CN1931880A - 灵芝多糖的制备方法及应用 - Google Patents

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CN1931880A CN 200510095532 CN200510095532A CN1931880A CN 1931880 A CN1931880 A CN 1931880A CN 200510095532 CN200510095532 CN 200510095532 CN 200510095532 A CN200510095532 A CN 200510095532A CN 1931880 A CN1931880 A CN 1931880A
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林志彬
林树钱
刘梅英
王赛贞
林树光
王鹏云
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Abstract

本发明公开了一种灵芝多糖的制备方法及应用，其采用渗透的原理，使孢子内活性物质通过渗透交换平衡，以使孢子内的活性物质充分释放。同时本发明还将用中性盐溶液提取后的残渣再采用有机酸和微碱性的溶剂进行提取，通过不同溶剂提取后的多糖组合成复合多糖。依据本发明方法所获得的多糖可用在制备抗肿瘤和增强免疫功能的辅助制剂中，以增强这些药物的效果。

Description

灵芝多糖的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种从灵芝孢子中提取多糖的方法，以及由此方法提取的多糖的应用。
背景技术
灵芝在我国具有悠久的药用历史，随着人工栽培灵芝技术的成功和推广，对灵芝的研究也进入了一个新的进程，从以前的粗放型的将灵芝直接剪煮使用到现在的努力精确提取有效成分的使用，由于灵芝孢子的有效成份主要存在于灵芝孢子双层壁内，粗放型使用对灵芝的利用率极低，造成对灵芝的极大浪费。而孢子粉虽然具有很高的药用价值，由于由几丁质等成份构成的双层孢壁结构不仅十分坚硬，还有极强的耐酸及耐碱能力，因此必须对孢子粉进行进一步的加工，以提取孢内的活性成份。目前对灵芝孢子的加工主要集中在破壁上，即破坏孢子坚硬的外壳，以破坏孢子的整体性，其主要包括生物酶解法，超声波破碎法、超音速气流粉碎法、微波加热技术等，这几种处理方法虽然具有很高的破壁率，但由于灵芝孢子多糖多存在于坚硬的双层壁壳内，因此对于多糖提取率和应用未见显著提高，且这几种技术还会对多糖的营养成份或活性成份造成损害，故这种处理方法仍未能达到理想的提取效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种即可充分提取灵芝中的多糖的方法，及由此方法提取的多糖的应用。
本发明提供的提取灵芝多糖的方法是：1)将灵芝孢子粉原料中加入中性盐溶液充分搅拌均匀使混合液发生渗透作用，2)将振荡后的混合液进行离心分离，取上清液，3)将上清液浓缩后用具有一定亲水性、较强的亲脂性的有机溶济进透析或膜分离后、低温干燥得多糖。
本发明采用渗透法，利用渗透的原理使孢子内活性物质通过渗透交换平衡，从而将孢子内的活性物质主要成分如蛋白多糖、蛋白、核酸、三萜类物质等等大分子物质以及氨基酸、维生素、无机盐、微量元素等小分子活性物质或其他相结合物质由固相转到液相中，或通过高浓度盐类，由孢内的生理状态转入孢外特定的溶液中。
所述的灵芝孢子粉与中性盐溶液理想的重量份数比为1∶10～15。
可作为盐析渗透的中性盐有很多，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等。本发明优先选用氯化钠，其理想浓度为1.0～1.8％。
所述的用于透析(多糖沉淀)的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙醚等。
本发明的方法还包括灵芝孢子粉在使用中性盐溶液提取后余下的残渣中加入有机酸进行提取后，将两种不同的提取剂提取的上清液合并后进行处理而得多糖，由于不同的提取剂提取所获得的多糖的成份摩尔比是不一样的，由中性盐溶液提取所获得的多糖的单糖成份主要包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，摩尔比为26.79∶1.60∶6.83，由有机酸提取的多糖中单糖成分摩尔比为3.78∶1.89∶0.99。
所述的灵芝孢子粉有机酸溶液理想的重量份数比为1∶10～15。
有机酸溶液为草酸溶液，其浓度为1％～5％。
除了草酸外，其它的苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸等等有机酸均可以作为提取剂。
所述的制备方法还包括将用有机酸提取后的孢子粉残渣中加入弱碱溶液进行提取。将由弱碱溶液提取出的上清液与其它提取剂提取出的上清液进行合并，经浓缩后进行透析或膜分离，而得复合多糖。
本方法还包括将所得的多糖溶于水后，将水溶液进行透析，截留分子量5000以上的多糖，通过DEAE柱层精制处理，得纯度90.85％以上的多糖。
本发明的上述各种提取剂的提取步骤中，还包括将加入提取剂后的混合液置入超声波振荡器中进行振荡，从而使孢子粉内的活性成份或营养成份能更好的分离出来，所述的超声振荡的理想温度为60～80℃，超声功率在40-100％之间，时间1-2h。
本发明的离心采用离心机进行分离，离心机的理想转速为2800-3500r/mim，时间20分钟。
本发明的孢子粉可以是未破壁的，也可以是破壁的，两者的区别仅在于提取后的多糖中的成份略有不同，后者的多糖中多一个核糖。
由本发明方法所制备得到的多糖可制备抗肿瘤和增强免疫功能的辅助制剂。
本发明的优点在于：
1.本发明采用渗透法，使孢子内活性物质通过渗透交换平衡，达到孢子内活性物质更容易释放。
2.本发明孢子残渣继续分别，采用有机酸和微碱性的溶剂复合提取，把不同溶剂提取的多糖，组成为复合多糖，以获得更好的药用价值。
破壁孢子粉的油脂成分，通过本法处理后顺利排除，其多糖不含有脂肪氧化变质，影响产品保存的问题。
附图说明
图1是未经提取处理的孢子粉显微镜照片：从图中可看出孢子表面是光滑的。
图2是未经提取的破壁灵芝孢子粉的显微镜照片：从图中可看出灵芝孢子破碎、裂纹及不易分离。
图3是按本发明实施例4的方法提取后剩余的孢子粉残渣的显微镜照片
图4是按本发明实施例4提取方法提取所得多糖(Gl-SP)的气相图谱。
图5是将实施例4中的未破壁灵芝孢子粉替换成破壁孢子粉后提取所得的多糖的气相图谱(Gl-Bsp)。
图6是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖的HPLC(高效液体色谱)：其中TSKG3000PWXL柱温35℃，以硫酸钠溶液为流动相，流速0.5ml/min示差折光监测器。
色谱峰结果
  名字   保留时间   面积   峰高   ％面积
  1   多糖肽   12.648   6749113   29423   90.85
  2   18.360   49547   1828   0.67
  3   20.423   583042   25831   7.85
  4   23.493   15723   522   0.21
  5   24.813   31680   1374   0.43
图7是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的凝胶色谱GPC图
图8是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的红外光谱图
图9是将实施例4中的未破壁灵芝孢子粉替换成破壁孢子粉后提取所得的多糖(Gl-Bsp)的红外光谱图。
图10是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的光谱对照图
图11是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的1H核磁共振(NMR)图谱
图12是将实施例4中的未破壁灵芝孢子粉替换成破壁孢子粉后提取所得的多糖(Gl-Bsp)1H核磁共振(NMR)图谱
图13是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的对照图
图14是按本发明实施例4方法所提取得到的多糖(Gl-SP)的氨基酸分析结果图。
图15是Gl-SP和Gl-BSP对NK细胞活性的影响
图16是Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞吞噬NR的影响
图17是Gl-SP和Gl-BSP对双向MLR过程中分泌IL-2、IFN-γ的影响
图18是Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的影响
图19是Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞产生NO的影响
具体实施方式
下面结合实施例对本实用新型进行更详细的描述。
实施例1
①取1kg灵芝孢子粉置于玻璃容器中；
②取氯化钠210g溶于1.5L水中，配成1.4％溶度；
③取上述溶液1.2L和灵芝孢子粉，放置玻璃容器中，用搅拌器充分搅拌均匀；
④将灵芝孢子液，置于离心机中进行离心后，取上清液。
而后将上清液浓缩，采用乙醇进行透析沉淀，除去氯化钠等其它成份，沉淀物为孢子多糖，置低温干燥后得成品。
本实施例中的氯化钠可用硫酸钠、磷酸钠等替换，而乙醇则可用丁醇及丙酮等替换，其余方法步骤不变。
实施例2
1.取1kg灵芝孢子粉或破壁灵芝孢子粉置于玻璃容器中；
2.取氯化钠270g溶于1.5L水中，配成1.8％溶度；
3.取上述溶液1.5L，放置玻璃容器中，用搅拌器充分搅拌均匀；
4.将上述玻璃容器置于超声波振荡器中(KQ-300DE型)，温度70℃，超声功率在50％，时间1h。
5.提取的灵芝孢子液，置于离心机转速2800r/mim，时间20分钟，取上清液。
6.灵芝孢子残渣反复再提取一次，时间为1h，方法同上。
两次所得上清液浓缩，采用乙醇进行透析沉淀，除去氯化钠等其它成份，沉淀孢子多糖，置低温干燥后得成品。
本实施例还可将其中的氯化钠重量由165g溶于1.5L水中，配成1.1％溶度，取氯化钠溶液为1.1升，其余方法与实施例2相同。
实施例3
1.取1kg灵芝孢子粉或破壁灵芝孢子粉置于玻璃容器中；
2.取氯化钠270g溶于1.5L水中，配成1.8％溶度；
3.取上述溶液1.5L，放置玻璃容器中，用搅拌器充分搅拌均匀；
4.将上述玻璃容器置于超声波振荡器中(KQ-300DE型)，温度80℃，超声功率在85％，时间1.8h；
5.提取的灵芝孢子液，置于离心机转速3300r/mim，时间20分钟，取上清液；
6.灵芝孢子残渣反复再提取一次，时间为1h，方法同上；
7.将灵芝孢子粉残渣，置于容器中；
8.取草酸(C2H2O4)300g，加水1.5L，配成2％草酸溶液；
9.取上述溶液1.3L加入盛有灵芝孢子残渣的玻璃容器中，充分搅拌使之均匀；
10.将搅拌均匀的灵芝孢子液，置于离心机内，转速3000r/min，时间18分钟，取上清液；
11.将灵芝孢子残渣反复提取一次，方法同上。
将两次氯化钠溶液与两次草酸提取所得上清液混合，浓缩后采用乙醇沉淀，沉淀溶于水透析液浓缩，乙醇再次沉淀多糖，沉淀孢子多糖，置低温干燥得成品。
实施例4
1.取1kg灵芝孢子粉或破壁灵芝孢子粉置于玻璃容器中；
2.取氯化钠270g溶于1.5L水中，配成1.8％溶度；
3.取上述溶液1.5L，放置玻璃容器中，用搅拌器充分搅拌均匀；
4.将上述玻璃容器置于超声波振荡器中(KQ-300DE型)，温度60～80℃，超声功率在40-100％之间，时间1-2h。
5.提取的灵芝孢子液，置于离心机转速2800-3500r/mim，时间20分钟，取上清液。
6.灵芝孢子残渣反复再提取一次，时间为1h，方法同上。
7.将步骤6提取后的灵芝孢子残渣，置于玻璃容器中；
8.取草酸(C2H2O4)150g，加水1.5L，配成1％草酸溶液；
9.上述溶液1.5L加入盛有灵芝孢子残渣的玻璃容器中，充分搅拌使之均匀；
10.将上述玻璃容器置于超声振荡器内(KQ-300DE型)，温度70℃，超声功率在60％之间，时间为1h；
11.提取的灵芝孢子液，置于离心机内，转速3500r/min，时间16分钟，取上清液；
12.灵芝孢子残渣反复提取一次，方法同上。
13.将步骤12中的灵芝孢子残渣，置于玻璃容器中；
14.将氢氧化钠(NaOH)150g，加水1.5L配成1％NaOH溶液；
15.取上述溶液1.5L加入盛有灵芝孢子残渣的玻璃容器中，充分搅拌均匀；
16.将上述玻璃容器置于超声振荡器内，温度30℃，时间为0.5～1h；
17.提取的灵芝孢子液，置于离心机内，转速2800-3500r/min，时间20分钟，取上清液；
18.灵芝孢子残渣反复提取一次，方法同上；
19.将上述三种提取剂提取所得上清液合并，离心3000r/min，清液用醋酸调pH值6.0；
20.减压浓缩，真空度0.085Mpa；
21.用三倍量95％乙醇，充分搅拌静置复合多糖沉淀，放置冰箱48h；
22.离心(转速2800r/min)，时间20分，留下沉淀复合多糖部分，弃去上清液。
23.将粗多糖溶于水中，用乙醇沉淀，透析除去氯化钠和色素等成分；
24.沉淀孢子多糖经乙醇、丙酮、乙醚洗涤，置低温干燥得成品多糖。依照本实施例方法所获得的多糖的特性如图4、5、6、7、8、10、11、14及15。
实施例5
其余步骤与实施例4相同，只是将实施例4中所得的多糖溶于水，透析48h，透析袋截留分子量5000以上，以除去低分子多糖及色素等。高分子部位(5000以上)得率为2.25％，低分子得为2.42％。
将上述所得高分子多糖，通过DEAE柱层精制处理。纯度可达90.85％(见色谱结果)。
具体方法：
取复合多糖(1％)上DEAE-纤维素柱纯化，分别用水、0.5～1mol/L NaCl洗脱，得白色BT1，浅褐色BT2，和BT3三个组分，得率分别为69.67％；0.24％和0.76％。
以实施例4、5中的灵芝孢子粉可用破壁灵芝粉替代其中的灵芝孢子粉原料，其所有的加工方法与未破壁的孢子粉一样，只是在破壁孢子粉所获得的多糖成份中多了一个核糖。由破壁灵芝孢子粉按上述方法加工所获得的多糖的特性如图5、9、12所示.
应用实施例1
将本发明所制得的灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的抑制
实验结果：
灌胃给予Gl-SP和Gl-BSP(50，100，200mg/kg)可抑制抑制BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的生长，抑瘤率分别为7.8％，18.1％，37.4％(P＜0.05)和30.7％，40.1％(P＜0.05)，59.9％(P＜0.01)(见表1)。
表1：灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对BALB/c小鼠移植性
                    S180肉瘤的抑制作用( x±s，n＝10)
 group   Dose(mg/kg×days)   Body weight(g) Tumorweight(g)   Inhibitoryrate(％)   Spleenindex
  origin   after
  Model   --   20.4±0.5   20.4±1.1   1.21±0.27   0   0.1031±0.0118
  Gl-SP   50mg/kg×14   20.8±0.6   20.9±0.8   1.11±0.29   7.8   0.1157±0.0133
  100mg/kg×14   20.8±0.6   20.8±0.9   0.99±0.44   18.1   0.1104±0.0327
  200mg/kg×14   21.0±0.4   21.3±0.8   0.76±0.20*   37.4   0.1301±0.0333
  Gl-BSP   50mg/kg×14   20.9±0.9   20.4±0.9   0.84±0.42   30.7   0.1187±0.0081
  100mg/kg×14   20.5±0.8   20.5±1.4   0.61±0.47*   49.1   0.112±0.0277
  200mg/kg×14   20.9±0.8   21.6±0.8**   0.48±0.39**   59.9   0.1188±0.0349
  CTX   30mg/kg×7(i.p，q.o.d)   20.4±0.5   18.2±1.5   0.23±0.11***   81.0   0.0607±0.0202*
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs.Model group
上表说明：灵芝孢子多糖(Gl-SP)和破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)均可不同程度的抑制肿瘤的生长，Gl-BSP对肿瘤的生长显示出了更明显的抑制作用。
②灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对S180荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响
实验结果：
灌胃给予S180荷瘤小鼠Gl-SP和Gl-BSP(50，100，200mg/kg)可明显促进Con A诱导的荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖，与模型对照组的相比，淋巴细胞增殖率分别增加13.2％(P＜0.001)，37.5％(P＜0.001)，47％(P＜0.001)和44％(P＜0.001)，100.2％(P＜0.001)，106.1％(P＜0.001)。相同浓度的Gl-BSP处理组对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的作用强于Gl-SP(P＜0.001)。(见表2)
表2：灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对S180荷瘤小鼠脾
                脏淋巴细胞增殖反应的影响( x±s，n＝3)
group   Dose(mg/kg×days)   Proliferation ratio(％)
  ConA(μg/ml)   LPS(5μg/ml)
  Normal   --   254.0±8.4   127.0±8.8
Model --   130.3±8.3***   108.8±7.6**
  CTX   30mg/kg×7(i.p，q.o.d)   105.0±2.1***###   71.2±5.7***
  Gl-SP   50mg/kg×14   143.5±9.2***#△△△   112.6±9.2*
  100mg/kg×14   167.8±8.8***###△△△   113.2±6.7*
  200mg/kg×14   177.3±7.7***###△△△   118.1±7.8
  Gl-BSP   50mg/kg×14 184.3±3.4***###   115.5±8.9
  100mg/kg×14   230.5±10.2***###   116.8±0.5
  200mg/kg×14   236.4±6.7*###   123.4±5.7#
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs.Normal group；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 vs.Model group；△△△P＜0.001 vs.Gl-BSP of the same concentrations上表说明：Gl-SP和Gl-BSP可改善荷瘤小鼠的免疫状态，促进丝裂原诱导的淋巴细胞增殖作用，Gl-BSP对ConA诱导的淋巴细胞增殖作用具有更强的促进作用。
③灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对S180荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响
实验结果：
灌胃给予S180荷瘤小鼠Gl-SP和Gl-BSP(50，100，200mg/kg)可明显增强荷瘤小鼠脾NK细胞的杀伤活性，与模型对照组相比，NK细胞的杀伤活性分别提高了15.2％(P＜0.001)，17.5％(P＜0.001)，26.3％(P＜0.001)和26.9％(P＜0.001)，27.8％(P＜0.001)，29.6％(P＜0.001)。同浓度的Gl-BSP(50，100mg/kg)给药组对NK细胞的杀伤活性的增强作用强于Gl-SP给药组。(见表3)
表3：灵芝孢子多糖(Gl-SP)或破壁灵芝孢子多糖(Gl-BSP)对S180荷瘤小鼠脾NK
                    细胞活性的影响( x±s，n＝3)
  group   Dose(mg/kg×days)   Cytotoxicity(％)
  NormalModelCTXGl-SPGl-BSP   ----30mg/kg×7(i.p，q.o.d)50mg/kg×14100mg/kg×14200mg/kg×1450mg/kg×14100mg/kg×14200mg/kg×14   55.6±2.331.0±1.9***17.2±3.1***###46.2±4.9*###△△48.5±5.1*###△57.3±3.3###57.9±2.4###58.8±2.4###60.6±4.8###
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs.Normal group；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 vs.Model group；△P＜0.05，△△P＜0.01，vs.Gl-BSP of the same concentrations
上表说明：Gl-SP和Gl-BSP可增强荷瘤小鼠的NK细胞活性，Gl-BSP与Gl-SP相比具有更强的作用。
④Gl-SP和Gl-BSP对脾淋巴细胞增殖及ConA、LPS诱导的脾淋巴细胞增殖的影响
实验结果：Gl-SP和Gl-BSP(0.8～12.8mg/L)可显著促进脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加15.0～39.0％和15.0～40.5％。Gl-SP(3.2～12.8mg/L)和Gl-BSP(0.2～12.8mg/L)可显著促进ConA诱导的脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加21.0～30.1％和31.7～44.7％，相同浓度的Gl-BSP对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的作用强于Gl-SP。Gl-SP和Gl-BSP(3.2～12.8mg/L)均可显著促进LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加10.6～22.9％和12.0～18.1％(见表4)。
表4 Gl-SP和Gl-BSP对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的影响( x±s，n＝3)
Tab4 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on lymphocyte proliferation of murine
                    splenocytes( x±s，n＝3).
  Group   Concentration(mg/L)   Proliferation ratio(％)
RMPI1640 Con A(1mg/L)   LPS(5mg/L)
  RMPI1640Gl-SPGl-BSP   --0.20.83.212.80.20.83.212.8   100.0±7.199.4±6.3115.0±10.4*125.1±9.4***139.0±7.4***108.6±10.9115.0±6.6*124.9±6.0***140.5±6.0***   135.5±5.0141.1±11.1150.3±11.5165.6±6.1**156.5±8.9*167.2±3.8***△△176.2±15.3***△180.2±12.7***176.7±0.9***△   122.9±0.2131.2±4.6133.5±1.3*145.8±2.4***134.7±4.8*130.9±2.4134.9±10.6*141.0±0.2***146.1±8.1*
⑤Gl-SP和Gl-BSP对MLR的影响
实验结果：Gl-SP和Gl-BSP在0.2～12.8mg/L剂量范围内可显著促进双向MLR，细胞增殖率分别增加26.8～31.6％或20.9～48.0％ Gl-BSP 12.8mg/L时促增殖作用强于Gl-SP(P＜0.05)。Gl-SP(0.2～3.2mg/L)和Gl-BSP(0.2～12.8mg/L)均可显著促进单向MLR，淋巴细胞增殖率分别增加44.1～62.6％和71.5～120.6％，但仅在浓度为12.8mg/L时，Gl-BSP促增殖作用明显强于Gl-SP(P＜0.001)(见表5)。
                  表5：Gl-SP和Gl-BSP对MLR的影响( x±s，n＝3)
Tab5 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on mixed lymphocyte culture reaction of
                        murine splenocytes( x±s，n＝3).
Group   Concentration(mg/L)   Proliferation Ratio(％)
  Two-way MLR   One-way MLR
  RMPI1640Gl-SPGl-BSP   --0.20.83.212.80.20.83.212.8   100.0±7.7126.8±5.9***130.3±7.9***131.6±3.4***130.1±14.7***120.9±9.0*129.9±2.8***130.5±3.7***148.0±8.9***△△   100.0±6.1144.1±13.0*161.5±21.9**162.6±13.4**129.6±14.4171.5±21.2**182.9±3.2***187.4±34.8***220.6±12.3***△△△
⑥Gl-SP和Gl-BSP对NK细胞活性的影响
实验结果：Gl-SP或Gl-BSP在0.2～3.2mg/L剂量范围内，可显著提高NK细胞杀伤活性，RMPI1640对照组为12.7％，Gl-SP组为23.7～53.2％，Gl-BSP组为23.5～45.1％，二者作用相似，无显著差异(图15)。
⑦Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞吞噬NR的影响
实验结果：在0.2～12.8mg/L剂量范围内，Gl-SP和Gl-BSP均可显著增强腹腔巨噬细胞吞噬NR的能力，吞噬率分别增加53.0～85.3％和30.2～80.2％，二者比较无显著差异(图16)。
⑧Gl-SP和Gl-BSP对双向MLC反应中T细胞及亚群的影响
实验结果：Gl-SP和Gl-BSP在一定的浓度范围内可显著增加双向MLC反应中CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞百分率，Gl-BSP在浓度为0.2～12.8mg/L或3.2～12.8mg/L时，增加CD4+或CD8+T细胞的作用较Gl-SP更为显著。在浓度为0.2～0.8mg/L时，Gl-BSP组的CD4+T和CD8+T细胞的比值大于Gl-SP组(见表6)。
表6：Gl-SP和Gl-BSP对双向MLR中T淋巴细及亚群的影响( x±s，n＝3)
Tab6 Influences of Gl-SP and Gl-BSP on the T-lymphocyte subpopulations in MLR( x±s，n＝3).
Group   Concentration(mg/L) CD3+(％) CD4+(％) CD8+(％) CD4+/CD8+ratio
  RMPI1640Gl-SPGl-BSP   --0.20.83.212.80.20.83.212.8   66.87±0.6268.38±1.3369.68±0.4372.95±2.58*68.11±2.8966.89±5.2769.02±2.1572.24±0.94**75.12±0.70*** 30.57±1.3730.66±2.2431.13±1.1433.46±0.48**31.68±0.3533.28±0.72**△△35.02±0.61***△△△35.10±0.64***35.14±0.77***△△△ 24.85±1.2827.23±1.7*27.03±0.55*26.23±1.2624.69±1.3926.55±1.3927.06±1.69*28.39±0.89***△28.90±0.41***△△△ 1.23±0.021.13±0.091.15±0.051.28±0.071.29±0.061.26±0.09△1.31±0.10△△1.24±0.061.22±0.01
⑨Gl-SP和Gl-BSP对双向MLR过程中分泌IL-2、IFN-γ的影响
实验结果：Gl-SP或Gl-BSP(0.2～12.8mg/L)可显著增加IL-2、IFN-γ的分泌，但相同浓度的Gl-BSP增加IL-2和IFN-γ分泌的作用均强于Gl-SP(图17)。
⑩Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的影响
实验结果：在12.8mg/L剂量时，两种多糖均可显著促进腹腔巨噬细胞分泌TNF-α，在相同浓度时，二者比较均无显著差异(图18)
Gl-SP和Gl-BSP对腹腔巨噬细胞产生NO的影响
实验结果：Gl-SP(12.8mg/L)或Gl-BSP(3.2～12.8mg/L)可显著促进腹腔巨噬细胞产生NO，但在相同浓度时，二者比较均无显著差异(图19)。
灵芝孢子和破壁孢子多糖对体外培养的小鼠脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞免疫调节活性的比较
1)Gl-SP和Gl-BSP对脾淋巴细胞增殖及ConA、LPS诱导的脾淋巴细胞增殖的影响Gl-SP和Gl-BSP(0.8～12.8mg.L-1)可显著促进脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加15.0～39.0％和15.0～40.5％。(见表7)
表7：Gl-SP和Gl-BSP对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的影响( x±s，n＝3)
  组别   药物浓度(mg.L-1)   增殖率(％)
  RMPI1640Gl-PPGl-SPGl-BSP   --12.80.20.83.212.80.20.83.212.8   100.0±7.1122.6±8.0b99.4±6.3f115.0±10.4a125.1±9.4c139.0±7.4cd108.6±10.9d115.0±6.6a124.9±6.0C140.5±6.0ee
2)Gl-SP(3.2～12.8mg.L-1)和Gl-BSP(0.2～12.8mg.L-1)可显著促进ConA诱导的脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加21.0～30.1％和31.7～44.7％。(见表8)
表8 Gl-SP和Gl-BSP对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响( x±s，n＝3)
  组别  药物浓度(mg·L-1)   增殖率(％)
  RMPI1640ConAGl-PPGl-SPGl-BSP  --112.80.20.83.212.80.20.83.212.8   64.5±19.2100.0±5.0115.5±13.6105.6±11.1h114.8±11.5g130.1±6.1b121.0±8.9ag131.7±3.8c140.7±15.3cd144.7±12.7cd141.2±0.9cd
与ConA组比较aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001；与Gl-PP组比较dP＜0.05；与同浓度Gl-SP比较gP＜0.05，hP＜0.01
3)Gl-SP和Gl-BSP(3.2～12.8mg.L-1)可显著促进LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，淋巴细胞增殖率分别增加10.6～22.9％和12.0～18.1％。(见表9)
表9 Gl-SP和Gl-BSP对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响( x±s，n＝3)
  组别  药物浓度(mg·L-1)   增殖率(％)
  RMPI1640LPSGl-PPGl-SPGl-BSP   --512.80.20.83.212.80.20.83.212.8   77.1±3.1100.0±0.2107.7±8.0108.3±4.6110.6±1.3a122.9±2.4cd111.8±4.8a108.0±2.4112.0±10.6a118.1±0.2cd113.2±8.1a
与LPS组比较aP＜0.05，cP＜0.001与Gl-PP组比较dP＜0.05
4)Gl-SP和Gl-BSP对MLR的影响Gl-SP和Gl-BSP0.2～12.8mg.L-1剂量范围内可显著促进双向MLR，细胞增殖率分别增加26.8～31.6％或20.9～48.0％，峰效应分别出现在Gl-SP0.2mg.L-1和Gl-BSP12.8mg.L-1，二者比较差别显著(P＜0.05)。Gl-SP(0.2～3.2mg.L-1)和Gl-BSP(0.2～12.8mg.L-1)可显著促进单向MLR，淋巴细胞增殖率分别增加44.1～62.6％和71.5～120.6％，峰效应分别出现在Gl-SP 3.2mg.L-1和Gl-BSP12.8mg.L-1，且二者比较差别显著(P＜0.001)(见表10)
表10 Gl-SP和Gl-BSP对MLR的影响( x±s，n＝3)
  组别   药物浓度(mg·L-1)   增殖率(％)
  双向MLR   单向MLR
  RMPI1640Gl-PPGl-SPGl-BSP   --12.80.20.83.212.80.20.83.212.8   100.0±7.7206.9±7.4c131.6±3.4c130.3±7.9c130.1±14.7c126.8±5.9c120.9±9.0a129.9±2.8c130.5±3.7c148.0±8.9chj   100.0±6.1184.2±39.1c144.1±13.0a161.5±21.9b162.6±13.4b129.6±14.4e171.5±21.2b182.9±3.2c187.4±34.8c220.6±12.3chj
5)Gl-SP和Gl-BSP对NK细胞活性的影响Gl-SP或Gl-BSP在0.2～3.2mg.L-1剂量范围内，可显著提高NK细胞杀伤活性，RMP11640对照组为12.7％，Gl-SP组为23.7～53.2％，Gl-BSP组为23.5～45.1％，峰效应均出现在3.2mg.L-1，在最高效应之间无显著性差别。(见表11)
表11 Gl-SP和Gl-BSP对NK细胞活性的影响( x±s，n＝3)
  组别   药物浓度(mg·L-1)   细胞杀伤活性(％)
  RMPI1640Gl-PPGl-SP   --12.80.20.8   12.7±9.717.5±6.325.0±2.1a23.7±1.8a

Claims (14)

1.一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将灵芝孢子粉原料中加入中性盐溶液充分搅拌均匀使混合液发生渗透作用，2)将振荡后的混合液进行离心分离，取上清液，3)将上清液浓缩后用具有一定亲水性、较强的亲脂性的有机溶济进透析或膜分离后、低温干燥得多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法还包括在上述步骤2中的分离后所得的残渣中加入有机酸溶液搅拌均匀后，将此混合液进行离心分离，取其上清液，而后将此上清液与中性盐溶液提取所获得的上清液进行混合，浓缩后进行透析或膜分离、低温干燥得多糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法还包括在上述权利要求2离心分离后所获得的残渣中加入弱碱溶液搅拌均匀后，将此混合液进行离心分离，取上清液，而后再将此上清液与上述的上清液对应混合，浓缩后进行透析或膜分离、低温干燥得多糖。
4.根据权利要求1、2或3所述的制备方法，其特征在于：所述的方法还包括在将各溶液搅拌均匀后，将其置入超声波振荡器中进行振荡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的方法还包括将所得的多糖溶于水后，将水溶液进行透析，截留分子量5000以上的多糖，通过DEAE柱层精制处理，得纯度90.85％以上的多糖。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的中性盐溶液为氯化钠溶液，其浓度为1.0～1.8％。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的有机酸溶液为草酸溶液，其浓度为1％～5％。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的弱碱溶液为氢氧化钠溶液，其浓度为1％。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的灵芝孢子粉与中性盐溶液、有机酸溶液及弱碱溶液的重量份数比均为1∶10～15。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的超声振荡的温度为60～80℃，超声功率在40-100％之间，时间1-2h。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的孢子粉为破壁孢子粉。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的离心的转速为2800-3500r/mim，时间20分钟。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述透析用的有机溶济为乙醇。
14.一种由权利要求1或3的方法所制备的多糖在制备抗肿瘤和增强免疫功能的辅助制剂中的应用。
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