CN103497259A - 一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，将干燥后的杏鲍菇菌丝浸渍于蒸馏水溶剂容器中，将容器放置超声波粉碎设备中利用超声波粉碎杏鲍菇菌丝的细胞壁结构，获得杏鲍菇菌丝混合液，再将杏鲍菇菌丝混合液采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，获得浸提液，然后将浸提液进一步离心、浓缩、醇沉、离子交换层析后得到杏鲍菇多糖。本发明所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎菌丝体细胞壁破裂，加速菌丝体中的有效成分进入溶剂，无需反复多次浸提，多糖得率高，简化了提取工艺，多糖提取效率高。

Description

一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺

技术领域

本发明涉及一种杏鲍菇多糖提取工艺，尤其涉及一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺。

背景技术

现代医学研究发现，食用菌中能显著增强癌症患者抵抗力的生理活性物质即为食用菌多糖。食用菌多糖具有多种生物活性，包括：抗肿瘤、调节免疫、降血压、降血脂、降血糖、健胃保肝、抗病毒，除此之外它还具有抗氧化、延缓衰老、抗感染、抗辐射、抗水肿、抗疲劳和修复损伤组织细胞等方面的功效。目前，食用菌多糖已广泛应用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和肿瘤等疾病的临床治疗及医药领域的其它用途，如制备医用透析膜、药物缓释剂、血浆代用品及疫苗等。

杏鲍菇又名刺芹侧耳，是一种品质优良的名贵珍稀食用菌，有较高的食用价值和药用价值，具有润肠、美容、抗肿瘤等作用，是联合国粮农组织向，世界各国推荐的食用菌新品。杏鲍菇中含有丰富的多糖物质，多糖又称多聚糖，是由单糖缩合成的多聚物，广泛存在于高等植物、动物和微生物中，它是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。杏鲍菇中所含的真菌多糖能增强肌体免疫功能，具有抗病毒，降低机体胆固醇含量，防止动脉硬化等功能。以杏鲍菇子实体为材料，分离纯化了杏鲍菇多糖，并利用MDA(丙二醛)、GSHOPX(谷肤甘肤过氧化物酶)活力、血清GBT(谷丙转氨酶)活力、COT(谷草转氨酶)活力、CK(肌酸激酶)活力等指标研究杏鲍菇多糖对力竭小鼠自由基代谢及心肌、肝脏、骨骼肌损伤的影响，以观察杏鲍菇多糖抗氧化、抗损伤功效。

传统的杏鲍菇多糖提取采用热水浸提法，以水作为溶剂浸提多糖，温度通常控制在50～100℃，在恒温水浴上回流浸提2～4h，过滤后得滤液和滤渣。滤渣再用水在相同条件下反复浸提3～5次，合并滤液，将滤液浓缩使大部分水分挥发，然后加入2～5倍体积的95%的乙醇，多糖呈絮状沉淀析出，而大部分蛋白质和其它成分保留在溶液中，离心分离多糖，用适量的无水乙醇或丙酮洗涤脱水，然后采用真空干燥或冷冻干燥即可得到粗多糖。此法操作简便、有机溶剂使用量少、对多糖活性破坏小。但水作为溶剂难以完全溶出其中的多糖物质，所以需要多次浸提，操作时间长，收率较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题和提出的技术任务是对现有技术进行改进，提供一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，解决目前技术中杏鲍菇多糖提取采用传统热水浸提法需要多次浸提，多糖得率低的问题。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是：

一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，采用如下步骤：（1）将干燥后的杏鲍菇菌丝浸渍于蒸馏水溶剂容器中，将容器放置在功率为500～700W、温度控制在25℃～55℃的超声波粉碎设备中利用超声波粉碎杏鲍菇菌丝的细胞壁结构，获得杏鲍菇菌丝混合液；（2）将杏鲍菇菌丝混合液采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，获得浸提液；（3）将浸提液离心，获得残渣后再将残渣采用热水浸提并离心，合并两次的上清液，将上清液浓缩，获得多糖提取液；（4）然后将多糖提取液进行醇沉加工，将其中的粗多糖分离出来，一方面脱除部分杂质，同时得到粗多糖粉；（5）利用离子交换层析技术将粗多糖粉分离纯化去除其中的游离蛋白质，除蛋白后的多糖再经过脱色及透析，将少量色素及小分子杂质去除，最终获得杏鲍菇多糖。

杏鲍菇菌丝体的胞内多糖主要存在与细胞壁和细胞间质中，所以胞内多糖的提取率与细胞壁的破坏程度有很大关系。超声波指频率高于20KHz，人的听觉阈以外的声波。超声波在传播时，使弹性介质中的粒子产生振荡，并通过弹性介质按超声波的传播方向传递能量。超声波传时可以产生空化效应、机械效应和热效应。

液体或多或少溶有微气泡，超声的作用亦使液体内产生无数微小空腔，且尺寸不一。当一定频率的超声波作用于液体时，只有尺寸适宜的小气泡能发生共振现象，大于共振尺寸的小泡被驱出液体外，小于共振尺寸的小泡在超声作用下逐渐长大。接近共振尺寸时，在声波的稀疏阶段，小泡迅速胀大；在声波的压缩阶段，小炮又突然被绝热压缩，直至湮灭，这瞬间在气泡及其周围微小空间内出现热点，形成高温高压区，温度达5000K以上，强大的微激波压力达500atm，因此超声作用可使植物细胞壁及整个生物体破裂，有利于有效成分在液体媒介中溶出。穴闭合或气泡崩塌之后，其内“热点”骤然冷却，冷却速度可达108K/s。这相当于将金属熔浆放入液氮中的急剧冷却速度。由于这种吸收声能引起的药物组织内部温度的升高是瞬时的，因此可以使被提取的成分的结构和生物活性保持不变。

同时超声波的高频振动及辐射压力可在液体中形成有效的搅动与流动，使媒质质点在其传播空间内进入振动状态，从而可加速细胞内物质的释放、扩散及溶解过程。由于超声波可给予介质和悬浮体以不同的加速度且介质分子的运动速度远大于悬浮体分子的运动速度，从而在两者之问产生摩擦，这种摩擦力可使生物细胞壁上的有效成分更快地溶解于溶剂之中。

进一步的，所述的步骤（1）中杏鲍菇菌丝溶液的超声波粉碎处理加工时间8～10min。超声处理时间过短就无法完全使杏鲍菇菌丝的细胞结构破碎，从而多糖得率会很低；但超声处理时间过长，多糖得率也会有下降的趋势，这是由于超声波处理时间过长，导致多糖结构发生变化，糖链断裂使多糖得率下降所致。

进一步的，所述的步骤（2）中热水浸提法加热的杏鲍菇菌丝混合液的液料比为8:1ml/g，加热温度保持在97℃，浸提时间为2小时。从热力学角度上讲，温度越高，加热时间越长，对菌丝体细胞壁的破坏作用越大，多糖的提取率会越高。但是温度过高，加热时间太长，有可能引起多糖结构的变化和破坏。从这两方面考虑，在提取多糖时，应选择合适的加热温度和加热时间。液料比是影响多糖提取的另一个重要因素，从浓度梯度考虑，加水量越多，菌丝体胞内多糖会渗出的越多，但加水量过多，会加大续浓缩工艺的加工难度。杏鲍菇菌丝的细胞结构已被超声波完全破坏，绝大部分的多糖已从细胞中溶出，因此无需重复多次热水浸提才能将大部分的多糖浸提出来，显著提高了多糖得率并简化提取工艺。

进一步的，所述的步骤（3）中对上清液采用真空浓缩，并将上清液浓缩至浓缩前的1/10。液体物质在沸腾状态下溶剂的蒸发很快，其沸点因压力而变化，压力增大，沸点升高，压力小，沸点降低。由于在较低温度下蒸发，所以可以节省大量能源。同时，由于物料不受高温影响，避免了热不稳定成分的破坏和损失，更好地保存了原料的营养成分。同时为了保证醇沉时尽量出去杂质，同时减少有效成分的损失，就需要将上清液浓缩到一定的浓度。多糖提取液浓度过高，则其粘稠度较大，醇沉溶液与多糖提取液难以充分接触，所产生的沉淀容易包裹提取液，造成有效成分损失；而多糖提取液浓度过低，则需要消耗大量醇沉溶液造成成本增加。

进一步的，所述的步骤（4）中采用3倍多糖提取液体积的乙醇溶液对多糖提取液进行醇沉加工获得粗多糖粉，沉淀时间为6小时。通过超声波辅助提取得到的杏鲍菇多糖提取液中含有很多杂质，可以通过醇沉的方法将其中的粗多糖分离出来，一方面可以脱除部分杂质，同时也可以得到粗多糖粉，为杏鲍菇多糖的进一步分离、纯化作为原料。

进一步的，所述的步骤（4）中乙醇溶液的浓度为95%。醇沉精制过程中乙醇总量低于某一临界乙醇总量时，醇溶物的量随乙醇用量增加而增加；高于临界总量时，增加趋势减缓直至不再增加。

进一步的，所述的步骤（5）中采用离子交换树脂吸附去除游离蛋白质，树脂采用对多糖的吸附量小、同时对蛋白质的吸附量大并且呈网状结构的D315大孔树脂。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。所以选择交换树脂既要看树脂的极性大小，又要看其对多糖和蛋白质的吸附量的大小。

进一步的，所述的步骤（5）中对粗多糖粉液的洗脱速度为1.0ml/min流速。随着洗脱液流速的增大，树脂对蛋白质的吸附量减少，多糖的纯度降低，这是因为流速过快，树脂与蛋白质分子之间没有足够的接触；流速过小，有利于吸附，但会延长吸附时间。

与现有技术相比，本发明优点在于：

本发明所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎菌丝体细胞壁破裂，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速菌丝体中的有效成分进入溶剂，进一步增大了有效成分的溶出，经过超声波粉碎处理后的杏鲍菇菌丝混合液直接采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，无需反复多次浸提，多糖得率高，简化了提取工艺；

超声波粉碎是一个物理过程，在整个浸提过程中无化学反应发生，不影响大多数药物有效成分的生理活性,提取物有效成分含量高，有利于进一步精制;

采用超声波技术来强化提取过程，提取时间仅为常规溶剂提取法的几分之一，因而提取效率高；

本发明采用醇沉和离子交换层析技术去除杏鲍菇多糖中的杂质、游离蛋白质和色素等，得到的最终杏鲍菇多糖纯度高。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，以实现提取时间短，无需加热，适合热敏物质的提取，目标成分取率高，可降低溶剂用量，提高多糖纯度为目的。

一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，采用如下步骤：（1）将干燥后的杏鲍菇菌丝浸渍于蒸馏水溶剂容器中，将容器放置在超声波粉碎设备中利用超声波粉碎杏鲍菇菌丝的细胞壁结构，获得杏鲍菇菌丝混合液；（2）将杏鲍菇菌丝混合液采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，获得浸提液；（3）将浸提液离心，获得残渣后再将残渣采用热水浸提并离心，合并两次的上清液，将上清液浓缩，获得多糖提取液；（4）将多糖提取液进行醇沉加工，将其中的粗多糖分离出来，一方面脱除部分杂质，同时得到粗多糖粉；（5）利用离子交换层析技术将粗多糖粉分离纯化去除其中的游离蛋白质，除蛋白后的多糖再经过脱色及透析，将少量色素及小分子杂质去除，最终获得杏鲍菇多糖。

超声波可在液体中产生空化作用，而空化作用产生的冲击波和射流可破坏细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力。适当的超声处理能增强细胞内容物通过细胞膜的穿透力和传输能力。因此，本项目采用热水浸提法，并通过超声破碎法处理菌丝体细胞来弥补传统热水浸提法需要多次浸提，多糖得率低的缺点。超声处理时间延长，多糖得率增大，但是超声处理时间过长时，多糖得率反而有下降的趋势，这是由于超声波处理时间过长，导致多糖结构发生变化，糖链断裂使多糖得率下降所致。

超声功率：本发明采用超声波细胞粉碎机对菌丝体进行破碎，在固定料液比、超声频率、提取时间以及温度为25～55℃的条件下，以超声功率分别为200、400、500、600、700、800W进行超声提取，结果表明，随着超声功率的增加，收率不断增加，600W时收率最高，超过700W之后多糖收率反而下降。

超声提取时间：本项目在固定料液比、超声功率、超声频率以及温度为25～55℃的条件下，以超声提取时间分别为5、8、10、15、20、30min进行提取，提取2次。结果表明，提取时间为8～10min时，收率最高。

在通过超声波粉碎处理之后，将杏鲍菇菌丝混合液采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，获得浸提液。

通过反复试验发现影响杏鲍菇菌丝体多糖得率的因素大小为浸提温度>浸提时间>液料比。杏鲍菇菌丝体采用超声破碎法，破碎后的菌丝可直接进行热水浸提，不需要将菌丝体烘干粉碎制成菌粉。由于超声破碎效果较强，菌丝破碎后，大部分多糖已经从细胞中溶出，无需反复多次浸提，不仅提高了多糖得率，还简化了提取工艺，节约大量工时，提高了多糖提取的效率。

试验结果表明杏鲍菇菌丝体多糖提取的最佳工艺条件为：浸提温度97℃、浸提时间2h、液料比8:1ml/g。

将采用热水浸提法得到的浸提液进行离心，获得残渣后再将残渣采用热水浸提并离心，合并两次的上清液，采用真空浓缩对上清液进行浓缩，并将上清液浓缩至浓缩前的1/10，获得多糖提取液。由于气压小，沸点降低，溶液蒸发的温度低，从而物料不受高温影响，避免了热不稳定成分的破坏和损失，更好地保存了原料的营养成分，经过浓缩后得到多糖提取液。

浓缩之后的杏鲍菇多糖提取液中含有很多杂质，可以通过醇沉的方法将其中的粗多糖分离出来，一方面可以脱除部分杂质，同时也可以得到粗多糖粉，为杏鲍菇多糖的进一步分离、纯化作为原料。

通过对醇沉工艺时间及最佳乙醇加量的研究，最终确定醇沉的最佳工艺条件为多糖提取液3倍体积的95%乙醇沉淀6小时，在此条件下杏鲍菇粗多糖的醇沉得率为21.34%，即经过上述工艺提取多糖后，每100g杏鲍菇可以得到15.7g的粗多糖粉。经过测定，在此粗多糖粉中，多糖含量为75.73%，蛋白含量为6.67%。

醇沉后的粗多糖粉中还含有游离蛋白质、色素以及其它一些低分子物质(包括寡糖、一些单糖、盐分等)，其中蛋白质为含量较大的一种。本发明采用离子交换层析的工艺对杏鲍菇的粗多糖粉进行进一步的分离纯化。

采用离子交换树脂脱蛋白，即利用不同生物物质的带电部分与具有相反电荷的离子交换吸附的强弱不同，利用一定的置换技术，将其逐一进行分开而实现分离的目的。离子交换剂即离子交换层析所用的固相基质，是由不溶于水的，具有网状结构的高分子聚合物骨架组成。这种不溶性骨架有树脂，纤维素，葡聚糖凝胶，聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等不同种类。这些骨架在交换过程中不发生任何反应。由于蛋白质在除等电点以外的溶液中带有电荷，而多糖大多为中性，所以对于多糖溶液中存在的游离蛋白质可以采用离子交换树脂吸附而除去。

采用树脂分离杏鲍菇多糖中的蛋白质，要求树脂对多糖的吸附量小，同时对蛋白质的吸附量要大。所以选择交换树脂既要看树脂的极性大小，又要看其对多糖和蛋白质的吸附量的大小。通过对ABS、D101、D315三种大孔树脂进行筛选，研究发现D315大孔树脂对多糖的吸附量最低，并且对蛋白质的吸附量最大，所以，本项目采用D315大孔树脂对杏鲍菇多糖进行脱蛋白处理。

在多糖液通过D315大孔树脂时其流速的增大，树脂对蛋白质的吸附量减少，多糖的纯度降低，这是因为流速过快，树脂与蛋白质分子之间没有足够的接触；流速过小，有利于吸附，但会延长吸附时间。通过筛选，本发明最终选择1.0ml/min流速作为洗脱速度。

在进行离子交换之前的多糖液中，多糖含量为3.03mg/ml，蛋白质含量为0.27mg/ml；经过D315弱碱性阴离子大孔树脂脱蛋白后，经测定并换算为与离子交换前相同体积多糖液条件下，多糖含量为2.58mg/ml，多糖损失率为14.91%；蛋白质含量为0.05mg/Ml，蛋白脱除率为81.48%。

除蛋白后的多糖再经过脱色及透析，将少量色素及小分子杂质去除，从而使得杏鲍菇多糖纯度达到87.3%。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，采用如下步骤：（1）将干燥后的杏鲍菇菌丝浸渍于蒸馏水溶剂容器中，将容器放置在功率为500～700W、温度控制在25℃～55℃的超声波粉碎设备中利用超声波粉碎杏鲍菇菌丝的细胞壁结构，获得杏鲍菇菌丝混合液；（2）将杏鲍菇菌丝混合液采用热水浸提法加热使杏鲍菇菌丝体胞内多糖渗出，获得浸提液；（3）将浸提液离心，获得残渣后再将残渣采用热水浸提并离心，合并两次的上清液，将上清液浓缩，获得多糖提取液；（4）将多糖提取液进行醇沉加工，将其中的粗多糖分离出来，一方面脱除部分杂质，同时得到粗多糖粉；（5）利用离子交换层析技术将粗多糖粉分离纯化去除其中的游离蛋白质，除蛋白后的多糖再经过脱色及透析，将少量色素及小分子杂质去除，最终获得杏鲍菇多糖。

2.根据权利要求1所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（1）中杏鲍菇菌丝溶液的超声波粉碎处理加工时间8～10min。

3.根据权利要求1所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（2）中热水浸提法加热的杏鲍菇菌丝混合液的液料比为8:1ml/g，加热温度保持在97℃，浸提时间为2小时。

4.根据权利要求1所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（3）中对上清液采用真空浓缩，并将上清液浓缩至浓缩前的1/10。

5.根据权利要求1所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（4）中采用3倍多糖提取液体积的乙醇溶液对多糖提取液进行醇沉加工获得粗多糖粉，沉淀时间为6小时。

6.根据权利要求5所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（4）中乙醇溶液的浓度为95%。

7.根据权利要求5所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（5）中采用离子交换树脂吸附去除游离蛋白质，树脂采用对多糖的吸附量小、同时对蛋白质的吸附量大并且呈网状结构的D315大孔树脂。

8.根据权利要求7所述的超声波辅助杏鲍菇多糖提取工艺，其特征在于，所述的步骤（5）中对粗多糖粉液的洗脱速度为1.0ml/min流速。