约60％的脂肪酶活性；同时该脂肪酶还具有极好的热稳定性，90℃处理半小时仍然具有70％的酶活性剩余，因此其可以有效地抵御饲料制粒的高温。这些性质使其适用于淡水鱼类饲料中。同时该脂肪酶又具有非常宽广的温度适应性，在25℃～80℃的范围内均具有高的酶活性。尽管最适温度是65℃，但该脂肪酶在30℃时仍然具有约60％的脂肪酶活性。

附图说明

图1、重组脂肪酶的纯化。

图2、重组脂肪酶的最适pH。

图3、重组脂肪酶的pH稳定性。

图4、重组脂肪酶的最适温度。

图5、重组脂肪酶的热稳定性。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：Geobacillus sp.B2分离于浙江嘉兴人工鱼塘底泥样品。大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)(购自Novagen公司)。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自NEB公司。IPTG、对-棕榈酸硝基苯酯(pNPP)等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。

3.培养基：嗜热地芽孢杆菌及大肠杆菌培养基为LB (1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1、嗜热地芽孢杆菌脂肪酶编码基因LipG的克隆及表达

嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.B2)来源于浙江嘉兴人工鱼塘底泥样品。以Geobacillus sp.B2菌株基因组DNA为模板，利用设计的脂肪酶两端的引物，Lipase-f：ATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC；

Lipase-r：TCATTGTTTGTCCTCCTCCGTC，进行PCR扩增，经测序分析后，最终得到一个完整的脂肪酶基因，LipG。该脂肪酶基因以ATG为起始密码子，由795个碱基组成，编码264个氨基酸和一个终止密码子TGA。

根据基因的序列设计扩增植酸酶基因成熟蛋白序列的表达引物：LipG-mF和LipG-mR(5′-CGGAATTCATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC-3′，5′-ATTTGCGGCCGCTCATTGTTTGTCCTCCTCCGTC-3′)，并在引物LipG-mF的末端引入酶切位点EcoRI，在引物LipG-mR的末端引入NotI，以Geobacillus sp.B2菌株基因组DNA为模板，进行脂肪酶基因的PCR扩增。PCR反应循环条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。胶回收PCR产物并用EcoRI和NotI双酶切，然后与大肠杆菌表达载体pET28a(+)连接，构建表达载体pET28a-LipG，利用电转化方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株pET28a-LipG/DE3。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET-28a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃条件下快速振荡培养过夜；按照1/100体积接种过夜培养液于含有100μg/mL氨苄青霉素的20mL LB培养液中(100mL三角瓶)，快速振荡培养约2h(OD₆₀₀达到0.6)，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG，振荡培养8h，使其表达目的蛋白。取培养液，10,000rpm离心5min，收集菌体沉淀。采用超声波破碎菌体，对破碎的菌体进行脂肪酶活性的测定和SDS-PAGE电泳的方法验证脂肪酶基因LipG在大肠杆菌中的表达。

实施例2、脂肪酶的活性分析方法

测定原理：脂肪酶在一定温度和pH条件下，水解底物pNPP，生成黄颜色的pNP。在一定浓度范围内，生成pNP的量和反应液的410nm处吸光值呈线性关系。据此可以通过测定反应液的410nm吸光值计算脂肪酶活力。

测定步骤：底物溶液A：90mg对-棕榈酸硝基苯酯(pNPP)溶于30mL异丙醇；缓冲溶液B：50mmol/LTris-c1(pH8.0)。取2个试管，分别是对照管和样品管。将两试管中各加入溶液B 1.8mL及0.1ml底物溶液A，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.1mL，样品管中加入酶液0.1mL，立即混匀计时，在水浴中准确反应10min后加入0.5mL 10％三氯乙酸溶液终止反应，再加入0.5mL 10％Na₂CO₃溶液显色。410nm分光光度计下测定酶催化产生的对-硝基酚的吸收值。

脂肪酶1个酶活单位定义：在pH 7.5，37℃条件下，以每分钟释放1μmol对硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

实施例3重组植酸酶的纯化

获得的阳性克隆按常规的方法进行摇瓶培养，经IPTG诱导后，收集菌体细胞，并采用超声波破碎细胞。细胞破碎液上清，经离心处理后，用镍柱亲和层析的方法，对目标蛋白进行纯化。根据NEB的装柱说明书将1mL的NTA柱质加到空柱子中，并准备如下pH 7.6缓冲液：

1)NTA-0，20mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

2)NTA-20，20mmol/L Tris-HCl；20mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

3)NTA-40，20mmol/L Tris-HCl；40mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

4)NTA-60，20mmol/L Tris-HCl；60mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

5)NTA-80，20mmol/L Tris-HCl；80mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

6)NTA-100，20mmol/L Tris-HCl；100mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油；

7)NTA-200，20mmol/L Tris-HCl；200mmol/L咪唑；0.5mol/L NaCl；10％(w/v)甘油。

具体纯化步骤是：

1)粗酶液溶于用NTA-0溶液中用于镍柱纯化；

2)菌体部分经过离心后加入NTA-0溶液重悬，12,000rpm离心10min去上清，然后用5mL NTA-0重悬细胞(约200mL培养物所得到的细胞)。超声破碎条件为冰浴中破碎，破碎3sec停止4sec每组80次。13,000rpm离心15min。仔细吸取上清液作为上柱样品；

3)柱子用10-20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加；

4)再用15-20mL NTA-0平衡，加样品5mL并开始收集穿透峰；

5)20-25mL NTA-0洗脱去杂蛋白，然后依次加入NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-300每种缓冲液5mL洗脱并收集洗脱液；

然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。如图1所示，显示得到了电泳纯脂肪酶。

实施例4脂肪酶酶学性质的研究

最适反应pH值及pH稳定性的测定

以纯化的重组脂肪酶LipG为材料，在不同的pH的缓冲体系中进行脂肪酶活性的测定。底物pNPP用一系列不同pH值的缓冲液(pH5.0-6.5，乙酸缓冲液；pH 6.5-7.5，PBS缓冲液；pH 7.5-8.5，Tris-HCl缓冲液；pH 8.5-10.0Gly-NaOH)配制，37℃下在这些不同的缓冲体系中进行酶促反应，测定酶活性。结果表明，该酶的最适pH为7.5，在pH 6.5-8.5范围内，具有明显的脂肪酶活性。pH在5.0以下及10以上，检测不到脂肪酶活性，说明该酶在中性偏碱条件下具有脂肪酶活性(图2)。

将纯化的重组脂肪酶LipG在不同pH缓冲液，37℃处理1h后，并在37℃，pH 7.5条件下测定剩余的脂肪酶活性，来研究酶在不同pH条件下的稳定性。各pH值条件下的测定重复3次，取平均值。结果表明：重组脂肪酶在pH 3-12时，都比较温度，其中在碱性条件下比在酸性条件下稳定。在pH12的缓冲液中处理1小时，酶活性基本不损失(图3)。

最适反应温度及热稳定性

以纯化的重组脂肪酶LipG为材料，在不同温度下进行酶促反应后，测定其酶活性，得到其最适反应温度。对LipG在20℃到80℃，每隔5℃测定其活性。每次测定重复3次，取平均值。结果表明，重组脂肪酶LipG的最适反应温度是65℃，温度在低于65℃时，随着温度升高酶活性逐步上升，高于65℃酶活力迅速下降，但到80℃时仍有最高活力的75％(图4)。

热稳定性是将酶液先在不同温度下处理3小时，再进行酶活性测定以研究酶的温度稳定性。在70℃、80℃和90℃下，分别处理酶液，处理时间为0.5h、1h、1.5h、2.0h、2.5h与3.0h，处理后在37℃测定其剩余的脂肪酶活力。结果表明，重组脂肪酶LipG具有非常好的热稳定性，完全可以抵制在饲料加工时的高温制粒的过程。在90℃处理半小时后，还有90％的活性剩余；即使在90℃处理3小时，也还有约74％的脂肪酶活力剩余(图5)。

Claims

1.一种温度适性广的高温中性脂肪酶LIPG，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种温度适性广的高温中性脂肪酶的基因LipG，其特征在于，编码权利要求1所述的脂肪酶。

3.如权利要求2所述的脂肪酶的基因LipG，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.2所示。

4.包含权利要求2所述脂肪酶的基因LipG的重组载体pET-28a-LipG。

5.包含权利要求2所述脂肪酶的基因LipG的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

7.一种制备温度适性广的高温中性脂肪酶LIPG的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组脂肪酶表达；以及

3)纯化所表达的脂肪酶LIPG。

8.权利要求1所述的温度适性广的高温中性脂肪酶LIPG的应用。