CN102643359A - 一种猴头菌多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猴头菌多糖及其制备方法。该猴头菌多糖是采用先水提醇沉，然后用大孔树脂进行脱色的方法制备得到。本发明得到的猴头菌多糖保留率达到75%以上，并且该猴头菌多糖的免疫活性高。

Description

一种猴头菌多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌提取及深加工领域，具体地说涉及一种猴头菌多糖及其制备方法。

背景技术

猴头菌（Hericium erinaceus）隶属于真菌门、担子菌亚门、猴头菌科、猴菇菌属，是著名的药食两用菌，早在1200年前我国人民就将其列为“山珍”，与熊掌、海参、鱼翅并架齐驱，有“山珍猴头，美味燕窝”之说。猴头菌多糖是猴头菌中最重要的活性成份之一，具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖，抗凝血，抗血栓、抗突变和抗衰老等。猴头多糖具有很强的免疫调节作用，它对由ConA诱导的T－淋巴细胞有增殖作用，促进脾脏淋巴细胞的增殖，对脂多糖（LPS）刺激的B淋巴细胞也有协同作用；此外，猴头菌多糖对胃肠粘膜具有保护及损伤修复作用。

目前常用的提取猴头菌中多糖的方法主要是常规的水提醇沉，但是这样得到的猴头菌多糖中含有大量的色素，色素的存在不仅影响多糖色泽，且使粗多糖易吸潮；同时影响多糖的纯度及其生物活性，对产品开发带来不利影响。

发明内容

本发明首先提供了一种猴头菌多糖，其是用如下方法制备得到的：

①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；

②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。

其中所述的脱色为静态脱色，或为动态脱色。

其中静态脱色是将粗多糖水溶液中直接加入大孔树脂D315，室温下，粗多糖浓度为13.9 mg/ml ，pH为4，摇床120rpm，脱色6h，即可；

其中动态脱色是采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为3.5×60cm，浓度为13.9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟，上清用盐酸调pH至4.00，流速为0.6BV/h，上样量为3.7 g多糖/100 ml树脂。

该树脂动态脱色完成后，用1L 1mol/L的NaCl冲洗柱子，可连续上样八次以上。

本发明使用的大孔弱碱性阴离子交换树脂为：丙烯酸-二乙烯苯共聚体骨架，功能基团为≡N，具体是购自上海华震科技有限公司的D315树脂。

所述的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315在进行脱色前，最好先进行下述步骤的预处理：先用蒸馏水清洗至无泡沫，无浑浊，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时，然后倒出酸液，用蒸馏水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。

脱色后的猴头菌粗多糖水溶液，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最终得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。

本发明还提供了制备上述猴头菌多糖的方法，该方法包括如下步骤：  

①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；

     ②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。

本发明提供的经过脱色的猴头菌多糖，制备方法简便、适用于大规模生产。脱色率可达到70%以上，多糖保留率达到75%以上，并且该猴头菌多糖的免疫活性显著提高，优于未脱色的猴头菌多糖和其他方法脱色的猴头菌多糖。

具体实施方式

实施例1 水提醇沉法制备猴头菌粗多糖

将猴头菌子实体用粉碎机粉碎成颗粒，按照液料比15：1（体积升比重量公斤）加入相应体积的蒸馏水，加热煮沸持续2h，之后用滤布（100目）过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次后过滤，合并两次提取的滤液。滤液按浓缩比1：1浓缩后，70%乙醇沉淀，弃上清，沉淀溶于水，喷雾干燥最终得到猴头菌粗多糖干品。

实施例2体外刺激巨噬细胞生成NO实验

   将实施例1制备得到的猴头菌粗多糖干品配制成10mg/ml的粗多糖水溶液，然后分别进行如下三种方法脱色。

①双氧水脱色：粗多糖溶液浓度为10mg/ml，用氨水调pH至8.0，加入3%的30%的双氧水，60 ℃水浴180分钟，调pH至7.0, 取样。 

②D315树脂脱色：粗多糖溶液浓度为10mg/ml,体积为100ml,加入20ml的大孔树脂，摇床中120rpm,  25 ℃, 9小时，取样。 

双氧水脱色、D315树脂脱色及未脱色粗多糖溶液于分子截流量为3500的透析袋透析除去小分子。

将脱色后的猴头菌多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于-20℃冷冻12h，然后置于-80摄氏度冷冻12h，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到脱色的猴头菌多糖。

供试样品的配制

精确称取以上得到的猴头菌多糖样品于灭过菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成25、50、100μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为10μg/mL LPS溶液。

小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备

用DMEM培养基在37℃、5% CO₂条件下传代培养后，用0.05%胰蛋白酶消化，混悬液300×g离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。

巨噬细胞释放NO活性的测定

由于NO极不稳定，在体内很快生成亚硝酸基（NO₂-）和硝酸基（NO₃-），故采用Griess法测定样品中的NO₂- /NO₃-作为衡量NO水平的指标。

（1）用亚硝酸钠制标准曲线：

配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μM共11个；取100μL于96孔板，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线。

（2）NO产量测定

吸掉巨噬细胞的培养液，加PBS 2 ml，震荡再吸掉。用0.05%胰酶或5% EDTA溶液在培养箱37℃中3-5min消化巨噬细胞。消化完毕，加入1mL DMEM完全培养基+胎牛血清终止反应，离心，吸掉消化液，加入1mL无色RPMI1640(10%胎牛血清+1%抗生素液体)，计数。用无色RPMI1640培养基将细胞稀释至5×10⁵/ml，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待测样品， 37℃培养48h。取100μL上清于96孔板，加入50μLGriess试剂，显色10min后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量。

实验结果

双氧水脱色猴头多糖与未脱色猴头多糖测定的巨噬细胞中NO的含量（单位：μmoL/5.0×10⁸cells）分别为： 17.30 、7.95 （样品浓度25μg/mL）；23.61 、12.60（样品浓度50μg/mL）；13.49 、15.71（样品浓度100μg/mL）。可以看出，实施例2中的双氧水脱色猴头菌多糖与实施例1中的相比，刺激巨噬细胞产生NO的活性降低。树脂D315脱色猴头菌多糖与未脱色猴头菌多糖测定的巨噬细胞中NO的含量（单位：μmoL/5.0×10⁸cells）分别为： 26.29 、8.64（样品浓度10μg/mL）；34.92、24.70（样品浓度25μg/mL）；42.42 、31.89（样品浓度50μg/mL），可以看出，实施例2中的树脂D315脱色猴头多糖与实施例1中的相比，刺激巨噬细胞产生NO的活性显著增强。

实施例3

将实施例1得到的猴头菌粗多糖配制成10mg/ml的水溶液。

取HZ202，JK206，335，D315，D303(购自上海华震科技有限公司)，脱色一号(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)六种大孔树脂各20ml，和100ml 10mg/ml离心后的猴头多糖（4000rpm,30min）溶液混和，迅速摇匀后取样，为初样，将三角瓶放到摇床中，温度设为25℃，120rpm。 

吸附9小时，用滤布过滤，100ml蒸馏水清洗，过滤，再用50ml蒸馏水清洗，过滤，合并滤液，旋蒸仪浓缩，定容至100ml，取50ml冻干，另50ml透析。测多糖含量，算出得率。

体外刺激巨噬细胞生成NO实验的操作方法同实施例2。

体外刺激淋巴细胞增殖实验的操作步骤如下：

供试样品的配制

精确称取多糖样品（实施例1、实施例2中得到的猴头多糖）于灭过菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度10 mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成200、500、1000μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为60μg/mL PHA溶液。

小鼠脾淋巴细胞的制备

小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎后的混悬液以400×g离心6 min，吸去上清液，加入浓度为0.83％氯化氨溶液裂解红细胞，反复冲打，静置10 min后400×g离心6 min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查活力在95%以上。用RPMI1640将细胞稀释成2×10⁶个/mL，加入96孔细胞培养板中，在37℃、5%的CO₂下培养。

淋巴细胞增殖率的测定

将180 μL每mL含2×10⁶个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中，同时加入20 μL样品，于37℃、含5%的CO₂条件下培养3 d，用酶标仪测定其570 nm和600 nm处的吸光度，然后加入20 μL Alamar Blue试剂，再培养，变色后再测定570 nm和600 nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响。

计算公式：

淋巴细胞增殖率(%)=[117216×A_l570(sample)-80586×A_l600(sample)]

/[117216×A_l570(control)-80586×A_l600(control)]×100%

实验结果

六种大孔树脂HZ202、JK206、335、D315、D303、脱色一号脱色后猴头菌多糖测定的巨噬细胞中NO的含量（单位：μmoL/5.0×10⁸cells）分别为：18.46、12.77 、22.77、26.59、27.24、23.18（样品浓度25μg/mL）；24.32、18.71 、27.00、31.63、26.59、26.67（50μg/mL）；30.01、22.53 、34.15、37.89、35.86、33.83（100μg/mL）。可以看出，各树脂脱色猴头多糖相比，D315刺激巨噬细胞产生NO的活性最高。

五种大孔树脂HZ202，335，D315，D303，脱色一号脱色后猴头多糖测定的淋巴细胞增值率（%）分别为： 230%，226%，234%，271%，251%（样品浓度50μg/mL）；239%，261%，251%，265%，308%（100μg/mL）；204%，250%，273%，266%，247%（200μg/mL）。各树脂脱色后的猴头菌多糖相比，D315，D303，脱色一号脱色后猴头多糖都具有较好的刺激淋巴细胞增殖的活性。

实施例4 

实施例1的猴头粗多糖干品配成13.8mg/ml的猴头菌粗多糖溶液，离心除去沉淀部分。

大孔弱碱性阴离子交换树脂D315的预处理：

先用蒸馏水清洗至无泡沫，无浑浊，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至中性。接着将树脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小时，然后倒出酸液，用蒸馏水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小时，然后倒出碱液，用蒸馏水漂洗至弱碱性备用。

100mL 13.85mg/ml的猴头菌粗多糖水溶液加入37mL已预处理好的大孔弱碱性阴离子交换树脂D315，于250mL三角烧瓶中，置于摇床中震荡，120rpm，25℃、pH4.0条件下脱色6h，然后用滤布（100目）过滤，收集脱色后的猴头菌多糖水溶液，进行脱色的测定以及多糖保留率的测定。

猴头菌多糖水溶液，稀释100倍后用苯酚硫酸法在490nm下测定脱色前后多糖含量，在450nm下测定脱色前后色素含量。

计算公式：

结果：脱色率达到69.35%，多糖保留率达到80.16%。

3. 冷冻干燥

将脱色后的猴头粗多糖水溶液用旋转蒸发仪浓缩后先放置于-20℃冷冻12h，然后置于-80摄氏度冷冻12h，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到颜色较浅的猴头菌多糖。

实施例5 

实施例1的猴头粗多糖干品配成13.9mg/ml的猴头菌粗多糖溶液，离心除去沉淀部分。

阴离子交换树脂D315的预处理（树脂预处理方法同实施例4）

取100ml预处理好的大孔树脂D315，采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为3.5×60cm，配置浓度为13.9 mg/ml的粗多糖，4000rpm离心30分钟，取上清，用盐酸调PH至4.00，流速为0.6BV/h，上样量为3.7g多糖/100ml树脂，该树脂脱色完成后，用1L 1mol/L的NaCl冲洗柱子，可连续上样八次以上。脱色后的猴头菌多糖水溶液，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最终可得到颜色较浅的猴头菌多糖产品。

测定其多糖含量和色素，与实施例1的相比，计算得到其脱色率为75.7%，多糖保留率为77.8%。 

Claims (4)

1.一种猴头菌多糖，其特征在于其是用如下方法制备得到的：

①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；

②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。

2.根据权利要求1所述的猴头菌多糖，其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为：

 将粗多糖水溶液中加入大孔树脂D315，室温下，pH为4，摇床120rpm，脱色6h，即可。

3.根据权利要求1所述的猴头菌多糖，其特征在于步骤②中所述的脱色的方法为：

     采用湿法装柱的方式装柱，层析柱规格为3.5×60cm，浓度为13.9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm离心30分钟，上清用盐酸调pH至4.00，流速为0.6BV/h，上样量为3.7 g多糖/100 ml树脂。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述猴头菌多糖的方法，其特征在于包括如下步骤：

①水提醇沉的方法提取猴头菌，干燥后得到粗多糖；

②将猴头菌粗多糖水溶液加入大孔树脂D315，进行脱色，干燥后得到猴头菌多糖。