CN103073651A - 一种灵芝多糖的提取方法及应用 - Google Patents

一种灵芝多糖的提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种灵芝多糖方法及其应用。本发明采用超声波结合酶法提取灵芝多糖，灵芝粉碎后，通过提取、超滤、浓缩和乙醇沉淀分离获得灵芝多糖。灵芝多糖提取率为3.14-4.21%，分子量在10000道尔顿以下，呈浅棕色，其提取分离方法简单，适宜于工业化生产。所得灵芝多糖具有较强的抗氧化活性和抗癌活性。在DPPH·自由基体系中，灵芝多糖的IC50为0.28-0.43mg/mL，ORAC值可达1207.66-1777.90μmolTrolox/g。灵芝多糖浓度为2mg/ml时，对人肺癌细胞A549的抑制率可达53.04-68.37%，可以用于制备抗癌药物。

Description

一种灵芝多糖的提取方法及应用
技术领域
本发明涉及灵芝深加工技术，具体是灵芝多糖的提取方法及应用。
背景技术
灵芝(Ganoderma Lucidum)，为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是拥有数千年药用历史的珍贵药材。《神农本草经》记载，灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效。现代医学研究表明，灵芝具有抗肿瘤、增强免疫功能、降血糖、保肝、抗衰老、抗炎、抗凝血等多种药理作用。灵芝多糖作为灵芝的主要有效成分之一，近年来逐渐受到研究人员的重视。如北京世纪博康医药科技有限公司（中国专利申请号200810119495.4）公开一种应用于防治肝损伤、调节免疫力的灵芝多糖组合物；中国科学院上海药物研究所（中国专利申请号03116403.X）公开一种灵芝多糖的制备方法及其在免疫促进方面的应用；北京大学（中国专利申请号200410006198.0）公开一种用于预防、改善或治疗失眠症的灵芝多糖组合物等。
随着全球癌症发病率和死亡率的急剧上升，科研工作者进行了大量相关的研究工作以对抗癌症。其中研发生物活性高且毒性低的新型抗癌药物是一个非常活跃的领域。传统的癌症治疗常常对正常细胞也有毒性作用，并且可引发一系列的副反应，而从植物、微生物、海产品中提取的天然多糖不但有较高的生物活性，而且非常安全。灵芝多糖具有良好的抗肿瘤和增强免疫活性活性。如福州绿谷生物药业技术研究所（中国专利申请号200510095532.9）公开一种灵芝多糖的制备方法及其抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长、促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用，（中国专利申请号03116403.X）公开灵芝多糖蛋白的制备方法及其对裸鼠异种人肺癌PG细胞增殖的抑制作用。但暂未有关于灵芝多糖对人肺癌细胞A549抑制作用的报道。
发明内容
本发明的目的是填补目前关于应用灵芝多糖抑制人肺癌细胞A549方面的空白，提供一种灵芝多糖的提取方法及应用。将本发明的灵芝多糖加入到A549细胞培养液中，可显著抑制A549细胞增殖，具有正面作用。
本发明同时提供了所述灵芝多糖在抑制人肺癌细胞A549增殖中的具体应用。
本发明的目的通过如下技术方案予以实现：
一种灵芝多糖的提取方法，其包括如下步骤：
（1）灵芝粉碎后加乙醇，微沸提取3-5小时，过滤得灵芝渣，30-60℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）灵芝粉加入有机酸溶液，加入酶，超声条件下提取20-60分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/5-1/3，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后，在0-4℃下静置8-14小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖。 
进一步优化的，步骤（1）所述乙醇为95%乙醇。
进一步优化的，步骤（2）所述有机酸为柠檬酸或苹果酸的一种，且溶液的pH值为1.5-3，其用量为灵芝粉重量的20-40倍。
进一步优化的，步骤（2）所述酶为真菌酸性蛋白酶，酶的加入量为灵芝粉质量的0.5-2%。
进一步优化的，步骤（2）所述超声功率为320W-640W，超声温度为30-70℃。
进一步优化的，步骤（5）所述乙醇添加量为
混合均匀后乙醇最终浓度为50-70%（v/v）。
进一步优化的，步骤（6）所述冷冻干燥得浅棕色灵芝多糖，溶于水。
上述制备方法制得的灵芝多糖的应用是，在DMEM培养液中培养人肺癌细胞A549，加入0.2-2mg/ml灵芝多糖，可显著抑制A549细胞增殖（通过MTT实验评价灵芝多糖对A549细胞增值作用）。
本发明上述制备方法制得的灵芝多糖可以进一步用于制备抗癌药物。所述灵芝多糖能抑制人肺癌细胞A549增殖。灵芝多糖浓度为2mg/ml时，对人肺癌细胞A549的抑制率可达53.04-68.37%。
本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明提供了一种灵芝多糖的提取方法及应用，将本发明的灵芝多糖加入到A549细胞培养液中，可显著抑制A549细胞增殖，具有正面作用。
2、本发明发现提取过程中添加真菌酸性蛋白酶，所得灵芝多糖提取率与传统水提法接近，但可大幅缩短提取时间、降低能耗，同时抗氧化效果也较传统水提法好。
具体实施方式
下面结合实施例和附表对本发明的具体实施作进一步说明。
实施例1
（1）灵芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取3小时，过滤得灵芝渣，40℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）取50g灵芝粉置于容器中，与去离子水1:30混合均匀，采用传统水提法，微沸提取3小时，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/3，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入95%乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为70%（v/v），在4℃下静置12小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖1#。
灵芝多糖的提取率为3.96%，在DPPH·自由基体系中，其IC50为0.68mg/mL，ORAC值为1083.24μmolTrolox/g，灵芝多糖1#呈浅棕色。
实施例2
（1）灵芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取3小时，过滤得灵芝渣，40℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）取50g灵芝粉置于容器中，与pH值为3的柠檬酸溶液1:30混合均匀，加入1.5%（物料）真菌酸性蛋白酶，超声功率为640W，超声温度为70℃，提取60分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/3，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入95%乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为70%（v/v），在4℃下静置12小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖2#。
灵芝多糖的提取率为4.21%，在DPPH·自由基体系中，其IC50为0.28mg/mL，ORAC值为1207.66μmolTrolox/g，灵芝多糖2#呈黄褐色。
 
实施例3
（1）灵芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取4小时，过滤得灵芝渣，60℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）取50g灵芝粉置于容器中，与pH值为2的柠檬酸溶液1:25混合均匀，加入0.5%（物料）真菌酸性蛋白酶，超声功率为320W，超声温度为50℃，提取40分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/4，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入95%乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为60%（v/v），在0℃下静置8小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖3#。
灵芝多糖的提取率为3.36%，在DPPH·自由基体系中，其IC50为0.41mg/mL，ORAC值为1734.30μmolTrolox/g，灵芝多糖3#呈浅褐色。
 
实施例4
（1）灵芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取5小时，过滤得灵芝渣，50℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）取50g灵芝粉置于容器中，与pH值为1.5的苹果酸溶液1:20混合均匀，加入2%（物料）真菌酸性蛋白酶，超声功率为480W，超声温度为30℃，提取50分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/5，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入95%乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为50%（v/v），在4℃下静置10小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖4#。
灵芝多糖的提取率为3.85%，在DPPH·自由基体系中，其IC50为0.34mg/mL，ORAC值为1540.48μmolTrolox/g，灵芝多糖4#呈黄棕色。
 
实施例5
（1）灵芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取4小时，过滤得灵芝渣，30℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）取50g灵芝粉置于容器中，与pH值为2的苹果酸溶液1:40混合均匀，加入1%（物料）真菌酸性蛋白酶，超声功率为560W，超声温度为40℃，提取30分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/4，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入95%乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为55%（v/v），在0℃下静置14小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖5#。
灵芝多糖的提取率为3.79%，在DPPH·自由基体系中，其IC50为0.36mg/mL，ORAC值为1592.94μmolTrolox/g灵芝多糖5#呈黄褐色。
表1 产品与抗氧化剂ORAC值比较
Figure 878225DEST_PATH_IMAGE002
由表1可见，提取过程中添加真菌酸性蛋白酶的灵芝多糖，其抗氧化效果（以ORAC值计）明显优于提取过程中未添加真菌酸性蛋白酶的灵芝多糖。
表2 不同浓度灵芝多糖对A549细胞增殖的抑制效果
Figure 742275DEST_PATH_IMAGE004
注：该表内数据为平均值±标准偏差(n=3)
由表2可见，提取过程中添加真菌酸性蛋白酶的灵芝多糖，其对A549细胞增殖的抑制效果（灵芝多糖2#-5#）明显优于提取过程中未添加真菌酸性蛋白酶的灵芝多糖（灵芝多糖1#）。

Claims (8)

1.一种灵芝多糖的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）灵芝粉碎后加乙醇，微沸提取3-5小时，过滤得灵芝渣，30-60℃下烘干得灵芝粉备用；
（2）灵芝粉加入有机酸溶液，加入酶，超声条件下提取20-60分钟，过滤得提取液；
（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量10000道尔顿的膜进行超滤，收集透过液部分；
（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/5-1/3，得浓缩液；
（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后，在0-4℃下静置8-14小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；
（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得灵芝多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述乙醇为95%乙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述有机酸为柠檬酸或苹果酸的一种，且溶液的pH值为1.5-3，其用量为灵芝粉重量的20-40倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述酶为真菌酸性蛋白酶，酶的加入量为灵芝粉质量的0.5-2%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）所述超声功率为320W-640W，超声温度为30-70℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）所述乙醇添加量为
混合均匀后乙醇最终浓度为50-70%（v/v）。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（6）所述冷冻干燥得浅棕色灵芝多糖，溶于水。
8.根据权利要求1所述的灵芝多糖的应用，其特征在于在DMEM培养液中培养人肺癌细胞A549，加入0.2-2mg/ml灵芝多糖，显著抑制A549细胞增殖。
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