CN108409879A - 灵芝活性多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了灵芝活性多糖的提取方法，其具体步骤为：将灵芝子实体烘干，粉碎，用石油醚脱脂得脱脂灵芝粉；向脱脂灵芝粉中加水，超声提取后离心，上清液浓缩，加入离子液体‑无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，静置分相，将下相装入透析袋中透析得脱蛋白多糖溶液；将脱蛋白多糖溶液中加入D392阴离子交换树脂、脂肪酸甲脂和三乙胺，震荡脱色，过滤，浓缩；将脱色得到的浓缩液中加入乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖。有益效果为：本发明灵芝活性多糖的提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，脱色率高，提取成本低。

Description

灵芝活性多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及多糖提取技术领域，尤其是涉及灵芝活性多糖的提取方法。

背景技术

灵芝（Ganoderma lucidum）属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌，素“仙草、瑞草”之美誉，有吉祥如意、尽除百病的含义，赋予灵芝仙丹妙药的美称。在中国、韩国和日本等国家，作为民间药方延年益寿和滋补身体已经有上千年的历史。在我国，《本草纲目》，《神农本草经》等名著中均有记载，称其“益心气”、“疗虚”、“利关节”、“好颜色”等功效。一般所指的灵芝是其子实体。灵芝子实体其外形呈伞状近圆形，是由菌盖和菌柄构成，是灵芝繁殖器官。灵芝的品质与地域、温度、气候等有着密切的关系，导致灵芝的质量品质良莠不齐，科学有效的方法来检测和控制灵芝相关产品质量成为当今功能食品和药品产业发展中急需解决的课题，而高效的提取方法是其前提。灵芝作为一种药食两用真菌，受到来自国内外生物化学和药理学等学科研究学者的广泛关注。按照现代中药理念，灵芝预防和治疗疾病表现在以下三个方面，其一，灵芝毒副性小；其二，保健治疗时作用多个器官；其三，改善和提高器官的正常功能。随着生物技术的发展，许多学者对研究灵芝的生物活性组分和灵芝相关产物非常关注。现代研究证明，灵芝主要生物活性组分包括：多糖、三萜类、蛋白质、氨基酸、甾醇、矿物质等。

多糖（polysaaccharide）是一类由10个以上单糖通过糖苷键聚合而成天然高分子化合物，通常是由醛糖或酮糖组成，具有广泛的生物活性，是维持生命活动的基本物质之一。多糖与脂类、蛋白质形成的脂多糖、糖蛋白在细胞与细胞信息交流、以及蛋白质的加工和转移以及免疫系统分子识别方面起着重要的作用。根据来源不同，多糖分为三种，分别是植物多糖，动物多糖，微生物多糖，而微生物多糖是近年来研究的重心。灵芝多糖是一种由三股单糖链组成且呈螺旋状的立体构型物，其构型与RNA、DNA相似，其分子量从数百到数十万。灵芝多糖作为灵芝的主要生物活性组分，现代药理学和临床试验证实灵芝多糖在预防和治疗多种疾病中扮演重要角色，具有抗肿瘤、免疫调节、抗辐射、抗菌、抗氧化等多种药理作用，近来越来越多如灵芝胶囊、灵芝口服液等灵芝多糖相关产品的出现，推动着灵芝产业的飞速发展。

现有技术如授权公告号为CN103073651B的中国发明专利，公开了一种灵芝多糖方法及其应用，采用超声波结合酶法提取灵芝多糖，灵芝粉碎后，通过提取、超滤、浓缩和乙醇沉淀分离获得灵芝多糖。灵芝多糖提取率为3.14-4.21%，分子量在10000道尔顿以下，呈浅棕色，其提取分离方法简单，适宜于工业化生产。所得灵芝多糖具有较强的抗氧化活性和抗癌活性。在DPPH·自由基体系中，灵芝多糖的IC50为0.28-0.43mg/mL，ORAC值可达1207.66-1777.90μmolTrolox/g。灵芝多糖浓度为2mg/ml时，对人肺癌细胞A549的抑制率可达53.04-68.37%，可以用于制备抗癌药物。但是该灵芝多糖的提取率和纯度均较低，且未经脱色处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，脱色率高，提取成本低的灵芝活性多糖的提取方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

灵芝活性多糖的提取方法，包括原料预处理、灵芝粗多糖提取液制备、脱蛋白、脱色、醇沉，其具体步骤为：

原料预处理：将灵芝子实体在50-80℃的条件下烘干，粉碎后过80-200目筛，然后用石油醚按料液比为1:3-5、温度为45-55℃浸提2-3次进行脱脂处理，浸提结束后在3000-5000rpm下离心20-25rnin，沉淀物质在50-80℃下干燥，即得脱脂灵芝粉，该步骤可以除去脂类、低聚糖等小分子，为提取灵芝多糖做准备；

灵芝粗多糖提取液制备：按料液比为1:17-22向脱脂灵芝粉中加水，在温度为70-80℃、功率为100-150W下超声提取80-100min，然后在3000-5000rpm下离心20-25rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4至1/2，浓缩液即为得灵芝粗多糖提取液，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与灵芝之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程；

脱蛋白：将灵芝多糖提取液加入离子液体-无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，然后在20-30℃下静置分相10-15h，将上下相分离，将下相装入350-500kDa透析袋中，于蒸馏水中透析20-30h以除去盐及其它小分子杂质，即得脱蛋白多糖溶液，备用，离子液体-无机盐双水相体系的粘度较小，该步骤可将灵芝多糖提取液中的蛋白质、矿物质等小分子杂质萃取到双水相体系上相，而灵芝多糖分配在下相中，回收双水相体系中下相，加醇沉淀即可得到脱蛋白的灵芝多糖，与传统工艺相比，条件温和，缩短了工艺流程，降低了能耗，减少了有机溶剂用量，同时离子液体可以得到有效的回收再利用，降低了物耗，更适合大规模生产与应用；

脱色：将脱蛋白多糖溶液的浓度调整为4-6mg/mL、pH为4.5-5.5，按料液比为1:20-30g/mL加入D392阴离子交换树脂，再加入树脂重量0.22-0.28‰的脂肪酸甲脂和0.03-0.05‰三乙胺，然后在温度为50-60℃的条件下震荡脱色1.5-2.5h，过滤，浓缩，备用，脂肪酸甲脂和三乙胺的加入能够降低脱蛋白多糖溶液的黏度，有利于色素分子扩散和减少液膜阻力，进而有利于色素在树脂内的分散，同时能够提高树脂对色素的吸附性能，增强色素和树脂功能基团的结合力，避免色素从吸附树脂上解吸，提高脱色率，且能够降低色素之间的作用力，最终提高树脂对色素的吸附能力，脱蛋白多糖溶液含有灵芝多糖色素，其主要为阴离子型分子、少量非极性和弱极性分子，该步骤用树脂内部具有较高的孔隙率，表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，脱色最好，且该树脂可再生，降低灵芝多糖提取的成本；

醇沉：将脱色得到的浓缩液中加入4-6倍体积的93-97%乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖，由于灵芝多糖是极性的，不溶于乙醇溶液，因此可在多糖提取液中加入一定浓度的乙醇溶液，多糖形成沉淀，从而使多糖与水溶性单糖等其他物质分离，得到的灵芝精制多糖能增强机体的免疫功来达到杀伤肿瘤细胞的目的，能够影响细胞生化代谢、抑制肿瘤细胞周期和抑制肿瘤组织中SOD活性，同时具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明灵芝活性多糖的提取方法简单可行，多糖的提取效率、得率和纯度均较高，易于工业化生产，安全性更高，大大提高灵芝的附加值；2）该提取方法脱蛋白条件温和，缩短了工艺流程，降低了能耗，减少了有机溶剂用量，同时离子液体可以得到有效的回收再利用，降低了物耗，更适合大规模生产与应用；3）该提取方法脱色效果好，能够降低脱蛋白多糖溶液的黏度，提高树脂对色素的吸附性能和吸附量，避免色素从吸附树脂上解吸，提高脱色率；4）该提取方法得到的多糖能增强机体的免疫功来达到杀伤肿瘤细胞的目的，能够影响细胞生化代谢、抑制肿瘤细胞周期和抑制肿瘤组织中SOD活性，同时具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

灵芝活性多糖的提取方法，包括原料预处理、灵芝粗多糖提取液制备、脱蛋白、脱色、醇沉，其具体步骤为：

1）原料预处理：将灵芝子实体在80℃的条件下烘干，粉碎后过80目筛，然后用石油醚按料液比为1:5、温度为45℃浸提3次进行脱脂处理，浸提结束后在3000rpm下离心25rnin，沉淀物质在50℃下干燥，即得脱脂灵芝粉，该步骤可以除去脂类、低聚糖等小分子，为提取灵芝多糖做准备；

2）灵芝粗多糖提取液制备：按料液比为1:22向脱脂灵芝粉中加水，在温度为70℃、功率为150W下超声提取80min，然后在5000rpm下离心20rnin，将上清液浓缩至原体积的1/2，浓缩液即为得灵芝粗多糖提取液，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与灵芝之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程；

3）脱蛋白：将灵芝多糖提取液加入离子液体-无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，然后在20℃下静置分相15h，将上下相分离，将下相装入350kDa透析袋中，于蒸馏水中透析30h以除去盐及其它小分子杂质，即得脱蛋白多糖溶液，备用，离子液体-无机盐双水相体系的粘度较小，该步骤可将灵芝多糖提取液中的蛋白质、矿物质等小分子杂质萃取到双水相体系上相，而灵芝多糖分配在下相中，回收双水相体系中下相，加醇沉淀即可得到脱蛋白的灵芝多糖，与传统工艺相比，条件温和，缩短了工艺流程，降低了能耗，减少了有机溶剂用量，同时离子液体可以得到有效的回收再利用，降低了物耗，更适合大规模生产与应用；

4）脱色：将脱蛋白多糖溶液的浓度调整为4mg/mL、pH为5.5，按料液比为1:20g/mL加入D392阴离子交换树脂，再加入树脂重量0.28‰的脂肪酸甲脂和0.03‰三乙胺，然后在温度为60℃的条件下震荡脱色1.5h，过滤，浓缩，备用，脂肪酸甲脂和三乙胺的加入能够降低脱蛋白多糖溶液的黏度，有利于色素分子扩散和减少液膜阻力，进而有利于色素在树脂内的分散，同时能够提高树脂对色素的吸附性能，增强色素和树脂功能基团的结合力，避免色素从吸附树脂上解吸，提高脱色率，且能够降低色素之间的作用力，最终提高树脂对色素的吸附能力，脱蛋白多糖溶液含有灵芝多糖色素，其主要为阴离子型分子、少量非极性和弱极性分子，该步骤用树脂内部具有较高的孔隙率，表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，脱色最好，且该树脂可再生，降低灵芝多糖提取的成本；

5）醇沉：将脱色得到的浓缩液中加入6倍体积的93%乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖，由于灵芝多糖是极性的，不溶于乙醇溶液，因此可在多糖提取液中加入一定浓度的乙醇溶液，多糖形成沉淀，从而使多糖与水溶性单糖等其他物质分离，得到的灵芝精制多糖对·OH、超氧自由基均具有较强的清除率。

实施例2：

灵芝活性多糖的提取方法，包括原料预处理、灵芝粗多糖提取液制备、脱蛋白、脱色、醇沉，其具体步骤为：

1）原料预处理：将灵芝子实体在50℃的条件下烘干，粉碎后过200目筛，然后用石油醚按料液比为1:3、温度为55℃浸提2次进行脱脂处理，浸提结束后在5000rpm下离心20rnin，沉淀物质在80℃下干燥，即得脱脂灵芝粉；

2）灵芝粗多糖提取液制备：按料液比为1:17向脱脂灵芝粉中加水，在温度为80℃、功率为100W下超声提取100min，然后在3000rpm下离心25rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4，浓缩液即为得灵芝粗多糖提取液；

3）脱蛋白：将灵芝多糖提取液加入离子液体-无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，然后在30℃下静置分相10h，将上下相分离，将下相装入500kDa透析袋中，于蒸馏水中透析20h以除去盐及其它小分子杂质，即得脱蛋白多糖溶液，备用；

4）脱色：将脱蛋白多糖溶液的浓度调整为6mg/mL、pH为4.5，按料液比为1:30g/mL加入D392阴离子交换树脂，再加入树脂重量0.22‰的脂肪酸甲脂和0.05‰三乙胺，然后在温度为50℃的条件下震荡脱色2.5h，过滤，浓缩，备用；

5）醇沉：将脱色得到的浓缩液中加入4倍体积的97%乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖。

实施例3：

灵芝活性多糖的提取方法，包括原料预处理、灵芝粗多糖提取液制备、脱蛋白、脱色、醇沉，其具体步骤为：

1）原料预处理：将灵芝子实体在60℃的条件下烘干，粉碎后过150目筛，然后用石油醚按料液比为1:4、温度为50℃浸提2次进行脱脂处理，浸提结束后在4000rpm下离心22rnin，沉淀物质在60℃下干燥，即得脱脂灵芝粉；

2）灵芝粗多糖提取液制备：按料液比为1:20向脱脂灵芝粉中加水，在温度为75℃、功率为120W下超声提取90min，然后在4000rpm下离心22rnin，将上清液浓缩至原体积的1/3，浓缩液即为得灵芝粗多糖提取液；

3）脱蛋白：将灵芝多糖提取液加入离子液体-无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，然后在25℃下静置分相12h，将上下相分离，将下相装入400kDa透析袋中，于蒸馏水中透析24h以除去盐及其它小分子杂质，即得脱蛋白多糖溶液，备用；

4）脱色：将脱蛋白多糖溶液的浓度调整为5mg/mL、pH为5.0，按料液比为1:25g/mL加入D392阴离子交换树脂，再加入树脂重量0.25‰的脂肪酸甲脂和0.04‰三乙胺，然后在温度为55℃的条件下震荡脱色2.0h，过滤，浓缩，备用；

5）醇沉：将脱色得到的浓缩液中加入5倍体积的95%乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.灵芝活性多糖的提取方法，包括原料预处理、灵芝粗多糖提取液制备、脱蛋白、脱色、醇沉，其特征在于：所述脱色步骤为：调整脱蛋白多糖溶液的浓度、pH，加入D392阴离子交换树脂，再加入脂肪酸甲脂和三乙胺，震荡脱色，过滤，浓缩，备用。

2.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述脱蛋白多糖溶液的浓度调整为4-6mg/mL、pH为4.5-5.5。

3.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述D392阴离子交换树脂和脱蛋白多糖溶液的料液比为1:20-30g/mL，震荡脱色温度为50-60℃、时间为1.5-2.5h。

4.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述脂肪酸甲脂的添加量为树脂重量的0.22-0.28‰。

5.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述三乙胺的添加量为树脂重量的0.03-0.05‰。

6.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述原料预处理步骤为：将灵芝子实体在50-80℃的条件下烘干，粉碎后过80-200目筛，然后用石油醚按料液比为1:3-5、温度为45-55℃浸提2-3次进行脱脂处理，浸提结束后离心，沉淀物质在50-80℃下干燥，即得脱脂灵芝粉。

7.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述灵芝粗多糖提取液制备步骤为：按料液比为1:17-22向脱脂灵芝粉中加水，在温度为70-80℃、功率为100-150W下超声提取80-100min，离心，将上清液浓缩至原体积的1/4至1/2，浓缩液即为得灵芝粗多糖提取液。

8.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述脱蛋白步骤为：将灵芝多糖提取液加入离子液体-无机盐双水相体系中，振荡得混合体系，然后在20-30℃下静置分相10-15h，将上下相分离，将下相装入350-500kDa透析袋中透析，即得脱蛋白多糖溶液。

9.根据权利要求1所述的灵芝活性多糖的提取方法，其特征在于：所述醇沉步骤为：将脱色得到的浓缩液中加入4-6倍体积的93-97%乙醇溶液，混合均匀，沉淀过夜，离心，干燥，即得灵芝多糖。