CN107686527A - 一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法 - Google Patents

一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法。该提取方法采用热水浸提以及DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析纯化的工艺，提取得到猴头菇抗过敏活性多糖。本发明提取方法得到的猴头菇抗过敏活性多糖经高效凝胶渗透色谱检测，呈现单一对称峰，纯度均一，对照标准曲线计算分子量为 10kDa，且对透明质酸酶有明显的抑制作用，具有抗过敏活性。

Description

一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及抗过敏活性多糖制备技术领域，具体涉及一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法。
背景技术
猴头菇(Hericium erinaceus)是国内众所周知的药食同源菌，由于其在胃炎的防治、护胃等方面具有生物活性而备受关注。目前，已对猴头菇中的多种活性成分进行了研究，如多糖、生物碱、萜类、酚酸类物质等。对猴头菇活性成分的研究也从护胃、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化扩展到改善轻度认知障碍、抗菌、抗炎等方面。然而，关于猴头菇多糖抗过敏活性的研究比较少。市场上猴头菇的相关保健品仍以猴头菇多糖为主，而多糖的提取分离纯化方法不同，所得到的多糖结构、活性也存在差异，因此，有必要把活性与活性物质的提取方法联系起来。
透明质酸酶是将透明质酸降解为小分子的糖苷酶，而透明质酸酶的活性与I型过敏反应具有密切关系。研究表明，透明质酸酶抑制剂能抑制由抗原诱导引起的大鼠腹膜渗出细胞的组胺的释放及致敏豚鼠回肠肌过敏性收缩反应，从而对I型过敏反应有抑制作用。因此，制备一种具有抗过敏活性的猴头菇多糖对于抗过敏药物的开发具有一定的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，该提取方法采用热水浸提以及DEAE Sepharose Fast Flow （弱碱性阴离子交换剂）离子交换柱层析纯化的工艺，制备得到猴头菇抗过敏活性多糖。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，包括如下步骤：
（1）猴头菇晒干后，经粉碎、过筛，热水浸提，得到猴头菇多糖粗提液；
（2）将猴头菇多糖粗提液真空浓缩后，经Sevage试剂脱蛋白、大孔树脂脱色，再经蒸馏水透析，冷冻干燥，得到粗多糖；
（3）得到的粗多糖经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析纯化后，依次经蒸馏水、NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩，得到收集液；
（4）再将收集液经蒸馏水透析，冷冻干燥，得到所述猴头菇抗过敏活性多糖（HEP）。
进一步地，步骤（1）中，所述过筛是过80目筛。
进一步地，步骤（1）中，所述热水浸提为：将过筛得到的粉末与蒸馏水按料液比1:20~1:30g/mL混合后，于75~85℃水浴加热5~6h，3000~4000r/min离心20~30min收集提取液。
进一步地，步骤（2）中，所述脱蛋白为：将真空浓缩后的猴头菇多糖粗提液与Sevage试剂按体积比2:1~4:1的比例混合后，3000~4000r/min离心10~20min，再真空旋转蒸发去除Sevage试剂。
进一步地，步骤（2）中，所述脱蛋白的次数为5~8次。
进一步地，步骤（2）中，所述大孔树脂为D315大孔树脂。
进一步地，步骤（2）中，所述脱色为：将脱蛋白后的猴头菇多糖粗提液与大孔树脂按体积比10:2~10:4的比例混合后，搅拌5~7h，过滤。
进一步地，步骤（2）中，所述蒸馏水透析为：将脱色后的猴头菇多糖粗提液转移至3000~5000Da透析袋中，蒸馏水透析40~48小时，且每6~8小时换一次蒸馏水。
进一步地，步骤（2）中，所述冷冻干燥是在-20℃预冻8~12小时，在温度-45~-40℃的冷阱中冷冻干燥38~42小时。
进一步地，步骤（3）中，所述DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析纯化为：将粗多糖用蒸馏水配制成25~50mg/mL溶液，经6000~8000r/min离心10~20min，得到的上清液用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析。
进一步地，步骤（3）中，所述蒸馏水洗脱为：1~2mL/min的流速，每管3~5min自动收集，苯酚硫酸法跟踪检测，至吸光度为0。
进一步地，步骤（3）中，所述NaCl溶液的浓度为0.1~0.2M。
进一步地，步骤（3）中，所述NaCl溶液洗脱方法与蒸馏水洗脱方法相同。
进一步地，步骤（3）中，收集洗脱液为NaCl溶液洗脱条件下，苯酚硫酸法跟踪检测的洗脱曲线中的吸收峰对应的收集液。
进一步地，步骤（4）中，所述蒸馏水透析为：将收集液转移至6000~8000Da透析袋中，蒸馏水透析40~48小时，每6~8个小时换一次蒸馏水。
进一步地，步骤（4）中，所述冷冻干燥是在-20℃预冻8~12小时，在温度-45~-40℃的冷阱中冷冻干燥38~42小时。
进一步地，步骤（2）、（3）中，所述真空浓缩为浓缩至固形物含量为10~16%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提取方法得到的猴头菇抗过敏活性多糖（HEP）经由TSK-GEL G-5000 PWXL 与TSK-GEL G-3000PWXL 串联组成的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，呈现单一对称峰，纯度均一，对照标准曲线计算分子量为 10kDa，且对透明质酸酶有明显的抑制作用，具有抗过敏活性。
附图说明
图1为实施例1中提取得到的HEP纯度检测的HPGPC图；
图2为实施例1中提取得到的HEP对透明质酸酶活性的抑制效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于此。
实施例1
猴头菇抗过敏活性多糖的提取，具体包括如下步骤：
（1）把猴头菇晒干后，经粉碎、过80目筛，得到猴头菇粉，取猴头菇粉50g，加入1000mL蒸馏水，80℃水浴5h，3000r/min离心20min，收集提取液，得到猴头菇多糖粗提液；
（2）猴头菇多糖粗提液真空浓缩至固形物含量为10%后，与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=5:1，体积比）以体积比4:1的比例混合，脱蛋白5次，每次3000r/min离心20min；真空旋转蒸发去除Sevage试剂后，与D315大孔树脂以体积比10:3的比例混合，搅拌5h，过滤；
（3）将步骤（2）最终过滤得到粗提液转移至3000Da透析袋中，蒸馏水透析48h，每6个小时换一次水，透析液于-20℃预冻8小时，在温度-40℃的冷阱中冷冻干燥42小时，得到粗多糖；
（4）取粗多糖50mg，用2mL蒸馏水溶解，8000r/min离心10min，得到的上清液用DEAESepharose Fast Flow离子交换柱层析后，先用蒸馏水作为洗脱剂，1mL/min的流速，每管5min自动收集，苯酚硫酸法跟踪检测，至吸光度为0，再将洗脱剂换成0.15M NaCl溶液，收集吸收峰对应的溶液，真空浓缩至固形物含量为12%，得收集液；
（5）收集液被转移至7000Da透析袋中，蒸馏水透析48h，每6个小时换一次水，透析液于-20℃预冻10小时，在温度-40℃的冷阱中冷冻干燥42小时，得到猴头菇抗过敏活性多糖（HEP）。
HEP经由TSK-GEL G-5000 PWXL 与TSK-GEL G-3000PWXL 串联组成的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，呈现单一对称峰，如图1所示，纯度均一，对照标准曲线计算分子量为10kDa。
提取得到的HEP对透明质酸酶活性的抑制效果图如图2所示，当HEP浓度为5mg/mL时，透明质酸酶活性的抑制率为20.55%；当HEP浓度为10mg/mL时，透明质酸酶活性的抑制率为52.38%；当HEP浓度为15mg/mL时，透明质酸酶活性的抑制率为57.00%；当HEP浓度高于20mg/mL时，透明质酸酶活性的抑制率基本维持在51.00%；对透明质酸酶有明显的抑制作用，具有抗过敏活性。
实施例2
猴头菇抗过敏活性多糖的提取，具体包括如下步骤：
（1）把猴头菇晒干后，经粉碎、过80目筛，得到猴头菇粉，取猴头菇粉80g，加入2400mL蒸馏水，85℃水浴6h，4000r/min离心30min，收集提取液，得到猴头菇多糖粗提液；
（2）猴头菇多糖粗提液真空浓缩至固形物含量为14%后，与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=5:1，体积比）以体积比2:1的比例混合，脱蛋白6次，每次4000r/min离心10min；真空旋转蒸发去除Sevage试剂，与D315大孔树脂以体积比10:4的比例混合，搅拌6h，过滤；
（3）将步骤（2）最终过滤得到粗提液转移至5000Da透析袋中，蒸馏水透析40h，每8个小时换一次水，透析液于-20℃预冻12小时，在温度-45℃的冷阱中冷冻干燥38小时，得到粗多糖；
（4）取粗多糖50mg，用1mL蒸馏水溶解，6000r/min离心20min，得到的上清液用DEAESepharose Fast Flow 离子交换柱层析后，先用蒸馏水作为洗脱剂，2mL/min的流速，每管3min自动收集，苯酚硫酸法跟踪检测，至吸光度为0，再将洗脱剂换成0.1M NaCl溶液，收集吸收峰对应的溶液，真空浓缩至固形物含量为15%，得收集液；
（5）收集液被转移至8000Da透析袋中，蒸馏水透析40h，每8个小时换一次水，透析液于-20℃预冻8小时，在温度-45℃的冷阱中冷冻干燥38小时，得到猴头菇抗过敏活性多糖（HEP）。
HEP经由TSK-GEL G-5000 PWXL 与TSK-GEL G-3000PWXL 串联组成的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，呈现单一对称峰，参见图1，纯度均一，对照标准曲线计算分子量为10kDa。
提取得到的HEP对透明质酸酶活性的抑制效果图参见图2，对透明质酸酶有明显的抑制作用，具有抗过敏活性。
实施例3
猴头菇抗过敏活性多糖的提取，具体包括如下步骤：
（1）把猴头菇晒干后，经粉碎、过80目筛，得到猴头菇粉，取猴头菇粉60g，加入1500mL蒸馏水，75℃水浴5.5h，3500r/min离心25min，收集提取液，得到猴头菇多糖粗提液；
（2）猴头菇多糖粗提液真空浓缩至固形物含量为13%后，与Sevage试剂（氯仿：正丁醇=5:1，体积比）以体积比3:1的比例混合，脱蛋白8次，每次3500r/min离心15min；真空旋转蒸发去除Sevage试剂，与D315大孔树脂以体积比5:1的比例混合，搅拌7h，过滤；
（3）将步骤（2）最终过滤得到粗提液转移至4000Da透析袋中，蒸馏水透析45h，每7个小时换一次水，透析液于-20℃预冻10小时，在温度-43℃的冷阱中冷冻干燥40小时，得到粗多糖；
（4）取粗多糖40mg，用1mL蒸馏水溶解，7000r/min离心15min，得到的上清液用DEAESepharose Fast Flow 离子交换柱层析后，先用蒸馏水作为洗脱剂，1.5mL/min的流速，每管4min自动收集，苯酚硫酸法跟踪检测，至吸光度为0，再将洗脱剂换成0.2M NaCl溶液，收集吸收峰对应的溶液，真空浓缩至固形物含量为16%，得收集液；
（5）收集液被转移至6000Da透析袋中，蒸馏水透析48h，每7个小时换一次水，透析液于-20℃预冻12小时，在温度-43℃的冷阱中冷冻干燥40小时，得到猴头菇抗过敏活性多糖（HEP）。
HEP经由TSK-GEL G-5000 PWXL 与TSK-GEL G-3000PWXL 串联组成的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测，呈现单一对称峰，参见图1，纯度均一，对照标准曲线计算分子量为10kDa。
提取得到的HEP对透明质酸酶活性的抑制效果图参见图2，对透明质酸酶有明显的抑制作用，具有抗过敏活性。

Claims (10)

1.一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）猴头菇晒干后，经粉碎、过筛，热水浸提，得到猴头菇多糖粗提液；
（2）将猴头菇多糖粗提液真空浓缩后，经Sevage试剂脱蛋白、大孔树脂脱色，再经蒸馏水透析，冷冻干燥，得到粗多糖；
（3）得到的粗多糖经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析纯化后，依次经蒸馏水、NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，真空浓缩，得到收集液；
（4）再将收集液经蒸馏水透析，冷冻干燥，得到所述猴头菇抗过敏活性多糖。
2.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述过筛是过80目筛；所述热水浸提为：将过筛得到的粉末与蒸馏水按料液比1:20~1:30g/mL混合后，于75~85℃水浴加热5~6h，3000~4000r/min离心20~30min收集提取液。
3.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脱蛋白为：将真空浓缩后的猴头菇多糖粗提液与Sevage试剂按体积比2:1~4:1的比例混合后，3000~4000r/min离心10~20min，再真空旋转蒸发去除Sevage试剂；所述脱蛋白的次数为5~8次。
4.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大孔树脂为D315大孔树脂；所述脱色为：将脱蛋白后的猴头菇多糖粗提液与大孔树脂按体积比10:2~10:4的比例混合后，搅拌5~7h，过滤。
5.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述蒸馏水透析为：将脱色后的猴头菇多糖粗提液转移至3000~5000Da透析袋中，蒸馏水透析40~48小时，且每6~8小时换一次蒸馏水；所述冷冻干燥是在-20℃预冻8~12小时，在温度-45~-40℃的冷阱中冷冻干燥38~42小时。
6.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，所述DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析纯化为：将粗多糖用蒸馏水配制成25~50mg/mL溶液，经6000~8000r/min离心10~20min，得到的上清液用DEAE Sepharose FastFlow离子交换柱层析。
7.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，所述蒸馏水洗脱为：1~2mL/min的流速，每管3~5min自动收集，苯酚硫酸法跟踪检测，至吸光度为0。
8.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，所述NaCl溶液的浓度为0.1~0.2M；所述NaCl溶液洗脱方法与蒸馏水洗脱方法相同，收集洗脱液为NaCl溶液洗脱条件下，苯酚硫酸法跟踪检测的洗脱曲线中的吸收峰对应的收集液。
9.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（4）中，所述蒸馏水透析为：将收集液转移至6000~8000Da透析袋中，蒸馏水透析40~48小时，每6~8个小时换一次蒸馏水；所述冷冻干燥是在-20℃预冻8~12小时，在温度-45~-40℃的冷阱中冷冻干燥38~42小时。
10.根据权利要求1所述的一种猴头菇抗过敏活性多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）、（3）中，所述真空浓缩为浓缩至固形物含量为10~16%。
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