CN109369820A

CN109369820A - 一种从巨藻中提取海藻多糖的方法

Info

Publication number: CN109369820A
Application number: CN201811426310.4A
Authority: CN
Inventors: 邹平; 周金辉; 鲁雪莉; 袁源; 张成省; 李义强
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109369820B

Abstract

本发明提供了一种从巨藻中提取海藻多糖的方法，属于藻类活性成分提取技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取10～30h，收集固相组分，干燥获得脱色脱杂巨藻粉；2)将步骤1)中所述的脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液混合，95～105℃提取1～3h后，过滤获得上清液；3)将步骤2)中所述上清液与CaCl₂混合3～5℃静置10～14h后，透析、浓缩获得浓缩液；4)将步骤3)中所述浓缩液与乙醇混合醇沉收集沉淀、干燥获得粗多糖；5)将步骤4)中获得的粗多糖依次过DEAE‑52纤维素柱和sephadex G‑100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。本发明所述方法提取率高，获得的海藻多糖纯度高。

Description

一种从巨藻中提取海藻多糖的方法

技术领域

本发明属于藻类活性成分提取技术领域，尤其涉及一种从巨藻中提取海藻多糖的方法。

背景技术

巨藻属于褐藻类，是藻类王国中最长的一族，是海洋中体型最大的藻类。巨藻的藻体褐色，革质，多年生，寿命最长可达12年。大多数巨藻可以长到几十米，最长的甚至可以达到200米到300米，重达200公斤。靠1米多长的固着器将藻体固定在礁石上。巨藻的中心是一条主干，上面生长着100多个树枝一样的小柄，柄上生有小叶片，有的叶片长达1米多，宽度达到了6厘米到17厘米宽。巨藻多分布于潮间带及以下150米范围内，是重要的经济海藻，富含褐藻胶、岩藻多糖、岩藻黄素、海藻有机碘等活性成分，具有多种生理功能。巨藻Lessonianigrescens生长在南美太平洋沿岸，生长环境适宜，生物量巨大，是一种重要的海藻资源。巨藻中含有的褐藻多糖是其主要活性物质之一，其具有免疫调节活性、促细胞增殖活性和抗氧化活性等众多特点，在食品及工业领域已有广泛应用。

目前，国内外提取海藻粗多糖主要采用稀碱与热水抽提的方法。其优点是工艺简单、操作方便、成本低，缺点是提取率较低、活性损失大、纯度低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从巨藻中提取海藻多糖的方法，所述方法提取率高，获得的海藻多糖纯度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种从巨藻中提取海藻多糖的方法，包括以下步骤：1)将巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取10～30h，收集固相组分，干燥获得脱色脱杂巨藻粉；2)将步骤1)中所述的脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液混合，95～105℃提取1～3h后，过滤获得上清液；3)将步骤2)中所述上清液与CaCl₂混合3～5℃静置10～14h后，透析、浓缩获得浓缩液；4)将步骤3)中所述浓缩液与乙醇混合醇沉收集沉淀、干燥获得粗多糖；5)将步骤4)中获得的粗多糖依次过DEAE-52纤维素柱和sephadex G-100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。

优选的，步骤1)中所述乙醇水溶液的体积浓度为90～97％。

优选的，步骤1)中所述巨藻粉和乙醇水溶液的质量体积比为(100～200)g:(1000～2000)ml。

优选的，步骤1)中所述干燥的温度为50～70℃，所述干燥的时间为4～8h；所述干燥后脱色脱杂巨藻粉的含水量为0.40～0.55％。

优选的，步骤2)中所述盐酸溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，所述脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液质量体积比为1g:(25～35)ml。

优选的，步骤2)中所述过滤为硅藻土过滤。

优选的，步骤3)中所述透析用透析膜的截留分子量为3500Da。

优选的，步骤3)中所述透析的总时间为20～30h，每5～7h换水一次。

优选的，步骤4)中所述浓缩液与乙醇的体积比为1：(3～6)。

优选的，步骤4)中所述的干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-85～-75℃，所述冷冻干燥的时间为45～55h。

本发明的有益效果：本发明提供的从巨藻中提取海藻多糖的方法，乙醇脱色脱杂后，用盐酸溶液高温浸提，再利用CaCl₂去除海藻酸，浓缩液醇沉后，过DEAE-52纤维素柱和sephadex G-100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。本发明所述方法提取率高，得率为9～12％；获得的海藻多糖的纯度高，纯度为84％以上。本发明所述海藻多糖的提取方法提取获得的海藻多糖，诱导植物抗盐活性强，能够提高植物对盐胁迫的综合抵抗力，保证植物正常生长发育，可以作为植物抗盐调节剂。

附图说明

图1为本发明实施例1中从巨藻中提取海藻多糖的制备方法的流程示意图；

图2为植物抗盐调节剂B、D、F中处理组及对照组处理植物中丙二醛含量测定结果；

图3为植物抗盐调节剂B、D、F中处理组及对照组处理植物的根茎叶中Na⁺含量、K⁺含量以及Na⁺/K⁺。

具体实施方式

本发明提供了一种从巨藻中提取海藻多糖的方法，包括以下步骤：1)将巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取10～30h，收集固相组分，干燥获得脱色脱杂巨藻粉；2)将步骤1)中所述的脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液混合，95～105℃提取1～3h后，过滤获得上清液；3)将步骤2)中所述上清液与CaCl₂混合3～5℃静置10～14h后，透析、浓缩获得浓缩液；4)将步骤3)中所述浓缩液与乙醇水溶液混合醇沉收集沉淀、干燥获得粗多糖；5)将步骤4)中获得的粗多糖依次过DEAE-52纤维素柱和sephadex G-100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。

本发明将巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取10～30h，收集固相组分，干燥获得脱色脱杂巨藻粉。本发明中所述巨藻粉的粒度优选为30～60目，更优选为40目；本发明中所述巨藻粉是将巨藻粉碎过筛后获得，本发明对所述粉碎设备没有特殊要求，采用本领域常规粉碎设备即可。本发明中所述巨藻的产地优选为智利。本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为90～97％，更优选为93～96％，最优选为95％。本发明将所述巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取，所述巨藻粉和乙醇水溶液的质量体积比优选为(100～200)g:(1000～2000)ml，更优选为(100～150)g:(1000～1500)ml；所述回流提取的时间优选为15～25h，更优选为18～24h；本发明所述回流提取优选的至回流液没有颜色后停止。本发明中所述回流提取的作用为去除色素、蛋白质、盐类等小分子。本发明在所述回流提取后，收集固相组分，所述收集固相组分的方法优选为烘箱干燥。本发明中所述固相组分的干燥温度优选为50～70℃，更优选为55～65℃，最优选为60℃；所述干燥的时间优选为4～8h，更优选为5～7h；本发明所述干燥后脱色脱杂巨藻粉的含水量优选为0.40～0.55％，更优选为0.45～0.52％。

本发明在获得所述脱色脱杂巨藻粉后，将所述的脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液混合，95～105℃提取1～3h后，过滤获得上清液。本发明中，所述脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液盐酸溶液的质量体积比优选为1g:(25～35)ml，更优选为1g:30ml。所述盐酸溶液的浓度优选为0.08～0.12mol/L，更优选为0.1mol/L。本发明中，所述提取的温度优选为98～102℃，更优选为100℃；所述提取的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，最优选为2h。本发明在所述提取后进行过滤，所述过滤的方法优选为硅藻土过滤。

本发明在获得所述上清液后，将所述上清液与CaCl₂混合3～5℃静置10～14h后，透析、浓缩获得浓缩液。本发明中所述CaCl₂的质量优选为所述上清液质量的1.5～2.5％，更优选为2％。本发明中，所述静置的温度优选为4℃，所述静置的时间优选为11～13h，更优选为12h。本发明中，所述CaCl₂的作用为去除海藻酸。本发明在所述静置后，优选的进行离心，所述离心的转速优选为3500～4500rpm，更优选为4000rpm，所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明收集上述离心获得的上清液进行透析；本发明中，所述透析用透析膜的截留分子量优选为3500Da；所述透析的总时间优选为20～30h，更优选为22～26h，最优选为24h；本发明在所述透析过程中，优选的每5～7h换水一次，更优选为每6h换水一次。本发明中所述透析的作用为去除海藻多糖中的盐分及其他小分子杂质。本发明所述透析后收集透析后的液体进行浓缩，本发明中所述浓缩优选为减压旋转浓缩，所述浓缩用的仪器优选为旋蒸仪，本发明对所述减压旋转浓缩的参数没有限定，所述浓缩的体积倍数优选为1/3～1/4倍。

本发明在获得所述浓缩液后，将所述浓缩液与乙醇混合醇沉收集沉淀、干燥获得粗多糖。本发明中，所述浓缩液与乙醇的体积比优选为1：(3～6)，更优选为1:4；所述乙醇为无水乙醇。本发明对所述收集沉淀的方法没有特殊限定，采用本领域常规的离心或过滤均可，本发明干燥所述沉淀获得粗多糖；所述的干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-85～-75℃，更优选为-80℃，所述冷冻干燥的时间优选为45～55h，更优选为48～52h，最优选为50h。

本发明在获得所述粗多糖后，将所述粗多糖依次过DEAE-52纤维素柱和sephadexG-100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。本发明中所述粗多糖优选为用水溶解制备粗多糖溶液，所述粗多糖与水的质量体积比优选为10～20mg：1ml。本发明优选的将所述粗多糖上样于DEAE-52纤维素柱，经NaCl梯度洗脱。本发明中，所述DEAE-52纤维素柱的规格为2.6cm×30cm，NaCl洗脱液的浓度依次优选为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mol/L；所述洗脱的流速优选为0.8～1.2mL/min，更优选为1.0mL/min，每一NaCl浓度的洗脱时间优选为800～1000min。本发明优选的将收集到的0.3和0.4mol/L的NaCl洗脱获得的洗脱液分别经过sephadex G-100凝胶柱分离纯化，获得海藻多糖。本发明中，所述sephadex G-100凝胶柱的规格为1.6cm×100cm，所述sephadex G-100凝胶柱分离纯化用的洗脱液优选为0.1mol/L的NaCl，所述洗脱液的洗脱流速优选为15～25mL/h，更优选为20mL/h，本发明在所述洗脱过程中，收集洗脱后的溶液，优选的检测所述洗脱后的溶液中的糖含量，收集糖含量高的洗脱后的溶液为海藻多糖。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

图1为本发明实施例1中从巨藻中提取海藻多糖的制备方法的流程示意图，如图1所示，所述海藻多糖制备方法包括：

巨藻LN产自智利，干燥粉碎后，用40目筛子过筛，干燥的巨藻粉末加入95％的乙醇水溶液回流提取至回流液体没有明显颜色，去除色素、蛋白质、盐类等小分子；经乙醇回流提取后的沉淀在烘箱中60℃干燥6h，获得脱色脱杂巨藻粉，含水量为0.484％。将所述的脱色脱杂巨藻粉按照料液比1:30的比例，加入终浓度为0.1M的盐酸溶液中，100℃提取2小时，用硅藻土进行过滤；在上清液中加入2％的CaCl₂，混合液在4℃下静置12h去除海藻酸；滤液经截留分子量为3500Da的透析袋透析，每隔6小时换水，透析24h。透析后，进行低压加热旋蒸浓缩，浓缩的倍数为1/3，在浓缩液中后加入4倍体积的乙醇沉淀，离心，冻干后得到白色LNP粗多糖。LN粗多糖上样于DEAE-52纤维素柱(2.6cm×30cm)，经0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为1.0mL/min，每管收集10mL，每一浓度NaCl的洗脱时间为800-1000min；收集的洗脱液经苯酚硫酸法测定糖含量其中，0.1，0.2，0.5mol/L的NaCl溶液洗脱未得到多糖组分，0.3和0.4mol/L的NaCl溶液分别在洗脱30-52管和10-30管得到两个多糖组分；0.3及0.4mol/L的NaCl洗脱液再分别经sephadex G-100凝胶柱(1.6cm×100cm)分离纯化，0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为20mL/h，每管收集5mL，收集的洗脱液经苯酚硫酸法测定糖含量，分别在8-26管和10-22管得到多糖组分单一峰，即纯化的两个酸性多糖组分LNP-1和LNP-2。LNP-1和LNP-2两个多糖组分的提取率分别为64.0％和75.3％，纯度分别为87.3％和84.0％.

实施例2

将100mg所述LNP粗多糖溶于1000ml蒸馏水，搅拌均匀，得到抗盐调节剂A。

将100mg所述LNP多糖溶于蒸馏水，搅拌均匀，使LN多糖浓度为100mg/L，向其中加入表面活性剂吐温-20，使表面活性剂浓度为1000mg/L，制得抗盐调节剂B；

将100mg所述分离纯化得到的多糖组分LNP-1溶于蒸馏水中，搅拌均匀，使多糖浓度为100mg/L,向其中加入表面活性剂吐温-20，使表面活性剂浓度为1000mg/L，制得抗盐调节剂D。

将100mg所述分离纯化得到的多糖组分LNP-2溶于蒸馏水中，搅拌均匀，使所述LNP-2多糖的作用浓度为100mg/L，向其中加入表面活性剂吐温-20，使表面活性剂浓度为1000mg/L，制得抗盐调节剂F。

以小麦为例，对处于幼苗期的小麦幼苗用抗盐调节剂B、D和F进行喷洒处理，具体实验如下：

实验方法：将小麦种子消毒、浸泡、催芽，待种子刚露白，挑选饱满、大小均一的小麦种子播撒到培养皿中，每皿30粒，用Hoagland(霍格兰氏)营养液在光照培养箱中培养，培养条件为25/20℃(昼/夜)、光照强度800μmol/m²/s、光照周期14/l0h(光照14h，黑暗10h)，相对湿度65±5％；待小麦幼苗生长至2叶1心期时，用抗盐调节剂B、D和F对小麦幼苗叶片进行喷施，使叶片完全湿润，但液体不流下，阴性对照组喷以等量的含有相同浓度表面活性剂的清水；24h后将小麦幼苗置于盐胁迫10d，然后测定小麦幼苗叶片各项指标。所述盐胁迫是指用霍格兰氏营养液配置120-150mmol/LNaCl溶液，本实验采用的是120mmol/L。

实验结果：

第一在盐胁迫下，小麦幼苗生长受到抑制，苗高、根长、鲜重及干重均显著降低；经所述抗盐调节剂B、D、F中植物抗盐调节剂处理后，与盐胁迫组相比，小麦苗高分别提高了6.1％，4.7％和12.0％；根长分别提高了33.5％，29.0％和37.3％；鲜重及干重分别提高了18.1％，8.1％，17.7％和25.0％，11.8％，30.9％。结果表明，包括海藻糖的抗盐调节剂可以促进盐胁迫下植物幼苗生物量的积累，见下表1，表1为植物抗盐调节剂对小麦幼苗生长参数的影响对照表。

表1植物抗盐调节剂对小麦幼苗生长参数的影响对照表

第二在盐胁迫下，小麦幼苗叶片丙二醛含量显著升高1.7倍；与盐胁迫组相比，实施例中使用所述植物抗盐调节剂B、D、F中处理组丙二醛含量降低了45.1％，36.2％和52.4％(图2)。土壤盐度升高会增加活性氧(ROS)的含量而引起植物细胞膜的氧化损伤损伤，丙二醛是植物细胞膜脂质过氧化产物，指示植物细胞膜氧化损伤程度。实验结果表明，该调节剂可以减轻盐胁迫下植物质膜的过氧化作用，保护植物质膜结构，维持植物正常生理功能。见图1。

第三盐胁迫处理小麦幼苗10天后，分别取小麦不同组织进行离子测定。取小麦幼苗根、茎、叶，用蒸馏水冲洗干净。105℃杀青30min，70℃烘干至恒重，用于元素分析。

结果表明，盐胁迫下小麦幼苗不同组织中Na⁺含量显著增加。根、茎、叶Na⁺含量分别是对照的48.9、105.6、49.7倍(P<0.05，图3A)。盐胁迫植株根、叶中钾含量分别增加146.3％和37.4％。然而，小麦幼苗茎中K⁺含量的变化趋势相反。盐胁迫组K⁺含量略低于对照组，但无显著性差异。本发明中的植物抗盐调节剂处理的小麦幼苗Na⁺含量低于盐胁迫植株，但仍高于对照组。结果表明，在盐胁迫下，Na⁺在不同的组织中积累，特别是在根中。植物抗盐调节剂处理的小麦幼苗根系Na⁺含量分别下降21.6％、19.4％和25.6％，茎Na⁺含量分别下降40.8％、38.2％和50.0％，叶片Na⁺含量分别下降51.3％、39.6％和59.1％。与盐胁迫相比，植物抗盐调节剂处理提高了根、茎和叶片中K⁺的含量(图3B)。因此，植物抗盐调节剂处理植株的根、茎和叶中Na⁺/K⁺比值较低(图3C)。从结果可以看出，海藻多糖能够有效调节Na⁺在小麦体内转运分配，将过量Na⁺贮存于根部，减轻Na⁺对茎和叶的胁迫，保证小麦幼苗的生理功能。本发明中的植物抗盐调节剂还能够调节K⁺在小麦体内转运分配，维持小麦幼苗叶中较低的Na⁺/K⁺值，以保证小麦正常生理功能，见图3。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种从巨藻中提取海藻多糖的方法，包括以下步骤：

1)将巨藻粉和乙醇水溶液混合回流提取10～30h，收集固相组分，干燥获得脱色脱杂巨藻粉；

2)将步骤1)中所述的脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液混合，95～105℃提取1～3h后，过滤获得上清液；

3)将步骤2)中所述上清液与CaCl₂混合3～5℃静置10～14h后，透析、浓缩获得浓缩液；

4)将步骤3)中所述浓缩液与乙醇混合醇沉收集沉淀、干燥获得粗多糖；

5)将步骤4)中获得的粗多糖依次过DEAE-52纤维素柱和sephadex G-100凝胶柱获得纯化的海藻多糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述乙醇水溶液的体积浓度为90～97％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述巨藻粉和乙醇水溶液的质量体积比为(100～200)g:(1000～2000)ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述干燥的温度为50～70℃，所述干燥的时间为4～8h；所述干燥后脱色脱杂巨藻粉的含水量为0.40～0.55％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述盐酸溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，所述脱色脱杂巨藻粉与盐酸溶液质量体积比为1g:(25～35)ml。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述过滤为硅藻土过滤。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述透析用透析膜的截留分子量为3500Da。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述透析的总时间为20～30h，每5～7h换水一次。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述浓缩液与乙醇的体积比为1：(3～6)。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-85～-75℃，所述冷冻干燥的时间为45～55h。