CN106478832A - 一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，具体包括如下步骤：（1）、制备预处理磁珠，（2）、制备磁珠受体偶联物，（3）、灵芝提取物的预处理，（4）、制备磁珠受体灵芝多糖偶联物，（5）、磁珠受体多糖偶联物的裂解，（6）、抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化；所述抗雾霾护肺灵芝多糖中的灵芝多糖含量为95%以上。本发明的抗雾霾护肺灵芝多糖弥补了现有防治雾霾性肺系疾病的产品效果不理想、使用不方便等问题；抗雾霾护肺灵芝多糖是直接靶向肺部炎性受体的多糖，多糖靶点明确；本发明的制备方法通过磁场分离、受体识别及膜分离，避免了有机溶剂残留等问题，将促进灵芝提取物在保健品、药品等领域的应用。

Description

一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法
技术领域
本发明属于抗雾霾护肺提取物的制备技术领域，具体为一种抗雾霾护肺灵芝提取物的制备方法。
技术背景
雾霾是特定气候条件与人类活动相互作用的结果。近几年，我国雾霾污染问题日趋严重，在京津冀、长三角等区域均发生过大范围复合型雾霾污染事件。在2013年12月的长三角区域，城市空气质量平均超标天数达81.6％，重度和严重污染达到34.6％，高于全国74个城市10.1％。随着工业化、城镇化进程的加快，雾霾在全国范围内频繁发生。雾霾不仅对人们的日常生活及出行带来不便，也对人类的健康造成了极大的威胁。据报道，中国每年因雾霾而造成的呼吸系统门诊病例在35万人以上，而且呈逐年增加之势。据不完成统计，雾霾包含有数百种大气颗粒物，其中对人体健康危害较大是由空气中的灰尘、硫酸、硝酸以及有机碳氢化合物等组成的直径小于10μm的气溶胶粒子，这种粒子可随呼吸而进入支气管、细支气管最后沉降于肺泡，引起支气管炎、肺炎，促发哮喘，加重慢支和肺气肿等急慢性呼吸道疾病，甚至会诱发心脏病和癌症。虽然国家已经开始着手治理雾霾的污染，但是短时间内还不能得到根本性好转，雾霾天气仍不时出现，甚至更加严重。可见，探索、研究抗雾霾制品对保护人体健康具有重要的现实意义。
肺脏在五脏六腑之中位居最高，经由口鼻等器官与外界环境相通，具有覆盖和保护各脏器、抵御外邪的作用，故雾霾首先侵袭肺脏，致使肺气失宣，气机失调，从而出现咳嗽、咳痰等症状，严重者会发展为肺癌，甚至会诱发心脏病和癌症。为了减缓和防止雾霾对肺脏的损害，当前有以下主要措施：①带口罩。口罩对进入肺部的空气有一定的过滤作用，但人们无法24小时佩戴口罩，也不是所有人都适合戴口罩，而且还要注意选择有效的防护口罩，并正确使用；而且口罩不宜长期戴，否则会使鼻粘膜变得脆落而丧失鼻腔的原有生理功能。②依赖清肺食物。虽然多样化的均衡饮食对提高身体对抗各种环境不利因素的能力有益，但清肺食物从消化道进入体内，经过胃肠被消化分解成小分子，小分子穿过小肠绒毛进入血液，然后被运送到人体各处的细胞中。对比空气颗粒物与食物在体内的动向，会发现食物跟那些大于0.1微米的颗粒几乎完全没有见面的机会，自然也就无法“清除”。而那些进入血液的极其“细小”的微粒，在食物的小分子面前依然还是庞然大物，靠这些食物的小分子去清除粉尘也就只是美好的想象，“清肺”食物功效有限。③服用中药。中医把“雾霾”看做是自然界中一种“浊气”，认为雾霾的病性是由于湿、浊与风、寒、热邪结合所引发。清肺、润肺、养肺这些中医术语，是针对不同病症来使用的。清肺主要针对热邪伤肺的病症，润肺主要针对燥邪伤肺的病症，养肺主要针对肺气亏虚的病症。事实上，人们遇到同样的空气污染，不同的人表现也不太相同，对于具体某个人来说，究竟用清肺、润肺，还是养肺的药物，也当因人而异，需由医生进行专业指导。可见，寻找一种安全高效、使用方便的抗雾霾护肺制品对防治雾霾引发的肺系疾病具有重要的实践意义。
现代医学认为，雾霾致肺系疾病，一方面是雾霾悬浮物质尤其是直径小于10μm的气溶胶粒子进入支气管、细支气管最后沉降于肺泡，刺激呼吸道，引起气道炎症，加重呼吸道疾病；另一方面，黏附在PM2.5的小颗粒上的细菌、病毒亦进入呼吸道，诱发感染，引起炎症，加重慢支和肺气肿等急慢性呼吸道疾病。简单地说，当雾霾入侵人体时,肺部细胞中的“情报系统”会自动传递“敌情”，使免疫系统产生炎症因子，抵御病原体。“情报”扩散愈多炎症因子出动也愈多。如果“敌情”被夸大就会引起“过激”免疫反应。实际上,许多炎症的发生与免疫反应不平衡有关。可见，保持免疫平衡才是避免疾病的发生和发展的主要且重要措施。
科学研究和养生实践证明，灵芝是人体系统平衡最佳的调节剂，它不同于一般药物只对某种疾病起治疗作用，亦不同于一般营养保健食品只对某一方面营养素的不足进行补充和强化，而是在整体上双向调节人体功能平衡，平衡机体免疫能力，促使内脏器官功能正常化。灵芝的临床应用涉及免疫、呼吸、消化等各个系统，但灵芝制剂制备工艺的不同及提取部位的不同均会影响灵芝的疗效与用途。本发明将提供一种抗雾霾护肺灵芝多糖及其制备方法，用于的雾霾致肺系疾病的预防与治疗。
发明内容
为了解决现有防治雾霾性肺系疾病的产品效果不理想、使用不方便等问题，本发明提供一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法。
一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备操作步骤如下：
(1)用乙二胺四乙酸溶液和磷酸缓冲液悬浮处理磁珠，得到预处理磁珠；
(2)用受体蛋白溶液处理预处理磁珠，制得磁珠受体偶联物；
(3)用灵芝提取物溶液处理预处理磁珠，制得多糖供体液；
(4)将磁珠受体偶联物与多糖供体液在孵育液中进行孵育，得到磁珠受体多糖偶联物；
(5)将磁珠受体多糖偶联物用裂解液处理，得到磁珠受体偶联物和灵芝多糖初液；磁珠受体偶联物回步骤(4)重复利用；
(6)将灵芝多糖初液上柱洗脱、超滤膜浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥，得到抗雾霾护肺灵芝多糖；
所述抗雾霾护肺灵芝多糖中的灵芝多糖含量为95％以上。
进一步限定的技术条件如下：
所述受体蛋白溶液由肺组织toll-4受体蛋白和所述偶联液配制成的质量浓度2～5mg/ml的toll-4受体蛋白溶液。
所述灵芝提取物为灵芝多糖质量百分比大于25％的市售灵芝提取物或通过常规水提醇沉法或超声辅助水提醇沉法获得的灵芝多糖质量百分比大于25％的灵芝提取物。
所述灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的灵芝提取物溶液。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：(1)本发明弥补了现有防治雾霾性肺系疾病的产品效果不理想、使用不方便等问题，提供了抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法；(2)本发明提供的方法获得的灵芝多糖是直接靶向肺部炎性受体的多糖，多糖靶点明确，活性灵芝多糖含量达到95％以上；(3)本发明的制备方法通过磁场分离、受体识别及膜分离，避免了有机溶剂残留等问题，将促进灵芝提取物在保健品、药品等领域的应用。
本发明中糖的测定采用蒽酮比色法，在试管中加入一定的样品和水，使其总体积为1ml，再加入蒽酮试剂5ml，沸水浴中煮沸10min，取出试管，用自来水冷却，室温放置10min后，在620nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算糖含量。
附图说明
图1为本发明抗雾霾护肺灵芝多糖的制备工艺流程。
图2为本发明制备的灵芝多糖对雾霾肺性疾病小鼠肺组织病理学修复图。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施方式对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这些示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。
以下实施例所用原料的来源说明如下：粒径1～10微米的磁珠购于美国Bioclone公司；肺组织toll-4受体蛋白购于美国R&D system公司；灵芝提取物购于西安森冉生物工程有限公司，多糖含量50％；昆明小鼠购于安徽省医科大学动物研究中心；配制培养基所用化学试剂为国产分析纯。
实施例1：
参见图1，一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备操作步骤如下：
步骤(1)制备预处理磁珠
先将粒径为1微米的磁珠3.1kg置于反应釜中，加入浓度292g/l的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液形成第一磁珠悬液，且第一磁珠悬液的浓度为30mg/ml，悬浮1h；接着将反应釜置于磁力釜中分离3min，取出反应釜，弃去上清液；再向反应釜中加入磷酸缓冲液形成第二磁珠悬液，使第二磁珠悬液的浓度为30mg/ml，悬浮1h，接着将反应釜置于磁力釜中分离3min，取出反应釜，弃去上清液；重复上述操作2次，得到3.05kg预处理磁珠。
磷酸缓冲液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1L制得。
步骤(2)制备磁珠受体偶联物
先将预处理磁珠1.5kg置于反应釜中，加入偶联液50L，使预处理磁珠的含量为30mg/ml；接着加入受体蛋白溶液2L，在温度20℃、搅拌转速100r/min条件下偶联60h；再将反应釜置于磁力釜中分离5min，取出反应釜，弃去上清液，通过检测上清液中280nm处吸光值监控偶联率，得到磁珠受体偶联物1.504kg。
偶联液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
所述受体蛋白溶液为用偶联液配制成的质量浓度2mg/ml的受体蛋白溶液；
步骤(3)灵芝提取物的预处理
先将预处理磁珠1.5kg置于反应釜中，加入偶联液50L，调整预处理磁珠浓度为30mg/ml；接着加入灵芝提取物溶液3.33L，在温度20℃、搅拌转速100r/min条件下偶联60h，以去除灵芝提取物中能与预处理磁珠偶联的多糖；再将反应釜置于磁力釜中分离5min，取出反应釜，收集上清液，即得到多糖供体液53.31L。
偶联液与步骤(2)中所述偶联液相同。
灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的质量浓度为5mg/ml的灵芝提取物溶液。
步骤(4)制备磁珠受体多糖偶联物
先将磁珠受体偶联物1.504kg置于反应釜中，加入孵育液37.6L，调整磁珠受体偶联物浓度为40mg/ml；接着加入多糖供体液10L，在温度30℃、搅拌转速50r/min条件下孵育18h；再将反应釜置于磁力釜中分离5min，取出反应釜，弃去上清液，通过蒽酮比色法检测上清液中糖含量监控孵育率，得到磁珠受体多糖偶联物1.506kg。
所述孵育液是将7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至6.5，再加蒸馏水定容至1L制得。
步骤(5)磁珠受体多糖偶联物的裂解
将磁珠受体多糖偶联物1.506kg置于反应釜中，加入裂解液75.4L，调整磁珠受体多糖偶联物浓度为20mg/ml，在温度20℃、搅拌转速100r/min条件下裂解36h；再将反应釜置于磁力釜中分离5min，得到1.504kg磁珠受体偶联物和75.5L上清液；其中磁珠受体偶联物与步骤2制得的磁珠受体偶联物是同一物质，收集上清液备用。
取步骤(5)得到的1.504kg kg磁珠受体偶联物和步骤(3)中剩余的10升多糖供体液按步骤(4)继续操作，得到磁珠受体多糖偶联物2.976kg；再按步骤(5)继续操作，新得到1.504kg磁珠受体偶联物和75.5L上清液；收集上清液备用；用新得到磁珠受体偶联物重复步骤(4)和(5)五次，直到用完步骤(3)剩余的多糖供体液为止；
收集合并的上清液385L，即为灵芝多糖初液385L。
步骤(6)抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化
取灵芝多糖初液385升，上Bio-Gel P4柱，用1ml/min去离子水洗脱，通过蒽酮比色法检测洗脱液中糖含量监控洗脱效果，收集洗脱液；最后将洗脱液用截留分子量为1000Da的超滤膜浓缩，超滤浓缩液冷冻干燥，得到抗雾霾护肺灵芝多糖6.783g。
裂解液由1.0g Tween-20、27.22g三水醋酸钠和11.5ml醋酸，溶于800ml蒸馏水中，用醋酸调节溶液的pH值至4.4，最后加蒸馏水定容至1L制得。
本实施例中使用的灵芝提取物购于西安森冉生物工程有限公司，多糖含量50％。
实施例2：
步骤(1)制备预处理磁珠
先将粒径为10微米的磁珠4.5kg置于反应釜中，加入浓度585g/l的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液形成第一磁珠悬液，且第一磁珠悬液的浓度为40mg/ml，悬浮2h；接着将反应釜置于磁力釜中分离5min，取出反应釜，弃去上清液；再向反应釜中加入磷酸缓冲液形成第二磁珠悬液，使第二磁珠悬液的浓度为40mg/ml，悬浮2h，接着将反应釜置于磁力釜中分离5min，取出反应釜，弃去上清液；重复上述操作3次，得到预处理磁珠4.4kg。
所述磷酸缓冲液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1L制得。
步骤(2)制备磁珠受体偶联物
先将预处理磁珠2kg置于反应釜中，加入偶联液50L，使预处理磁珠的含量为40mg/ml；接着加入受体蛋白溶液1.7L，在温度25℃、搅拌转速150r/min条件下偶联72h；再将反应釜置于磁力釜中分离10min，取出反应釜，弃去上清液，通过检测上清液中280nm处吸光值监控偶联率，得到磁珠受体偶联物2.008kg。
所述偶联液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
所述受体蛋白溶液为用偶联液配制成的质量浓度5mg/ml的受体蛋白溶液。
步骤(3)灵芝提取物的预处理
先将预处理磁珠2kg置于反应釜中，加入偶联液50L，调整预处理磁珠浓度为40mg/ml；接着加入灵芝提取物溶液2.5L，在温度25℃、搅拌转速150r/min条件下偶联72h，以去除灵芝提取物中能与预处理磁珠偶联的多糖；再将反应釜置于磁力釜中分离10min，取出反应釜，收集上清液，即得到多糖供体液52.49L。
所述偶联液与步骤(2)中所述偶联液相同。
所述灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的质量浓度为10mg/ml的灵芝提取物溶液。
步骤(4)制备磁珠受体多糖偶联物
先将磁珠受体偶联物2.008kg置于反应釜中，加入孵育液40.2L，调整磁珠受体偶联物浓度为50mg/ml；接着加入多糖供体液18L，在温度35℃、搅拌转速100r/min条件下孵育24h；再将反应釜置于磁力釜中分离10min，取出反应釜，弃去上清液，通过蒽酮比色法检测上清液中糖含量监控孵育率，得到磁珠受体多糖偶联物2.016kg；
所述孵育液是将7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1L制得；
步骤(5)磁珠受体多糖偶联物的裂解
将磁珠受体多糖偶联物2.016kg置于反应釜中，加入裂解液67L，调整磁珠受体多糖偶联物浓度为30mg/ml，在温度25℃、搅拌转速150r/min条件下裂解48h；再将反应釜置于磁力釜中分离10min，得到2.008kg磁珠受体偶联物和67.1L上清液；其中磁珠受体偶联物与步骤2制得的磁珠受体偶联物是同一物质，收集上清液备用。
取步骤(5)得到的2.008kg磁珠受体偶联物和步骤(3)剩余中的18升多糖供体液按步骤(4)继续操作，得到磁珠受体多糖偶联物2.016kg；再按步骤(5)继续操作，新得到2.008kg磁珠受体偶联物和67.1L上清液；收集上清液备用；用新得到磁珠受体偶联物重复步骤(4)和(5)二次，直到用完步骤(3)剩余的多糖供体液为止；
收集合并的上清液205L，即为灵芝多糖初液205L。
步骤(6)抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化
取灵芝多糖初液205L，上Bio-Gel P6柱，用2ml/min去离子水洗脱，通过蒽酮比色法检测洗脱液中糖含量监控洗脱效果，收集洗脱液；最后将洗脱液用截留分子量为2000Da的超滤膜浓缩，超滤浓缩液喷雾干燥后，即得到抗雾霾护肺灵芝多糖6.013g；
所述裂解液由1.0g Tween-20、27.22g三水醋酸钠和11.5ml醋酸，溶于800ml蒸馏水中，用醋酸调节溶液的pH值至5.0，最后加蒸馏水定容至1L制得。
本实施例中使用的灵芝提取物采用常规的水提醇沉法获得，多糖含量30％。常规的水提醇沉法的工艺参数为水与灵芝粉的质量体积比为1︰30，浸提温度85℃，浸提时间24h，离心取上清液；上清液减压浓缩后加95％乙醇至体系酒精浓度为80％，乙醇沉淀48小时，离心获得沉淀即灵芝提取物，多糖含量35％。
实施例3：
步骤(1)制备预处理磁珠
先将粒径为5微米的磁珠4.1kg置于反应釜中，加入浓度450g/l的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液形成第一磁珠悬液，且第一磁珠悬液的浓度为35mg/ml，悬浮1.5h；接着将反应釜置于磁力釜中分离4min，取出反应釜，弃去上清液；再向反应釜中加入磷酸缓冲液形成第二磁珠悬液，使第二磁珠悬液的浓度为35mg/ml，悬浮1.5h，接着将反应釜置于磁力釜中分离4min，取出反应釜，弃去上清液；重复上述操作3次，得到预处理磁珠4.0kg。
所述磷酸缓冲液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1L制得。
步骤(2)制备磁珠受体偶联物
先将预处理磁珠1.96kg置于反应釜中，加入偶联液56L，使预处理磁珠的含量为35mg/ml；接着加入受体蛋白溶液2L，在温度22℃、搅拌转速125r/min条件下偶联66h；再将反应釜置于磁力釜中分离8min，取出反应釜，弃去上清液，通过检测上清液中280nm处吸光值监控偶联率，得到磁珠受体偶联物1.965kg。
偶联液由7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1L制得。
所述受体蛋白溶液为用偶联液配制成的质量浓度2.5mg/ml的受体蛋白溶液。
步骤(3)灵芝提取物的预处理
先将预处理磁珠1.96kg置于反应釜中，加入偶联液56L，调整预处理磁珠浓度为35mg/ml；接着加入灵芝提取物溶液3.1L，在温度22℃、搅拌转速125r/min条件下偶联66h，以去除灵芝提取物中能与预处理磁珠偶联的多糖；再将反应釜置于磁力釜中分离8min，取出反应釜，收集上清液，即得到多糖供体液59L。
所述偶联液与步骤(2)中所述偶联液相同。
所述灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的质量浓度为8mg/ml的灵芝提取物溶液。
步骤(4)制备磁珠受体多糖偶联物
先将磁珠受体偶联物1.965kg置于反应釜中，加入孵育液44L，调整磁珠受体偶联物浓度为45mg/ml；接着加入多糖供体液16L，在温度32℃、搅拌转速80r/min条件下孵育22h；再将反应釜置于磁力釜中分离8min，取出反应釜，弃去上清液，通过蒽酮比色法检测上清液中糖含量监控孵育率，得到磁珠受体多糖偶联物1.968kg。
所述孵育液是将7.9g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.8g磷酸氢二钾(K2HPO4)溶于800ml蒸馏水中，用浓度为3.65g/L的盐酸(HCl)溶液调节pH值至6.8，再加蒸馏水定容至1L制得。
步骤(5)磁珠受体多糖偶联物的裂解
将磁珠受体多糖偶联物1.968kg置于反应釜中，加入裂解液79L，调整磁珠受体多糖偶联物浓度为25mg/ml，在温度22℃、搅拌转速125r/min条件下裂解42h；再将反应釜置于磁力釜中分离8min，得到1.965kg磁珠受体偶联物和78.9L上清液；其中磁珠受体偶联物与步骤2制得的磁珠受体偶联物是同一物质，收集上清液备用。
取步骤(5)得到的1.965kg磁珠受体偶联物和步骤(3)剩余中的16升多糖供体液按步骤(4)继续操作，得到磁珠受体多糖偶联物1.968kg；再按步骤(5)继续操作，新得到1.965kg磁珠受体偶联物和78.9L上清液；收集上清液备用；用新得到磁珠受体偶联物重复步骤(4)和(5)三次，用完步骤(3)剩余的多糖供体液为止；
收集合并的上清液675L，即为灵芝多糖初液290L。
步骤(6)抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化
取灵芝多糖初液290L，上Bio-Gel P6柱，用1.5ml/min去离子水洗脱，通过蒽酮比色法检测洗脱液中糖含量监控洗脱效果，收集洗脱液；最后将洗脱液用截留分子量为1500Da的超滤膜浓缩，超滤浓缩液冷冻干燥后，即得到抗雾霾护肺灵芝多糖8.471g。
所述裂解液由1.0g Tween-20、27.22g三水醋酸钠和11.5ml醋酸，溶于800ml蒸馏水中，用醋酸调节溶液的pH值至4.8，最后加蒸馏水定容至1L制得。
本实施例中使用的灵芝提取物采用超声辅助水提醇沉法获得，多糖含量45％。超声辅助水提醇沉法的工艺参数为水与灵芝粉的质量体积比为1︰30，超声功率500W，超声温度85℃，超声时间4h，离心取上清液；上清液减压浓缩后加95％乙醇至体系酒精浓度为80％，乙醇沉淀48小时，离心获得沉淀即灵芝提取物，多糖含量45％。
实施例4
本发明的动物实验情况说明如下：
步骤1动物分组及给药方法：参考韩帅等(韩帅，唐宇，李坤，陈壬贤，周小丽，包熙鸿，刘木清.模拟雾霾条件下光源的透过性实验研究.照明工程学报，2014,25(5):111-115)的报道建立雾霾条件。将100只健康雌雄性昆明小鼠随机分为对照组，模型组，灵芝多糖、高、低剂量组5组，每组20只，雌雄各半。对照组每日口鼻部暴露于清洁的空气环境中，喂养4周；模型组每日口鼻部暴露于模拟雾霾条件环境中1小时，喂养4周；灵芝多糖、高、低剂量组5组每日口鼻部暴露于模拟雾霾条件环境中1小时，但暴露1小时灌胃给予3.0g/kg、1.5g/kg、0.3g/kg灵芝多糖，喂养4周；
步骤2取样：取喂养4周的各组小鼠，禁食12h，陈体重，眼球取血(0.5-1.0ml/只)后置于普通血清管中，静置2小时以上，以3000rpm、4℃离心10分钟，取血清于1.5ml离心管中，-80℃保存；采血完毕后解剖取出肺组织，记录重量后用液氮速冻存于-80℃冰箱；取肺放入固定液中固定，脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织的病理变化；
步骤3灵芝多糖抗雾霾性肺系疾病的防治效果分析：小鼠在模拟雾霾暴露4周后，出现明显的炎症反应，肺泡间隔大量断裂，肺泡腔明显增大，肺气肿形成，部分病变部位可见肺大疱形成。从表1可以看出，模型组MLT及DI值均较正常对照组及灵芝多糖组高，且灵芝多糖组MLT与模型组存在显著性差异(P<0.05)，灵芝多糖高剂量组MLTDI亦与模型组存在显著性差异(P<0.05)；而模型组平均肺泡隔厚度(MAST)较正常对照组及灵芝多糖组低；灵芝多糖高、低、中剂量组的肺系指数均接近正常组。从附图2可以看出，发现正常对照组也存在轻微的炎症反应，模型组有严重的炎症反应，肺泡壁内被炎性细胞浸润，肺组织基本实化，肺泡结构严重破坏。灵芝多糖组虽然仍存在部分区域肺泡不均匀扩张，肺泡间隔断裂，扩张的肺泡融合成较大的囊腔，但它们的炎症反应均有所减轻，较之其他组，灵芝多糖高剂量组的炎症反应明显减轻，部分肺泡壁有炎性细胞浸润，肺泡壁较完好，肺泡结构较正常。
表1小鼠肺组织评分、MLT、MAST、DI比较(mean±SD)
*表示与模型组比较，P<0.05，差异有统计学意义
图2中NC、MC、GL-h、GL-m、GL-l分别表示正常组、模型组、灵芝多糖高剂量组、灵芝多糖中剂量组、灵芝多糖低剂量组。
综合表1和附图2结果表明，与模型组相比，本发明方法制备的灵芝多糖对抗雾霾性肺系损伤有显著的治疗效果。

Claims (7)

1.一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）用乙二胺四乙酸溶液和磷酸缓冲液悬浮处理磁珠，得到预处理磁珠；
（2）用受体蛋白溶液处理预处理磁珠，制得磁珠受体偶联物；
（3）用灵芝提取物溶液处理预处理磁珠，制得多糖供体液；
（4）将磁珠受体偶联物与多糖供体液在孵育液中进行孵育，得到磁珠受体多糖偶联物；
（5）将磁珠受体多糖偶联物用裂解液处理，得到磁珠受体偶联物和灵芝多糖初液；磁珠受体偶联物回步骤（4）重复利用；
（6）将灵芝多糖初液上柱洗脱、超滤膜浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥，得到抗雾霾护肺灵芝多糖；
所述抗雾霾护肺灵芝多糖中的灵芝多糖含量为95%以上。
2.根据权利要求1所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）、制备预处理磁珠
先将磁珠置于反应釜中，加入浓度292~585g/l的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液形成第一磁珠悬液，且第一磁珠悬液的浓度为30~40 mg/ml，悬浮1~2 h；接着将反应釜置于磁力釜中分离3~5 min，取出反应釜，弃去上清液；再向反应釜中加入磷酸缓冲液形成第二磁珠悬液，使第二磁珠悬液的浓度为30~40 mg/ml，悬浮1~2 h，接着将反应釜置于磁力釜中分离3~5min，取出反应釜，弃去上清液；重复上述操作2~3次，得到预处理磁珠；
所述磷酸缓冲液由7.9g 氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g 磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1 L制得；
（2）、制备磁珠受体偶联物
先将预处理磁珠置于反应釜中，加入偶联液，使预处理磁珠的含量为30~40 mg/ml；接着加入受体蛋白溶液，加入量按体积比受体蛋白溶液︰偶联液=1︰25~1︰30，在温度20~25℃、搅拌转速100~150 r/min条件下偶联60~72h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，弃去上清液，通过检测上清液中280nm处吸光值监控偶联率，得到磁珠受体偶联物；
所述偶联液由7.9g 氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g 磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g 磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至7.0，再加蒸馏水定容至1 L制得；
所述受体蛋白溶液为用偶联液配制成的质量浓度2~5 mg/ml 的受体蛋白溶液；
（3）、灵芝提取物的预处理
先将预处理磁珠置于反应釜中，加入偶联液，调整预处理磁珠浓度为30~40 mg/ml；接着加入灵芝提取物溶液，加入量按体积比灵芝提取物︰偶联液=1︰15~1︰20，在温度20~25℃、搅拌转速100~150 r/min条件下偶联60~72h，以去除灵芝提取物中能与预处理磁珠偶联的多糖；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，收集上清液，即得到多糖供体液；
所述偶联液与步骤（2）中所述偶联液相同；
所述灵芝提取物溶液为用灵芝提取物和偶联液配制成的质量浓度为5~10 mg/ml 的灵芝提取物溶液；
（4）、制备磁珠受体多糖偶联物
先将磁珠受体偶联物置于反应釜中，加入孵育液，调整磁珠受体偶联物浓度为40~50mg/ml；接着加入多糖供体液，加入量按体积比受体蛋白溶液︰多糖供体液=1︰5~1︰10，在温度30~35 ℃、搅拌转速50~100 r/min条件下孵育18~24h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，取出反应釜，弃去上清液，通过蒽酮比色法检测上清液中糖含量监控孵育率，得到磁珠受体多糖偶联物；
所述孵育液是将7.9g氯化钠（NaCl）、0.2g氯化钾（KCl）、0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4）和1.8g磷酸氢二钾（K2HPO4）溶于800 ml 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调节pH值至6.5~7.0，再加蒸馏水定容至1 L制得；
（5）、磁珠受体多糖偶联物的裂解
将磁珠受体多糖偶联物置于反应釜中，加入裂解液，调整磁珠受体多糖偶联物浓度为20~30 mg/ml，在温度20~25 ℃、搅拌转速100~150 r/min条件下裂解36~48h；再将反应釜置于磁力釜中分离5~10 min，得到磁珠受体偶联物和上清液；磁珠受体偶联物回步骤（4）重复利用；取上清液即得到灵芝多糖初液；
所述裂解液由1.0g Tween-20、27.22g三水醋酸钠和11.5ml 醋酸，溶于800 ml 蒸馏水中，用醋酸调节溶液的pH值至4.4~5.0，最后加蒸馏水定容至1 L制得；
（6）、抗雾霾护肺灵芝多糖的纯化
取灵芝多糖初液，上Bio-Gel柱，用1~2 ml/min去离子水洗脱，通过蒽酮比色法检测洗脱液中糖含量监控洗脱效果，收集洗脱液；最后将洗脱液用截留分子量为1000~2000 Da的超滤膜浓缩，超滤浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥后，即得到抗雾霾护肺灵芝多糖。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于：所述磁珠为粒径1～10微米的磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于：所述受体蛋白溶液由肺组织toll-4受体蛋白和所述偶联液配制成的质量浓度2~5 mg/ml 的toll-4受体蛋白溶液。
5.根据权利要求1所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于：所述灵芝提取物为灵芝多糖质量百分比大于25%的市售灵芝提取物或通过常规水提醇沉法或超声辅助水提醇沉法获得的灵芝多糖质量百分比大于25%的灵芝提取物。
6.根据权利要求2所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述Bio-Gel柱为Bio-Gel P4柱或Bio-Gel P6柱。
7.根据权利要求2所述的一种抗雾霾护肺灵芝多糖的制备方法，其特征在于：取步骤（5）得到的磁珠受体偶联物和步骤（3）剩余的多糖供体液按步骤（4）继续操作，得到磁珠受体多糖偶联物；按步骤（5）继续操作，再得到磁珠受体偶联物和上清液；收集上清液备用；用再得到磁珠受体偶联物重复步骤（4）和（5），直至用完步骤（3）剩余的多糖供体液为止；收集合并上清液，即为灵芝多糖初液。
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