CN114480545A - 一种高f值富硒寡肽的制备方法及其抗疲劳产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高F值富硒寡肽的制备方法及其抗疲劳产品，其包括如下步骤：S1、对富硒原料进行干燥、粉碎，以获得富硒原料粉；S2、提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品，并对所述富硒蛋白粗品进行纯化；S3、将所述富硒蛋白成品调浆后依次经过内肽酶酶膜反应器和外肽酶酶膜反应器酶解，酶解后产物经超滤膜去除大分子多肽蛋白质，以获得富硒寡肽粗品；S4、对所述富硒寡肽粗品进行活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理，以获得高F值富硒寡肽粗品；以及S5、对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋，以获得所述高F值富硒寡肽成品。本发明可通过结合活性炭脱芳处理、大孔树脂脱盐处理以及包埋处理获得稳定性好的高F值富硒寡肽。

Description

一种高F值富硒寡肽的制备方法及其抗疲劳产品
技术领域
本发明涉及食品工程领域，具体为一种高F值富硒寡肽的制备方法及其抗疲劳产品。
背景技术
寡肽(Oligo-peptide)是由2-9个氨基酸组合而成的蛋白质前体，或是由蛋白质降解到2-9个氨基酸组成的蛋白质降解物，也可称小肽、短肽等。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。在氨基酸或寡肽的混合物中，支链氨基酸(BCAA：Val、Ile、Leu)与芳香族氨基酸(AAA：Tyr、Phe)的摩尔比称为Fischer值(Fischerratio)，简称F值。高F值寡肽的要求是BCAA含量高、AAA含量低。F值不同，用途也有所不同，如目前用于临床治疗肝病患者的寡肽F值要求大于20。
目前常见的高F值寡肽制备方法多通过蛋白酶水解法实现，即水解暴露芳香族氨基酸，再水解去除芳香族氨基酸而得成品，目前对此方面的研究主要集中在以玉米黄粉、大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白为原料的制备工艺中，目前并未出现专门针对高F值富硒寡肽的制备工艺出现。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高F值富硒寡肽的制备方法及其抗疲劳产品，其寡肽F值高，且结构稳定，并且能促进机体对于硒元素的吸收。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
提供了一种高F值富硒寡肽的制备方法，其包括如下步骤：
S1、对富硒原料进行干燥、粉碎，以获得富硒原料粉；
S2、提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品，并对所述富硒蛋白粗品进行纯化；纯化后的富硒蛋白粗品经纳滤膜脱盐后获得富硒蛋白成品；
S3、将所述富硒蛋白成品调浆后依次经过外肽酶酶膜反应器和内肽酶酶膜反应器酶解，酶解后产物经超滤膜去除大分子多肽蛋白质，以获得富硒寡肽粗品；
S4、对所述富硒寡肽粗品进行活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理，以获得高F值富硒寡肽粗品；
以及S5、对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋，以获得所述高F值富硒寡肽成品。
优选的，所述富硒原料包括：富硒香菇、富硒薏仁米、富硒高粱米，且按重量计，富硒香菇：富硒薏仁米：富硒高粱米＝1：(1-2)：(1-2)。
优选的，所述步骤S2中，提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品的步骤包括：
S11、称取富硒原料粉置于正己烷中，在室温条件下搅拌6h后旋转蒸发回收正己烷，以获得富硒原料脱脂粉，再将富硒原料脱脂粉于40℃低温烘干；其中，正己烷重量为富硒原料粉的3-4倍；
S12、将富硒原料脱脂粉放入反应釜中，向其中加入富硒原料脱脂粉重量3-4倍的水搅拌均匀，以获得反应原液；
S13、采用若干脉冲激光光源对所述反应原液进行照射，照射时间为25min，同时对反应原液进行超声处理，超声功率为200KW，超声处理温度为30℃；每一脉冲激光在所述反应原液液面上形成的光斑直径为0.8cm，且每一脉冲激光作用于所述反应原液的激光能量为45mJ；
S14、在所述反应原液中加入富硒原料粉重量2.5％的纤维素酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至4.0-5.5，并在50℃条件下水解反应12h，水解完成后，将反应原液加热到80℃保持5-10min，以完成灭酶；水解反应过程中同时对反应原液进行第一光照处理和第一磁场处理；
所述第一光照处理为：采用光强为10-15μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-15μmol.m-2.s-1的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-20min；
所述第一磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S15、在经步骤S14处理后的反应原液中加入富硒原料脱脂粉重量2％的果胶酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至3.0-4.5以及调节温度至52℃，水解反应10h，水解完成后，将反应原液加热到80℃保持5-10min，以完成灭酶，最终得到反应液；水解反应过程中同时对反应原液进行第二光照处理和第二磁场处理；
所述第二光照处理为：采用光强为15-20μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-20μmol.m-2.s-1的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-25min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.1-0.2mT的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S16、对经过步骤S15处理后得到的反应液进行减压过滤，得富硒蛋白提取液，对所述富硒蛋白提取液进行浓缩，旋转蒸发至体积减少至14％，以获得富硒蛋白浓缩液，所述富硒蛋白浓缩液即为富硒蛋白粗品。
优选的，所述步骤S2中，对所述富硒蛋白粗品进行纯化的步骤包括：在所述富硒蛋白浓缩液中加入硫酸铵至其饱和度为95％，于4℃条件下搅拌2h后静置8h，再于4000r/min条件下离心12min，收集上清液，所述上清液即为纯化后的富硒蛋白粗品。
优选的，所述步骤S3中，制备富硒寡肽粗品步骤包括：
S31、将所述上清液加入纳滤系统，操作压力为0.15Mpa，纳滤膜的截流分子量为800-1000Da，收集截留液；
S32、在所述截留液中加入其重量1.5-2.5％的木瓜蛋白酶，采用0.1mol/L的NaOH调整pH值至5-7，并加热至50-60℃，水解4h；
S33、在经步骤S32处理后的酶解液中加入羧肽酶A，调节pH至7.0，并加热至37℃，水解2h，其中，羧肽酶A的比活力为2.0×104U/g；
S34、对经步骤S33处理后的酶解液加入超滤系统，操作压力为0.25MPa，超滤膜的截流分子量为3000-10000Da，收集透过液，所述透过液即为富硒寡肽粗品溶液。
优选的，所述步骤S4包括：
S41、向所述富硒寡肽粗品溶液中加入粉末活性炭，在25℃，pH 3，160r/min的条件下吸附3h，过滤后获得滤液，以完成所述活性炭脱芳处理；
S42、将所述滤液以4BV/h的流速流过大孔吸附树脂，以完成大孔树脂脱盐处理，然后对完成脱盐处理的滤液进行冻干处理，以得到高F值富硒寡肽粗品。
优选的，所述步骤S31中，所述活性炭与与粗品溶液的重量体积比为1:25(g/ml)。
优选的，所述步骤S42中，所述大孔树脂需经如下步骤进行处理：树脂先用无水乙醇浸泡至完全胀溶，除去漂浮物，用无水乙醇充分冲洗，直至加入蒸馏水后澄清无白色浑浊出现；反复用蒸馏水冲洗至无乙醇味，然后加入5％的盐酸浸泡2h，用蒸馏水洗净后加入5％的NaOH溶液浸泡2h，再用蒸馏水洗至中性，以完成大孔树脂预处理。
优选的，步骤S5中，对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋包括：
S51、取所述高F值富硒寡肽粗品加入45℃的纯水中进行溶解，300r/min条件下磁力搅拌30min，以获得芯材溶液；且所述高F值富硒寡肽粗品与所述纯水的重量比为1：(2-3)；
S52、取明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶溶于55℃的纯水中，200r/min条件下磁力搅拌30min，以获壁材溶液；且所述明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶与所述纯水的重量比为1：1.5：2：1：115；
以及S53、将所述芯材溶液、壁材溶液和乳化剂混合，并经高压脉冲电场处理后进行高压均质，以得到乳化液，再对乳化液进行喷雾干燥，以完成包埋；所述高压均质条件为：均质压力为25Mpa，均质次数为2次；所述喷雾干燥过程中的进料温度为55℃，进料浓度为13％，进风温度为100℃，出风温度为80℃，进料速度为35ml/min。
还提供一种通过上述制备方法制得的抗疲劳高F值富硒寡肽。
本发明专门适用于高F值富硒寡肽的制备，其结合激光脉冲+磁场+光照处理+酶解的方式促进细胞壁、细胞膜的结构分解，使其内容物可以充分释放，进一步采用特定内肽酶酶膜反应器和外肽酶酶膜反应器双酶协同定向水解的方式充分水解大分子蛋白质，并且结合活性炭脱芳处理、大孔树脂脱盐处理以及包埋处理获得稳定性好的高F值富硒寡肽。
附图说明
图1为不同高F值富硒寡肽的吸湿率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供了一种高F值富硒寡肽的制备方法，其包括如下步骤：
S1、对富硒原料进行干燥，然后采用超微植物粉碎，粉碎后过40目筛，以获得富硒原料粉；本实施例中，所述富硒原料包括：富硒香菇、富硒薏仁米、富硒高粱米，且按重量计，富硒香菇：富硒薏仁米：富硒高粱米＝1：(1-2)：(1-2)(优选为1：1:1)，由此，可通过多种富硒植物原料提供丰富的富硒蛋白，同时上述各种富硒原料可以通过不同种类、不同含量的营养元素，如氨基酸、矿物质和维生素等，使得产品整体营养丰富、搭配合理；
S2、提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品，并对所述富硒蛋白粗品进行纯化；纯化后的富硒蛋白粗品经纳滤膜脱盐后获得富硒蛋白成品；所述纳滤膜的截流分子量为800-1000Da；
S3、将所述富硒蛋白成品调浆后依次经过外肽酶酶膜反应器和内肽酶酶膜反应器酶解，酶解后产物经超滤膜去除大分子多肽蛋白质，以获得富硒寡肽粗品；所述超滤膜的截流分子量为3000-10000Da；
S4、对所述富硒寡肽粗品进行活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理，以获得高F值富硒寡肽粗品；
以及S5、对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋，以获得所述高F值富硒寡肽成品。
具体的，所述步骤S2中，提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品的步骤包括：
S11、称取富硒原料粉置于正己烷中，在室温条件下搅拌6h后旋转蒸发回收正己烷，以获得富硒原料脱脂粉，再将富硒原料脱脂粉于40℃低温烘干；其中，正己烷重量为富硒原料粉的3-4倍；
S12、将富硒原料脱脂粉放入反应釜中，向其中加入富硒原料脱脂粉重量3-4倍的水搅拌均匀，以获得反应原液；
S13、采用若干脉冲激光光源对所述反应原液进行照射，照射时间为25min，以及同时对反应原液进行超声处理，超声功率为200KW，超声处理温度为30℃；每一脉冲激光在所述反应原液液面上形成的光斑直径为0.8cm，且每一脉冲激光作用于所述反应原液的激光能量为45mJ；
S14、在所述反应原液中加入富硒原料粉重量2.5％的纤维素酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至4.0-5.5以及调节温度至50℃，水解反应12h，水解完成后，将水解液加热到80℃保持5-10min，完成灭酶；水解反应过程中同时对反应原液进行第一光照处理和第一磁场处理；所述第一光照处理为：采用光强为10-15μmol.m-2.s-1(优选为12μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为10-15μmol.m-2.s-1(优选为12μmol.m-2.s-1)的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-20min；所述第一磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT(优选为0.25mT)的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S15、在经步骤S14处理后的反应原液中加入富硒原料脱脂粉重量2％的果胶酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至3.0-4.5以及调节温度至52℃，水解反应10h，水解完成后，将反应原液加热到80℃保持5-10min，以完成灭酶，最终得到反应液；水解反应过程中同时对发酵原液进行第二光照处理和第二磁场处理；所述第二光照处理为：采用光强为15-20μmol.m-2.s-1(优选为18μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为10-20μmol.m-2.s-1(优选为15μmol.m-2.s-1)的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-25min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.1-0.2mT(优选为0.15mT)的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S16、对经过步骤S15处理后的反应原液进行减压过滤，得富硒蛋白提取液，对所述富硒蛋白提取液进行浓缩，以获得富硒蛋白浓缩液，所述富硒蛋白浓缩液即为富硒蛋白粗品；其中，所述浓缩包括：将所述发酵原液置于旋转蒸发仪中，并于53℃、0.15MPa条件下减压浓缩至原体积的14％。
由此，可通过激光脉冲+磁场+光照处理+酶解的方式促进细胞壁、细胞膜的结构分解，使其内容物(如大分子蛋白质)可以充分释放，以提高后续高F值富硒寡肽的产率。
同时，所述步骤S2中，对所述富硒蛋白粗品进行纯化的步骤包括：在所述富硒蛋白浓缩液中加入硫酸铵至其饱和度为95％，于4℃条件下搅拌2h后静置8h，再于4000r/min条件下离心12min，收集上清液，所述上清液即为纯化后的富硒蛋白粗品。由此可通过盐析方式对大分子蛋白质进行纯化，提高其纯度和产率。
进一步的，所述步骤S3包括：
S31、将所述上清液加入纳滤系统，操作压力为0.15Mpa，纳滤膜的截流分子量为800-1000Da，收集截留液；
S32、在所述截留液中加入其重量1.5-2.5％的木瓜蛋白酶，采用0.1mol/L的NaOH调整pH值至5-7，并加热至50-60℃，水解4h；
S33、在经步骤S32处理后的酶解液中加入羧肽酶A，调节pH至7.0，并加热至37℃，水解2h，其中，羧肽酶A的比活力为2.0×104U/g；
S34、对经步骤S33处理后的酶解液加入超滤系统，操作压力为0.25MPa，超滤膜的截流分子量为3000-10000Da，收集透过液，所述透过液即为富硒寡肽粗品溶液。
进一步的，所述步骤S4包括：
S41、将所述富硒寡肽粗品配制成粗品溶液，然后在所述粗品溶液中加入粉末活性炭，在25℃，pH 3，160r/min条件下吸附3h，过滤后获得滤液，以完成所述活性炭脱芳处理；且所述活性炭与与粗品溶液的重量体积比为1:25(g/ml)；
S42、将所述滤液以4BV/h的流速流过大孔吸附树脂，以完成大孔树脂脱盐处理，然后对完成脱盐处理的滤液进行冻干处理，以得到高F值富硒寡肽粗品。所述大孔树脂需经如下步骤进行处理：树脂先用无水乙醇浸泡至完全胀溶，除去漂浮物，用无水乙醇充分冲洗，直至加入蒸馏水后澄清无白色浑浊出现；反复用蒸馏水冲洗至无乙醇味，然后加入5％的盐酸浸泡2h，用蒸馏水洗净后加入5％的NaOH溶液浸泡2h，再用蒸馏水洗至中性，以完成大孔树脂预处理；
同时，步骤S5中，对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋包括：
S51、取所述高F值富硒寡肽粗品加入45℃的纯水中进行溶解，300r/min条件下磁力搅拌30min，以获得均匀的芯材溶液；且所述高F值富硒寡肽粗品与所述纯水的重量比为1：(2-3)(优选为1:2.5)；
S52、取明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶溶于55℃的纯水中，200r/min条件下磁力搅拌30min，以获均匀的壁材溶液；且所述明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶与所述纯水的重量比为1：1.5：2：1：115；
以及S53、将所述芯材溶液、壁材溶液和乳化剂混合，并经高压脉冲电场处理后进行高压均质，以得到乳化液，再对乳化液进行喷雾干燥，以完成包埋；所述乳化剂为卵磷脂、豆磷脂、月桂醇聚醚硫酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚中的一种或多种；所述高压均质条件为：均质压力为25Mpa，均质次数为2次；所述喷雾干燥过程中的进料温度为55℃，进料浓度为13％，进风温度为100℃，出风温度为80℃，进料速度为35ml/min。
由此，可通过活性炭脱芳处理进一步提高F值，同时通过大孔树脂脱盐处理进一步纯化蛋白质，此外还结合包埋处理进一步提高高F值富硒寡肽的稳定性。
实施例2：
本实施例提高了一种通过实施例1所述制备方法制得的高F值富硒寡肽，该高F值富硒寡肽即为一种抗疲劳产品。
以下对本发明的制备方法以及高F值富硒寡肽进行效果评价。
1.富硒蛋白提取效果评价
将原料(富硒香菇：富硒薏仁米：富硒高粱米＝＝1:1:1)打浆，放入超声破碎机中破碎。经过超声波破碎后，用蜗牛酶进一步水解细胞壁，然后用0.1mol/L NaOH溶液将浆液pH值调到10.0，浸提1h，以6000r/min速率离心15min，取上清液用0.1mol/L HCl溶液调pH值到等电点，静止1h，沉淀析出后以6000r/min速率离心10min，得到蛋白沉淀进行冷冻干燥，制得对比例1中的富硒蛋白，将其与本发明实施例1步骤S2制得的富硒蛋白进行蛋白得率计算。蛋白含量的测定采用凯氏定氮法，处理液中蛋白含量采用考马斯亮蓝法G-250法测定，其结果如表1所示。
蛋白提取率的计算：
Figure BDA0003511932010000091
表1富硒蛋白得率
富硒蛋白提取率(％) 提取时间(min)
实施例1 80.59 90
对比例1 52.17 150
由表1可知，本发明实施例1中步骤S2的富硒蛋白制备方法优势显著，其富硒蛋白的得率较对比例1提高54.48％，且提取时间缩减40％。其原因在于，由于本发明结合激光脉冲+磁场+光照处理+酶解的方式促进细胞壁、细胞膜的结构分解，其作用方式多样化，且相互之间可产生协同作用，由此可使其细胞内容物(如蛋白质)可以充分、快速释放。
2.包埋处理效果评价
将实施例1中步骤S4中制备获得的高F值富硒寡肽粗品作为对比例2(即图1中的“对比例2”)，不经过包埋处理；将其与实施例1中步骤S5中通过包埋获得的高F值富硒寡肽成品(即图1中的“实施例1”)进行比较。
具体的，底部放有氯化钠饱和溶液的玻璃干燥器于25℃放置1d(相对湿度为75％),分别精密称取对比例2及高F值富硒寡肽成品0.2g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中(厚度约2mm),干燥至恒重，开盖置于玻璃干燥器并定时称重,计算吸湿率，其结果如图1所示。
吸湿率(％)＝(吸湿后的质量-吸湿前的质量)/吸湿前的质量×100％
由图1可知，对比例2及实施例1的样品在玻璃干燥器连续放置，在刚开始的2h内,未包埋的高F值富硒寡肽迅速吸水,其后速率缓慢。而实施例2包埋后的微胶囊粉末质量在12h内仅增重15％，因此,微胶囊化处理后的高F值富硒寡肽的稳定性得到显著提高。
3.支链氨基酸与芳香族氨基酸检测
将本发明中的不经活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理的富硒寡肽粗品作为对比例3，将本发明中仅做活性炭脱芳处理，不做大孔树脂脱盐处理的富硒寡肽粗品作为对比例4，将经过实施例1完整处理(即经过步骤S4的活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理)的富硒寡肽粗品作为实施例1，利用氨基酸自动分析仪检测本发明高F值富硒寡肽氨基酸组成，计算BCAA和AAA的含量，判断肽液的F值，其结果如表2所示。
F值按下式进行计算：
F＝(Val+Ile+Leu)/(Tyr+Phe)
Val、Ile、Tyr、Phe、Leu分别代表缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的含量，mol/mL。
表2处理前后氨基酸组成及F值分析
Figure BDA0003511932010000101
从表2中可以看出，未经活性炭脱芳+大孔树脂脱盐处理的富硒寡肽粗品F值最低，经过活性炭脱芳+大孔树脂脱盐处理的富硒寡肽粗品F值最高(32.18)，比对比例3中仅经过活性炭脱芳处理后的F值提高了55.91％，比未经任何处理的F值提高了8.87倍，表明特定内肽酶酶膜反应器和外肽酶酶膜反应器双酶协同定向水解结合活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理可以对BCAA产生较强的富集作用，能显著促进对寡肽F值的提高效果。
4.硒功效实验
选用小鼠SPF级小鼠40只(雌雄各半，体重18-22g)，基础饲料适应性喂养1周后,按体重均分4组，即空白组、本发明高F值富硒寡肽高、中、低剂量组，每组10只，分笼饲养。高、中、低剂量组每天分别灌胃给予100μg/kg、75μg/kg、50μg/kg，空白组给予同等体积的蒸馏水，各组均喂食基础饲料，自由饮水，每天记录摄食量,每周称量体重。喂食4周后，移至代谢笼进行3d代谢实验，收集粪便。
饲料和样品经均匀混合过20目筛；粪便经马福炉500℃灰化24h，均消解，用原子荧光光谱法测定硒含量，并根据下列公式计算硒吸收率，其结果如表3所示。
Figure BDA0003511932010000111
表3硒吸收率
Figure BDA0003511932010000112
由上表3可知，给予本发明高、中、低剂量的高F值富硒寡肽可显著提高小鼠对硒的吸收率，发挥微量硒元素的保健功效，且高剂量组的效果最明显，其原因在于经过包埋处理的高F值富硒寡肽可保证硒蛋白在不同环境下的稳定性，使其不易分解、失效。
5、提高运动耐力(负重游泳试验)
选取健康雄性小鼠50只，适应性喂养7d，随机分成五组，每组10只，三个重复。分别为：空白组(蒸馏水)、本发明高F值富硒寡肽低剂量组(0.5g/(kg·d))、中剂量组(1.0g/(kg·d))、高剂量组(2.0g/(kg·d))、阳性对照组(对比例1的产品0.4g/(kg·d))，每周称质量一次，根据小鼠体质量给予不同体积的受试物，连续灌胃30d。小鼠给药30d后，对小鼠末次给予受试药物30min后进行负重游冰实验，将小鼠尾根部负荷体重5％的铅皮，置小鼠于游泳箱(50cm×50cm×40cm)中游泳，水深30cm,水温25℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间(小鼠鼻孔10s内不能浮出水面)，即小鼠负重游泳时间，结果如4所示。
表4小鼠负重游泳时间(min)变化
Figure BDA0003511932010000121
注:＊与空白组比较，p<0.05；##与空白组相比，p<0.01
如表4所示，相对于空白对照组以及对比例1而言，给予本发明的高F值富硒寡肽能显著提高小鼠负重游泳时间，且时间延长程度与喂服剂量成正相关,低、中、高剂量实验组与对照组比较,均有显著差异(P<0.05)。其中，中、高剂量实验组比对照量实验组分别显著高出3、4倍(P<0.01)。
6肝脏组织中GSH-PX浓度
三月龄SD大鼠(清洁级)50只,体重184±139,将大鼠适应性喂养一周后,随机分为5组,每组10只，3个重复：安静对照组、运动对照组及本发明高F值富硒寡肽高、中、低剂量组，标准饲料喂养,自由饮食。运动模式为有氧耐力性质的跑台运动，适应性训练后,每天连续运动30分钟，跑速恒定为30米/分钟。每周运动6天，共持续4周。高F值富硒抗疲劳寡肽微胶囊高、中、低剂量组每天灌胃100μg/kg、75μg/kg、50μg/kg，同时安静对照组和运动对照组在灌胃等量蒸馏水。第四周末检测运动后即刻和运动后3小时肝脏组织的GSH-PX浓度。断脊处死，取肝脏匀浆离心(3000r/min、20min)，取上清液，测试组织的GSH-PX浓度。
运动后即刻测定GSH-PX浓度，结果如表6所示：
表6运动后即刻测定GSH-PX浓度
Figure BDA0003511932010000131
运动后3小时测定GSH-PX浓度，结果如表7所示：
表7运动后3小时测定GSH-PX浓度
Figure BDA0003511932010000132
由上表6-7所示，大鼠肝脏中GSH-PX浓度在运动后即刻降低，运动后3小时升高。而服用本发明高F值富硒寡肽的高、中、低剂量组的GSH-PX浓度在运动后即刻升高，运动后3小时逐渐趋于正常水平，其中高剂量组的作用最明显。结果表明，服用本发明高F值富硒寡肽可提高运动小鼠耐力以及体内GSH-PX酶活性，清除自由基能力加强，抗氧化酶活性的升高显示出肝脏对刺激的应激能力在适应运动的基础上加强。
综上所述，本发明专门适用于高F值富硒寡肽的制备，其结合激光脉冲+磁场+光照处理+酶解的方式促进细胞壁、细胞膜的结构分解，使其内容物可以充分释放，进一步采用特定内肽酶酶膜反应器和外肽酶酶膜反应器双酶协同定向水解的方式充分水解大分子蛋白质，并且结合活性炭脱芳处理、大孔树脂脱盐处理以及包埋处理获得稳定性好的高F值富硒寡肽。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种高F值富硒寡肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对富硒原料进行干燥、粉碎，以获得富硒原料粉；
S2、提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品，并对所述富硒蛋白粗品进行纯化；纯化后的富硒蛋白粗品经纳滤膜脱盐后获得富硒蛋白成品；
S3、将所述富硒蛋白成品调浆后依次经过外肽酶酶膜反应器和内肽酶酶膜反应器酶解，酶解后产物经超滤膜去除大分子多肽蛋白质，以获得富硒寡肽粗品；
S4、对所述富硒寡肽粗品进行活性炭脱芳处理以及大孔树脂脱盐处理，以获得高F值富硒寡肽粗品；
以及S5、对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋，以获得所述高F值富硒寡肽成品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述富硒原料包括：富硒香菇、富硒薏仁米、富硒高粱米，且按重量计，富硒香菇：富硒薏仁米：富硒高粱米＝1：(1-2)：(1-2)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，提取所述富硒原料粉中的富硒蛋白粗品的步骤包括：
S11、称取富硒原料粉置于正己烷中，在室温条件下搅拌6h后旋转蒸发回收正己烷，以获得富硒原料脱脂粉，再将富硒原料脱脂粉于40℃低温烘干；其中，正己烷重量为富硒原料粉的3-4倍；
S12、将富硒原料脱脂粉放入反应釜中，向其中加入富硒原料脱脂粉重量3-4倍的水搅拌均匀，以获得反应原液；
S13、采用若干脉冲激光光源对所述反应原液进行照射，照射时间为25min，同时对反应原液进行超声处理，超声功率为200KW，超声处理温度为30℃；每一脉冲激光在所述反应原液液面上形成的光斑直径为0.8cm，且每一脉冲激光作用于所述反应原液的激光能量为45mJ；
S14、在所述反应原液中加入富硒原料粉重量2.5％的纤维素酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至4.0-5.5，并在50℃条件下水解反应12h，水解完成后，将反应原液加热到80℃保持5-10min，以完成灭酶；水解反应过程中同时对反应原液进行第一光照处理和第一磁场处理；
所述第一光照处理为：采用光强为10-15μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-15μmol.m-2.s-1的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-20min；
所述第一磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S15、在经步骤S14处理后的反应原液中加入富硒原料脱脂粉重量2％的果胶酶，采用0.1mol/L的HCl调整pH值至3.0-4.5以及调节温度至52℃，水解反应10h，水解完成后，将反应原液加热到80℃保持5-10min，以完成灭酶，最终得到反应液；水解反应过程中同时对反应原液进行第二光照处理和第二磁场处理；
所述第二光照处理为：采用光强为15-20μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-20μmol.m-2.s-1的蓝光照射反应原液，照射处理时间均为15-25min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.1-0.2mT的交变磁场对反应原液进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S16、对经过步骤S15处理后得到的反应液进行减压过滤，得富硒蛋白提取液，对所述富硒蛋白提取液进行浓缩，以获得富硒蛋白浓缩液，所述富硒蛋白浓缩液即为富硒蛋白粗品。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，对所述富硒蛋白粗品进行纯化的步骤包括：在所述富硒蛋白浓缩液中加入硫酸铵至其饱和度为95％，于4℃条件下搅拌2h后静置8h，再于4000r/min条件下离心12min，收集上清液，所述上清液即为纯化后的富硒蛋白粗品。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，制备富硒寡肽粗品步骤包括：
S31、将所述上清液加入纳滤系统，操作压力为0.15Mpa，纳滤膜的截流分子量为800-1000Da，收集截留液；
S32、在所述截留液中加入其重量1.5-2.5％的木瓜蛋白酶，采用0.1mol/L的NaOH调整pH值至5-7，并加热至50-60℃，水解4h；
S33、在经步骤S32处理后的酶解液中加入羧肽酶A，调节pH至7.0，并加热至37℃，水解2h，其中，羧肽酶A的比活力为2.0×104U/g；
S34、对经步骤S33处理后的酶解液加入超滤系统，操作压力为0.25MPa，超滤膜的截流分子量为3000-10000Da，收集透过液，所述透过液即为富硒寡肽粗品溶液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
S41、向所述富硒寡肽粗品溶液中加入粉末活性炭，在25℃，pH 3的条件下吸附3h，过滤后获得滤液，以完成所述活性炭脱芳处理；
S42、将所述滤液以4BV/h的流速流过大孔吸附树脂，以完成大孔树脂脱盐处理，然后对完成脱盐处理的滤液进行冻干处理，以得到高F值富硒寡肽粗品。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S31中，所述活性炭与与粗品溶液的重量体积比为1:25(g/ml)。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S42中，所述大孔树脂需经如下步骤进行处理：树脂先用无水乙醇浸泡至完全胀溶，除去漂浮物，用无水乙醇充分冲洗，直至加入蒸馏水后澄清无白色浑浊出现；反复用蒸馏水冲洗至无乙醇味，然后加入5％的盐酸浸泡2h，用蒸馏水洗净后加入5％的NaOH溶液浸泡2h，再用蒸馏水洗至中性，以完成大孔树脂预处理。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中，对所述高F值富硒寡肽粗品进行包埋包括：
S51、取所述高F值富硒寡肽粗品加入45℃的纯水中进行溶解，300r/min条件下磁力搅拌30min，以获得芯材溶液；且所述高F值富硒寡肽粗品与所述纯水的重量比为1：(2-3)；
S52、取明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶溶于55℃的纯水中，200r/min条件下磁力搅拌30min，以获壁材溶液；且所述明胶、环糊精、魔芋胶、卡拉胶与所述纯水的重量比为1：1.5：2：1：115；
以及S53、将所述芯材溶液、壁材溶液和乳化剂混合，并经高压脉冲电场处理后进行高压均质，以得到乳化液，再对乳化液进行喷雾干燥，以完成包埋；所述高压均质条件为：均质压力为25Mpa，均质次数为2次；所述喷雾干燥过程中的进料温度为55℃，进料浓度为13％，进风温度为100℃，出风温度为80℃，进料速度为35ml/min。
10.一种通过权利要求1-9任一项所述制备方法制得的抗疲劳高F值富硒寡肽。
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