CN106349400A - 一种联合应用大孔树脂制备猴头菇纯化多糖的新方法 - Google Patents

一种联合应用大孔树脂制备猴头菇纯化多糖的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用弱碱及弱酸性离子交换大孔树脂联合应用制备猴头菇纯化多糖的新方法。该方法先采用热水浸提醇沉制备粗多糖，再将该粗多糖分别经D301及D113大孔树脂进行洗脱得到猴头菇纯化多糖。经本发明方法得到的猴头菇纯化多糖，多糖保留率高达75％、蛋白含量降低20％、脱色率达70％，该方法提取效率高、操作简单、经济环保更适合工业生产。

Description

一种联合应用大孔树脂制备猴头菇纯化多糖的新方法
技术领域
本发明涉及一种制备纯化猴头菇多糖的新方法，具体涉及一种利用弱碱及弱酸性大孔树脂联合应用制备纯化猴头菇多糖的新方法，属于医药技术及食品领域。
背景技术
猴头菇(学名：Hericium erinaceus)，又叫猴头菌，猴头蘑，因其外形酷似猴头而得名。猴头菇隶属于担子菌门、猴头菌科，是“药食同源”的名贵菌类。早在100多年前，猴头菇的药用价值就已经被许多经典医药专著记载：猴头菇能“助消化，利五脏”。猴头菇的营养成分很高，干品中每百克含蛋白质26.3克，是香菇的二倍。它含有氨基酸多达17种，其中人体所需的占8种。每百克猴头含脂肪4.2克，是名副其实的高蛋白、低脂肪食品，另外还富含各种维生素和无机盐。猴头菇有增进食欲，增强胃粘膜屏障机能，提高淋巴细胞转化率，提升白细胞等作用。故可以使人体提高对疾病的免疫能力。猴头还是良好的滋补食品，对神经衰弱、消化道溃疡有良好疗效。在抗癌药物筛选中，发现猴头菇多糖对皮肤、肌肉癌肿有明显抗癌功效。已报道的猴头菇的活性物质中研究最多的、最引起人们注意的是多糖类物质。在国际上，真菌多糖被称为“生物反应调节物”，简称“BRM”，具有广泛的药理作用，如调节免疫功能、抗肿瘤、抗氧化、抗溃疡、抗细菌、抗病毒和抗凝聚的作用，提高肝功能和解毒力，提高动物耐缺氧能力和氧的利用率，降低血液的粘稠度，增加心肌收缩力，改善心律，降血糖、镇静、镇痛、平喘、止咳、化痰等功效。真菌多糖功效虽然十分显著，被誉为21世纪的健康卫士，但我国国内大众对真菌多糖这一新物质还非常陌生，大众还不知道什么是真菌多糖，它有什么功效，存在于什么地方，不少人还末听说过这一名词。即便是医务工作者，也有不少还不知道真菌多糖的详细功效，因而未能充分发挥真菌多糖的作用。同时，多糖类化合物具有较好的生物相容性，特别是口服时，基本无毒副作用。近年来很多药学工作者致力学多糖的应用研究，真菌多糖已经成为在药品和保健食品研究开发领域重要的原料。
传统的水提醇沉得到的多糖类成分多含有大量蛋白类、色素类杂质，经过凝胶色谱柱、中空纤维柱及透析膜的方法虽然能纯化多糖，纯化效果并不理想且不适用于工业大生产。单独使用阴离子或阳离子交换树脂的方法进行脱色、纯化猴头多糖也有研究报导，但在实验步骤中单独使用一种离子交换树脂后均需使用大量的酸或碱调节PH值进行中和，产生大量的无机盐,需要增加除盐的步骤,明显增加成本和操作时间(蒋俊,杨焱,罗玺,等.猴头菌多糖不同脱色方法的研究,天然产物研究与开发,2013,25(9):1180-1184).经检索猴头菇多糖纯化方法中未见联合使用阴阳两种树脂的的相关专利，其相关多糖类物质纯化的专利也均为使用单一大孔树脂，其实施过程中也均有调节PH值及除盐。联合使用阴离子及阳离子大孔树脂柱的方法不仅省去了中和步骤减少环境污染、减少除盐步骤，并且所得到的多糖提取率及脱色率大提高。
本发明以猴头菇为原料，从中提取分离出纯化猴头菇多糖。经本发明方法得到的纯化猴头菇多糖，多糖保留率高达75％、蛋白含量降低20％、脱色率达70％，该方法提取效率高、操作简单、经济环保更适合工业生产。在本发明之前，尚未见有关联合使用阴阳离子大孔树脂柱纯化猴头菇多糖的研究报道。
发明内容
本发明专利的目的是提供一种适用于工业生产，提取效率高、操作简单、经济环保地从猴头菇中制备纯化猴头菇多糖的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一、纯化猴头菇多糖的制备方法
(1)将猴头菇子实体破碎，加水浸提，过滤，滤液浓缩，用乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖加水溶解，加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入水进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
更优选地，本发明方法还可以是：
(1)将猴头菇子实体破碎至直径为0.5-1cm,加6-10倍量水，70-90℃浸提4-8小时，过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次浸提的滤液；浓缩，用70-80％乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖按0.1-0.3g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
最优选地，本发明方法还可以是：
(1)将猴头菇子实体破碎至直径为0.5-1cm,加8倍量水，80℃浸提6小时，过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次浸提的滤液；浓缩，用75％乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖按0.2g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为20：1的比例加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液按树脂与粗多糖溶液体积比为20：1的比例加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
进一步地，浸提前必须将猴头菇破碎至直径为0.5至1cm。
进一步地，于必须用大孔树脂进行纯化。
进一步地，所使用的大孔树脂为D301阴离子及D113阳离子的联合使用。
进一步地，减压浓缩的温度为60-70℃。
二、纯化猴头菇多糖的测定
1、猴头菇多糖理化性质研究试验
(1)总糖含量测定
采用苯酚-硫酸法。将葡萄糖配制成0.1mg/mL的标准液，分别吸取1、2、3、4、5ml置于10ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。从中吸取出1ml，分别加1ml苯酚，5ml浓硫酸，置于10ml试管中，涡旋混匀，水浴40℃，加热30min，冰浴冷却后于波长488nm处测定吸光度。以葡萄糖标准液浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。按照标准曲线测定方法操作，测定吸光度，并计算总糖含量。结果见表1。
(2)蛋白质含量测定
采用BCA法。精密吸取解冻后的牛血清白蛋白标准品溶液10μl加蒸馏水90μl，配制成浓度为0.5mg/ml的标准品溶液，称取ES和EP样品10.0mg加10.0mL蒸馏水配成1.0mg/mL样品溶液。将试剂A与试剂B按照50:1的比例，配制成适量的BCA工作液，使其充分混匀。将BSA对照品按0μl,1μl,2μl,4μl,8μl,12μl,16μl,20μl分别加入到96孔板中，加蒸馏水补足至20μl。样品分别取12μl和16μl加入到96孔板中，加蒸馏水补足至20ul。各孔中均加入200μlBCA工作液，充分震荡，在恒温培养箱37℃孵育30min，在酶标仪590nm波长处测定吸光值，绘制标准曲线。根据标准曲线和样品的吸光值计算出样品中的蛋白质含量。结果见表1。
(3)脱色率的测定
配制浓度为1％的粗多糖溶液,对其进行可见紫外全波长扫描，结果表明，该溶液无最大吸收波长。根据互补色原理可知,溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色，由于多糖溶液脱色前后稀释后均为橙黄色,所以溶液主要吸收蓝色波段可见光。因此选择处于该波段中心的450nm波长为检测波长，测定溶液的吸光度。并按下式计算脱色率。结果见表1。
脱色率％＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)/脱色前吸光度×100％
表1不同提取方法制备的猴头菇多糖蛋白、总糖含量及脱色率的测定测定
单独使用D301大孔树脂样品制备：
将猴头菇粗多糖按0.1-0.3g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液,冷冻干燥,得到该样品。
单独使用D113大孔树脂样品制备:
将猴头菇粗多糖按0.1-0.3g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液,冷冻干燥,得到该样品。
猴头菇粗多糖样品制备：
将猴头菇子实体破碎，加水浸提，过滤，滤液浓缩，用乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖。
由表1可知，实施例1-3产品总糖含量比水提醇沉、单独使用D301及D113大孔树脂均有所提高，蛋白含量比水提醇沉、单独使用D301及D113大孔树脂均有所降低，并且脱色率也明显高于水提醇沉、单独使用D301及D113大孔树脂的方法。
3、结论
由以上结果可知，与传统水提醇沉方法及单独使用一种大孔树脂的纯化方法相比较，使用本专利方法所制备的猴头菇多糖，其多糖含量及脱色率明显提高，蛋白含量明显降低，具有较好的开发相关药品、保健食品及食品的潜力。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
称取干燥猴头菇100kg破碎至1cm以下，投入提取罐中，加8倍量水，80℃水浸提6小时，过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次浸提的滤液；滤液浓缩后，用75％乙醇沉淀，收集沉淀，得猴头菇粗多糖；将该沉淀按0.2g/ml浓度加水溶解，溶液加入D301阴离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝20：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，的收集洗脱液，将洗脱液加入D113阳离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝20：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖，其多糖含量为62.3％。
实施例2
猴头菇粗多糖制备同实施例1。将该沉淀按0.3g/ml浓度加水溶解，溶液加入D301阴离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝15：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液加入D113阳离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝20：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖，其多糖含量为68.5％。
实施例3
猴头菇粗多糖制备同实施例1。将该沉淀按0.3g/ml浓度加水溶解，溶液加入D301阴离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝20：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液加入D113阳离子大孔吸附树脂中(树脂：粗多糖溶液＝20：1V/V)，再加入与树脂柱体积相同水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖，其多糖含量为70.1％。

Claims (7)

1.一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于该方法为：
(1)将猴头菇子实体破碎，加水浸提，过滤，滤液浓缩，用乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖加水溶解，加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入水进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
2.根据权利要求1所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于该方法为：
(1)将猴头菇子实体破碎至直径为0.5-1cm,加6-10倍量水，70-90℃浸提4-8小时，过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次浸提的滤液；浓缩，用70-80％乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖按0.1-0.3g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液按树脂与粗多糖溶液体积比为10-30：1的比例加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
3.根据权利要求2所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于该方法为：
(1)将猴头菇子实体破碎至直径为0.5-1cm,加8倍量水，80℃浸提6小时，过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次，合并两次浸提的滤液；浓缩，用75％乙醇沉淀，收集沉淀得到猴头菇粗多糖；
(2)将猴头菇粗多糖按0.2g/ml浓度加水溶解，溶液按树脂与粗多糖溶液体积比为20∶1的比例加入到D301阴离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液按树脂与粗多糖溶液体积比为20∶1的比例加入到D113阳离子大孔吸附树脂柱中，再加入与树脂柱体积相同量的水进行洗脱，收集洗脱液，60-70℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥后，得猴头菇纯化多糖。
4.根据权利要求1所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于浸提前必须将猴头菇破碎至直径为0.5至1cm。
5.根据权利要求1所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于必须用大孔树脂进行纯化。
6.根据权利要求1所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于所使用的大孔树脂为D301阴离子及D113阳离子的联合使用。
7.根据权利要求1所述的一种制备纯化猴头菇多糖的方法，其特征在于减压浓缩的温度为60-70℃。
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