CN106478829A - 一种猴头菌活性多糖及其制备方法 - Google Patents

一种猴头菌活性多糖及其制备方法 Download PDF

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李彩金
吴迪
刘艳芳
张劲松
周帅
张忠
冯杰
汪雯翰
唐庆九
唐传红
颜梦秋
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass

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Abstract

本发明提供了一种猴头菌活性多糖及其制备方法，将猴头菌多糖进行原料预处理，然后进行超声降解，最后冷冻干燥即得到所需的猴头菌活性多糖。本发明制备得到的猴头菌活性多糖分子量在20‑50万道尔顿，可明显促进RAW264.7巨噬细胞株释放NO，体外免疫活性增加。

Description

一种猴头菌活性多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及食药用真菌大分子多糖降解领域，具体的说是涉及一种猴头菌活性多糖及其制备方法。
背景技术
猴头菌是一种著名的药膳两用食用菌，因其子实体形状像猴子头部而得名。猴头菌多糖作为猴头菌中最主要的活性成分之一，因具有抗溃疡、抗炎症、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、降血脂、增加心肌血液输出量，加速肌体血液循环、提高免疫力等药理功效。但是该猴头菌多糖具有较大的特性粘度，特性粘度为1231.99mL/g，是目前所发现真菌类水溶性多糖中粘度较高的一种。而该多糖的特性粘度也成为影响猴头菌多糖水溶性和生物活性的重要因素，如何解决这个问题，是目前研究猴头菌多糖领域的重要课题。
发明内容
本发明首先提供了一种猴头菌活性多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：将猴头菌多糖与水配成猴头菌多糖水溶液；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下经超声处理后即为所需的猴头菌活性多糖溶液；其中超声时猴头菌多糖溶液浓度为0.1—3g/L；超声时间为10-50min；超声作用强度为158.8-370.5W/cm2；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖；
其中所述的猴头菌多糖是将猴头菌子实体进行热水提取的方法得到的，分子量为239万道尔顿；
具体的说所述的猴头菌多糖是通过如下方法制备得到的：
取猴头菌子实体鲜品1000g，加入2倍体积的蒸馏水，100℃提取2h，提取2次，合并提取液，浓缩到可溶性固形物含量5°Brix，15317×g离心15min，上清液在4℃静置12h，15317×g离心15min，收集沉淀；沉淀用20％(v/v)的乙醇洗涤4-5次，离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，冻干，获得猴头菌多糖；该猴头菌多糖的分子量为239万道尔顿。
本发明的制备猴头菌活性多糖的方法操作简便，猴头菌多糖分子量可以从239万道尔顿降解到20-50万道尔顿，且降解后的猴头菌多糖粘度小，溶解性好，对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用，体外免疫活性好。
具体实施方式
猴头菌多糖的制备
本发明使用的猴头菌由上海市农业科学院食用菌所(上海国森生物科技有限公司栽培,菌株编号:H0605)提供；
本发明使用的透析袋购于国药集团化学试剂有限公司；
本发明所使用的超声仪型号为VCX1500购于SONICS公司。
取成熟期猴头菌子实体鲜品1000g，加入2倍体积的蒸馏水，100℃提取2h，提取2次，合并提取液，浓缩到可溶性固形物含量5°Brix，15317×g离心15min，上清液在4℃静置12h，15317×g离心15min，收集沉淀。沉淀用20％(v/v)的乙醇洗涤4-5次，离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，冻干，获得猴头菌多糖，该猴头菌多糖的分子量为239万道尔顿。将应用到下列实施例1-4中用于制备猴头菌活性多糖。
实施例1
(1)原料预处理：先将猴头菌多糖用蒸馏水配成3g/L浓度的水溶液，进行充分溶解；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下，超声作用强度为264.7W/cm2，超声时间为10min，对猴头菌多糖溶液进行超声处理，即得猴头菌活性多糖溶液；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液用3500Da的透析袋流动蒸馏水透析72h进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖。
分子量测定：采用HPSEC-MALLS-RI联用分析多糖分子量分布
仪器：Waters e2695高效液相(2414示差折光检测器、DAWN8+激光检测器)；色谱柱：TSK PWXL6000和TSK PWXL4000串联；条件设置：流速0.5mL/min，色谱柱温用柱温箱恒定在35℃，激光检测器光源波长选用623.8nm，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算，普鲁兰shodex standard p-82为标准品(Shodex,Japan)。样品制备及处理：样品置于流动相中，配成3mg/mL的溶液并经0.22μm的水相微孔膜过滤后供进样分析。经测定猴头菌活性多糖的分子量为46.61万道尔顿。
实施例2
(1)原料预处理：先将猴头菌多糖用蒸馏水配置成1g/L的多糖溶液，进行充分溶解；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下设定超声作用强度为264.7W/cm2，超声处理30min，即得猴头菌活性多糖溶液；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖。
分子量测定：方法同上
经测定猴头菌活性多糖分子量为33.38万道尔顿。
实施例3
(1)原料预处理：先将猴头菌多糖用蒸馏水配置成1.5g/L的多糖溶液，进行充分溶解；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下设定超声作用时间为30min，超声作用强度为264.7W/cm2对猴头菌多糖溶液进行超声处理，即得降解的猴头菌活性多糖溶液；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖。
分子量测定：方法同上
经测定猴头菌活性多糖的分子量为28.22万道尔顿。
实施例4
(1)原料预处理：先将猴头菌多糖用蒸馏水配置成1g/L的多糖溶液，进行充分溶胀；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下设定超声作用时间为30min，超声作用强度为370.5W/cm2对猴头菌多糖溶液进行超声处理，即得猴头菌活性多糖溶液；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖。
分子量测定：方法同上
经测定猴头菌活性多糖的分子量为23.33万道尔顿。
体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定
实施例5
供试样品的配制：称取实施例1-4中制备得到的猴头菌活性多糖于灭菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配置成浓度5mg/mL的溶液。充分溶解后以15000r/min离心30min，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品终浓度稀释至500、200、50μg/ml待用。
小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株(购自中科院细胞所)，用DMEM完全培养基(购自Gibco公司)在37℃、含5％CO2条件下传代培养，用0.05％胰酶消化，混悬液于1000rpm/min离心3min后收集细胞，计数备用。
试剂配制及标准曲线绘制
Griess试剂的配制：在烧杯中加入6.25ml H3PO3，加入蒸馏水250ml，分别加入2.5g的sulfanilamide(4-氨基苯磺酰胺，Sigma公司)和0.25g的naphthylethylenediaminedihydrochloride(盐酸萘乙二胺，Sigma公司)用磁力搅拌器搅拌至全部溶解，置于棕色试剂瓶4℃保存。
标准曲线绘制：配制不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九个；取100μL于96孔板孔，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。
样品刺激巨噬细胞释放NO量的测定：收集RAW264.7细胞，用无色RPMI1640培养基(含10％胎牛血清+1％抗生素液体)将细胞稀释至5×105/mL，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待测样品，使得样品终浓度依次为500μg/ml，200μg/ml和50μg/ml，阳性对照为LPS(终浓度为1μg/mL)，阴性对照为PBS，于37℃、含5％的CO2培养箱中培养48小时后，取100μL上清于96孔板孔，加入50μl Griess试剂，室温孵浴10min，测定543nm吸光值。根据标准曲线计算细胞NO的释放量。
实验结果：
实施例1-4中制备的猴头菌活性多糖，其刺激巨噬细胞产生NO(单位：μmoL/5.0×105cells)的量如表1所示。
表1猴头菌活性多糖在不同浓度下刺激巨噬细胞产生NO的量
由表1可知，猴头菌活性多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用，且分子量分布为28.22万道尔顿的活性提高最为明显，体外免疫活性显著增强。

Claims (2)

1.一种猴头菌活性多糖的制备方法，其特征在于,该方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：将猴头菌多糖与水配成猴头菌多糖水溶液；
(2)超声降解：将步骤(1)中的猴头菌多糖水溶液在冰浴条件下经超声处理后即为所需的猴头菌活性多糖溶液；其中超声时猴头菌多糖溶液浓度为0.1—3g/L；超声时间为10-50min；超声作用强度为158.8-370.5W/cm2；
(3)冷冻干燥：将步骤(2)中的猴头菌活性多糖溶液进行透析，冷冻干燥，即得猴头菌活性多糖；
其中所述的猴头菌多糖是将猴头菌子实体进行热水提取的方法得到的。
2.权利要求1所述的制备方法制备得到的猴头菌活性多糖。
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