JP5567499B2 - ラン科植物から分離した新規物質、これを含む抽出物、抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤及び抗炎症剤 - Google Patents

Description

本発明は、ラン科植物から分離した新規物質、これを含む抽出物、抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤及び抗炎症剤に関する。

一重項酸素、過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル等の活性酸素は、化学反応がおこりやすい酸素であり、通常の酸素と比べて非常に強い酸化力を示す。活性酸素は日常生活の中で発生しており、例えば息をすることによって空気中から取り入れた酸素が体内で変質することにより生成される。活性酸素は、体内の酵素反応を促進させたり、強力な力で殺菌して病気を予防したりと、体にとって大切な作用を持っている。

しかしながら、紫外線、ストレス、喫煙、激しい運動等の要因によって、活性酸素が体内で過度に発生すると、過剰な活性酸素は細胞に損傷を与え、脂質、たんぱく質、ＤＮＡなどに影響し、皮膚のしわやシミ、白内障、網膜炎、認知症等の老化促進、癌、動脈硬化等の生活習慣病の原因になるといわれている。

この過剰な活性酸素の酸化反応を抑制する抗酸化剤に関して、従来より種々の研究・開発がなされている。合成化合物の抗酸化剤として、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）などが知られているが、このような合成化合物は発がん性があり好ましくない。

そこで、天然由来の抗酸化剤として、脂溶性のトコフェロール（ビタミンＥ）、カロチノイド、水溶性のアスコルビン酸（ビタミンＣ）などが知られている。このような天然由来の抗酸化剤は身体に安全であるため、開発が盛んに行われている（例えば特許文献１及び特許文献２参照）。

特開平１０−２２６７８７号公報 特開２０００−１２９２５６号公報

しかしながら、従来の天然由来の抗酸化剤は、身体への安全性はあっても抗酸化作用の効果が十分でない点で課題がある。

本発明は、上記に鑑み、副作用を起こすことなく、有効な抗酸化作用を有する抗酸化剤を提供することを目的とする。

本発明者は上記目的を達成するため鋭意研究の結果、ラン科植物の抽出物に、下記式（１）で示される新規フェナントレン化合物が含まれていることを発見し、その新規化合物は、有効な抗酸化作用を有し、副作用を起こすおそれが少ないとの知見を得、本発明を完成するに至ったものである。さらに、この新規化合物は、抗菌作用、抗癌作用、抗炎症作用に優れていることも見出された。

本発明は、式（１）で示される新規物質を含有する抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤又は抗炎症剤として提供することができる。また、本発明は、式（１）で示される新規物質を含有した、抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用又は抗炎症作用を目的とした医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物及び食品添加物としても提供することができる。また、本発明の式（１）で示される新規物質は赤色色素を有しているので、食品添加物の中でも着色料として提供することもできる。

本発明の上記式（１）で示される新規物質は、ラン科植物の抽出物に含まれており、該抽出物から単離することにより製造することができるが、化学的に合成してもよい。

ラン科植物としては、限定されるものでないが、シンビジウム属植物、カトレア属植物、デンドロビウム属植物、ファレノプシス属植物、ミルトニア属植物、バニラ属植物、エビネ属植物、ネジバナ属植物、トキソウ属植物等が挙げられ、中でも特にシンビジウム属植物は、式（１）で示される新規物質が多く含まれているため好ましい。

シンビジウム属植物は主にアジアの温帯から熱帯地域に分布自生するラン科の単子葉植物であり、特徴的な偽球茎を有し、その種類は約７０種ある。またシンビジウム属植物は品種改良が行われ、種苗法のもとに品種登録されたものが多数存在する。自生種も含めて代表的なものは春蘭（ｃｙｍ．ｇｏｅｒｉｎｇｉｉ）、寒蘭（ｃｙｍ．ｋａｎｒａｎ）、ホウサイラン、（ｃｙｍ．ｓｉｎｅｎｓｅ）スルガラン（ｃｙｍ．ｅｎｓｉｆｏｌｉｕｍ）、キンリョウヘン（ｃｙｍ．ｐｕｍｉｌｕｍ）、グレートフラワー・マリーローランサン（Ｃｙｍ．Ｇｒｅａｔ Ｆｌｏｗｅｒ‘Ｍａｒｙｌａｕｒｅｎｃｉｎ’）、ローズワイン・新世紀（Ｃｙｍ Ｒｏｓｅ Ｗｉｎｅ‘Ｓｈｉｎｓｅｉｋｉ’）グレートフラワー・バレリーナ（Ｃｙｍ．Ｇｒｅａｔ Ｆｌｏｗｅｒ‘Ｂａｌｌｅｒｉｎａ’）、ラッキーフラワー・あんみつ姫（Ｃｙｍ．Ｌｕｃｋｙ Ｆｌｏｗｅｒ‘Ａｎｍｉｔｓｕｈｉｍｅ’）グレートキャティ・まりこ（Ｃｙｍ．Ｇｒｅａｔ Ｋａｔｙ‘Ｍａｒｉｋｏ’）、ラッキーグロリア・あぐり（Ｃｙｍ．Ｌｕｃｋｙ Ｇｌｏｒｉａ‘Ａｇｕｒｉ’）ラッキーグロリア・福の神（Ｃｙｍ．Ｌｕｃｋｙ Ｇｌｏｒｉａ‘Ｆｕｋｕｎｏｋａｍｉ’）、シーサイド・サーヤ（Ｓｅａｓｉｄｅ‘Ｓａｙａ’）、サテンドール・ゴールデンイエロー（Ｃｙｍ．Ｓａｔｉｎ Ｄｏｌｌ‘Ｇｏｌｄｅｎ Ｙｅｌｌｏｗ’）、グレートキャティ・リトルローランサン（Ｃｙｍ．Ｇｒｅａｔ Ｋａｔｙ‘Ｌｉｔｔｌｅ Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ‘）、アンジェリコ・福娘（Ａｎｇｅｌｉｃｏ‘Ｆｕｋｕｍｕｓｕｍｅ’）等が知られている。自生種の中には、中国、東南アジア、オーストラリアなどで、薬用、食用として、用いられるものもある。

このように、ラン科シンビジウム属の植物としては極めて多数存在するが、中でも、種苗法による品種登録名、グレートフラワー・マリーローランサン（品種登録第２８４１号）が、式（１）の化合物を多く含有しており、この化合物を多く含む抽出物は抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用、抗炎症作用に優れているので好ましい。

ラン科植物の抽出物は、抽出原料としてラン科植物のどの部位から抽出したものでもよく、ラン科植物の根、茎、葉、花、種子、偽球茎あるいは全草を、そのまま或いは適当な大きさに切断若しくは粉砕したものを使用することができるが、特に、根の抽出物が式（１）の化合物を多く含有しており、抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用、抗炎症作用に優れているので好ましい。

ラン科植物の抽出物の調整は、ラン科植物の一部又は全草を、そのまま或いは適当な大きさに切断若しくは粉砕機で粉砕したものを圧搾する物理的抽出法、溶媒抽出法、真空蒸留抽出法のいずれも採用可能である。抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン等の親水性の溶媒が挙げられ、これらを２種以上混合させて用いてもよい。また、調整される抽出物は液体でも固体でもよい。

例えば、メタノール又はエタノール抽出法の場合、ラン科植物の一部又は全草を、そのまま或いは適当な大きさに切断若しくは粉砕機で粉砕したものを、メタノール又はエタノール水溶液に浸漬して、時々攪拌しながら抽出操作を行い、濾過により不純物を除去し、減圧下、減圧留去により、ラン科植物の抽出物を製造する方法が採用できる。また、熱水抽出法の場合、上記と同様にして得た粉砕物５ｇに、精製水１００ｍｌを加え、沸騰水浴上で約２時間加熱抽出した後、等量の９５％エタノールを加え、静置後、濾紙で不純物を除去すれば、ラン科植物の抽出物を製造できる。

このラン科植物の抽出物は、応用する形態にしたがって、乾燥、濃縮、或いは希釈、他成分との混合など任意に調整し、これを含む抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤、抗炎症剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物又は食品添加物としてもよいし、さらに式（１）で示される新規物質を単離して、この新規物質を有効成分として含む抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤、抗炎症剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物又は食品添加物としてもよい。

式（１）で示される新規物質の単離方法は、上記ラン科植物の抽出物から、さらに適当な分離精製手段、好ましくは薄層クロマトグラフ法、カラムクロマトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法または再結晶等を繰り返し行うことにより行われる。

本発明によると、式（１）で示される新規物質は、天然由来の成分で安全性が高く、抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用、抗炎症作用を有している。したがって、この新規物質を有効成分として配合した医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物又は食品添加物として利用することができる。

化合物１〜５の抽出プロセスを示すブロック図 化合物１のＸ線結晶解析による結晶構造を示す図 化合物１の一酸化窒素産生抑制率を示すグラフ 化合物４の一酸化窒素産生抑制率を示すグラフ 化合物５の一酸化窒素産生抑制率を示すグラフ

本発明の下記式（１）で示される新規物質は、ラン科植物を溶剤により抽出した抽出物から、通常用いられる分離、精製手段によって単離することができる。

上記式（１）で示される新規物質には、抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用又は抗炎症作用を有することが各種試験により見出された。したがって、式（１）で示される新規物質は、経口又は非経口のいずれかを問わず、抗酸化剤、抗菌剤、抗癌剤又は抗炎症剤の有効成分として用いることができる。

この式（１）で示される新規物質は、上記いずれか又は全ての作用効果を得る目的で、そのままの状態で配合して医薬品、医薬部外品、化粧品、食品とすることもできるし、または適当な媒体で希釈して、あるいは医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品の製造分野において公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液材等の種々の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の形態で使用することができる。

具体的な用途としては、例えば、医薬品又は医薬部外品の場合、通常の医薬品又は医薬部外品に広く使用することができ、内服液、錠剤、軟膏、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤、ハップ、マグネシウム補給剤、ミネラル強化剤、各種ドリンク剤、皮膚外用剤、発毛剤、育毛剤、養毛剤、薬用石鹸、薬用歯磨き等を挙げることができる。

化粧品の場合、化粧水、美白剤、美容液、乳液、クリーム、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、リンス、トリートメント、ボディソープ、洗顔料、石鹸、歯磨き、浴用剤、芳香製品、口紅、リップクリーム、白粉、アイシャドウ、ヘアカラー等を挙げることができる。

食品の場合、チューインガム、キャンディー、アルコール飲料、青汁、その他の飲料、菓子、冷菓、米飯類、即席麺類、調理冷凍食品、食用油、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、乳製品、おかず、嗜好品（たばこ等）を挙げることができる。また、式（１）で示される新規物質は、赤色の色素を有しているため、着色料のような食品添加物にも適用することができる。

式（１）で示される新規物質は、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、保湿剤、界面活性剤、色素、香料、酵素類、ホルモン類、ビタミン類、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽剤、溶剤、安定剤、可塑剤、滑沢剤、可溶化剤、還元剤、緩衝剤、甘味剤、基剤、揮散補助剤、吸着剤、矯味剤、共力剤、結合剤、懸濁剤、抗酸化剤、光沢化剤、コーティング剤、湿潤剤、清涼化剤、軟化剤、乳化剤、賦形剤、防腐剤、保存剤などを通常の方法にしたがって添加して用いることができる。

＜ラン科植物の抽出物の調整＞
図１に示すように、シンビジウム属植物であるグレートフラワー・マリーローランサン（品種登録第２８４１号）の新鮮根８．０Ｋｇを粉砕し、これに３６Ｌのメタノールを加えて漬け込み、室温下で３カ月間抽出する。そして、ろ過により根を取り除いてできたメタノール抽出液を減圧下で、溶媒を留去することにより、ラン科植物の抽出物を得た。

＜ラン科植物の抽出物の精製＞
前記ラン科植物の前記抽出物を精製して、複数の化合物を単離する。抽出物に対し酢酸エチル９Ｌと水９Ｌの混液で抽出を行い、酢酸エチル可溶部と水可溶部とに分画した。それぞれにつき減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチル可溶部粉末（４２ｇ）と水可溶部粉末（１３０ｇ）を得た。得られた酢酸エチル可溶部粉末をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
に付し、ヘキサン−酢酸エチル（１０：１）の混液で溶出を行い、順次酢酸エチルの量を増やしてカラムクロマトグラフィーを行い、８つの分画（フラクション１〜８）を得た。

次に、重量の多いフラクション３（５．６９ｇ）とフラクション４（４．４９ｇ）について、それぞれカラムクロマトグラフィーを行った。フラクション３をヘキサン−酢酸エチル（７：３）の溶出溶媒で、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、５つの分画（フラクション３−１〜３−５）を得た。そのうちのフラクション３−３を高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ）にて６０％含水メタノールにて精製を行い、化合物２（３９０ｍｇ）及び化合物５（１１７ｍｇ）を得た。また、フラクション４をヘキサン−酢酸エチル（６：４）の溶出溶媒で、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、６つの分画（フラクション４−１〜４−６）を得た。そのうちのフラクション４−２に対し再結晶を行い、化合物１（８０ｍｇ）を得た。また、フラクション４−３を高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ）にて６０％含水メタノールにて精製を行い、化合物３（８０ｍｇ）及び化合物４（７０ｍｇ）を得た。

＜新規物質の物理化学的性質＞
上記のようにして得られた化合物１〜５の物理化学的性質を調べた結果、化合物１は前記式（１）で示される化学構造を有しており、化合物２は下記式（２）で示される化学構造を有しており、化合物１及び化合物２は新規のフェナントレン化合物であることが分かった。また、化合物３は下記式（３）、化合物４は下記式（４）、化合物５は下記式（５）で示される化学構造を有しており、既知のフェナントレン化合物であることが分かった。

化合物１及び化合物２の物理化学的性質は以下のとおりである。
・化合物１
（１）分子式：Ｃ_１５Ｈ_１２Ｏ_４
（２）融点：１４８〜１５０℃
（３）高分解能ＥＩマススペクトル（ＨＲＥＩＭＳ） ｍ／ｚ（Ｍ^＋）：実測値 ２５６．０７０９、理論値 ２５６．０７３６
（４）ＦＴ−ＩＲ（フィルム法）ｃｍ^−１：３０６３、２９９３、１６７０、１６３９、１５９５、１４５２、１２４６
（５）ＵＶλｍａｘ（ＭｅＯＨ）：２１７．６（３．６７）、２２３．４（３．６７）、２４２（３．４６）、２７６．２（３．３８）、３２１．２（３．３８）

・化合物２
（１）分子式：Ｃ_１６Ｈ_１６Ｏ_４
（２）融点：１７９〜１８０．５℃
（３）高分解能ＥＩマススペクトル（ＨＲＥＩＭＳ） ｍ／ｚ（Ｍ^＋）：実測値 ２７２．１０４０、理論値 ２７２．１０４９
（４）ＦＴ−ＩＲ（フィルム法）ｃｍ^−１：３３４８、３２１５、１６１６、１５８２、１５０１、１４５２、１３２９、１２３６、１０９４
（５）ＵＶλｍａｘ（ＭｅＯＨ）：２２５．４（３．８９）、２７３．４（３．８０）、３０６．２（３．８１）

また、化合物１についてＸ線結晶解析を行った結果、化合物１の結晶は図２及び下記に示すような特性を持つことがわかった。
結晶系：斜方晶（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃ）
空間群：Ｐ２_１２_１２_１
ａ＝７．０６２Å
ｂ＝８．２２９Å
ｃ＝１９．９５３Å
Ｚ＝４
Ｖ＝１１５９Å^３
ｆｉｎａｌＲ＝０．０７７

以下、化合物１〜５について、試験例で具体的に説明する。

＜試験例１：抗酸化活性＞
上記実施例により得られた化合物１〜５について、ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）様活性測定法によって抗酸化作用を試験した。

ＳＯＤ様活性測定にはＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所製）のアッセイキットを用いた。キサンチンにキサンチンオキシダーゼ（酵素）を作用させることによりスーパーオキサイド（Ｏ^２−）が生成される。このスーパーオキサイドは、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を還元して高水溶性ホルマザンを生成する。このスーパーオキサイドが化合物によってどれぐらい消去されたかをＷＳＴ−１の発色により調べ、消去能をＳＯＤ活性とする。

まず、上記化合物１〜５のそれぞれを０．０２４ｇ／ｍＬ（２．４ｗ／ｖ％）のＤＭＳＯ溶液に調整した後、化合物２〜４については試料最終濃度を１００μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬとして計５ｄｏｓｅで実施した。化合物１と化合物５については、試料最終濃度を１０μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとして合計５ｄｏｓｅで実施した。

９６穴ｗｅｌｌプレートを用いて、各ｗｅｌｌに各化合物の調整溶液を２０μＬ加え、順次、ＷＳＴ試薬溶液２００μＬ、バッファー溶液２０μＬ、酵素溶液２０μＬを加え、３７℃で２０分間インキュベーションを行った後、プレートレーダーで４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した（ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ５５０、バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）。ＳＯＤ活性値（阻害率％）は下記計算式（６）より求めた。なお、ポジティブコントロールとしてアスコルビン酸（ナカライテスク社製）を用いた。
ＳＯＤ活性値（阻害率％）＝（１−（Ｓａｍｐｌｅ−ＢＬＫ２）／（ＢＬＫ１−ＢＬＫ３））×１００・・・（６）
なお、上記式（６）中、
Ｓａｍｐｌｅ：化合物添加・酵素溶液添加時の吸光度、
ＢＬＫ１：化合物無添加・酵素溶液添加時の吸光度、
ＢＬＫ２：化合物添加・酵素溶液無添加時の吸光度、
ＢＬＫ３：化合物無添加・酵素溶液無添加時の吸光度である。

上記試験を３回繰り返し、再現性を確認した。そして、各濃度におけるＳＯＤ活性値から各化合物の５０％ＳＯＤ様活性値を示すＩＣ_５０の値（μＭ）を算出し、それを下記表１に示す。

以上の結果から、化合物１、３、４及び５にはアスコルビン酸よりも高い抗酸化作用があり、特に化合物１には高い抗酸化作用があることが分かった。また、化合物２は、アスコルビン酸よりは劣るが抗酸化作用があることが分かった。これらのことから、化合物１〜５、特に化合物１は抗酸化剤として有効であることが分かる。

＜試験例２：抗菌作用＞
上記実施例により得られた化合物１、３〜５について、抗菌液体培地での段階希釈法によって抗菌作用を試験した。すなわち、段階的に希釈した一連の化合物の溶液及び一定量の試験菌液を栄養培地に添加し、一定時間培養する。菌が発育すると液が濁り、添加した色素の色が変わる。これにより、菌の発育がまったく認められない化合物の最小濃度（ＭＩＣ）を測定する方法が液体希釈法である。

試験菌液を添加した栄養培地（栄養培地９９μＬに対して試験菌液１μＬ）に、上記化合物１〜５のそれぞれを０．０１ｇ／ｍＬ（１ｗ／ｖ％）のＤＭＳＯ溶液に調整した試料を添加する。試料濃度は、培地上濃度で最大１００μｇ／Ｌからはじめ、段階希釈を行い、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬの計６ｄｏｓｅで実施した。化合物１については、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬに加えて、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．３１２５μｇ／ｍＬの計１２ｄｏｓｅで実施した。

これらの試料を９６穴丸底ｗｅｌｌプレートに添加して、２４時間静置後、培地の変化を確認し、液の濁りの無／有により活性の有／無を判定し、最小発育濃度（ＭＩＣ）を求めた。これらの試験を３回繰り返し、再現性を確認した。各化合物についてＭＩＣの平均値を算出し、その結果を下記表２に示す。

なお、試験菌液としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びカンジダ・アルビカンス
（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を使用した。
枯草菌：栄養培地はＹＰ培地を用い、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌにはアンピシリンを使用した。培養は、３７℃で２４時間静置培養した。
カンジダ・アルビカンス：栄養培地はサブロー培地を用い、ポジティブコントロールにはシクロヘキシミドを使用した。培養は、２７℃で２４時間静置培養した。

以上の結果から、化合物１、３、４及び５は枯草菌に対して抗菌活性を示し、試料１、３及び４はカンジダ・アルビカンスに対して抗菌活性を示すことが分かった。これらのことから、化合物１、３、４及び５、特に化合物１は、抗菌剤として有効であることが分かる。

＜試験例３：抗癌作用＞
上記実施例により得られた化合物１の腫瘍細胞の増殖に対する影響について、比色法のひとつであるＭＴＴアッセイを用いて試験した。このアッセイは、ＭＴＴ（テトラゾリウム塩）が細胞内に取り込まれると脱水素によってホルマザンに変化するが、これをＤＭＳＯなどの有機溶媒で溶解させると赤紫色の溶液となるので、この溶液の５７０ｎｍにおける吸光度を測定すれば、その吸光度が培養物中の生存細胞の数に比例するという性質を利用したものである。

試験に用いる腫瘍細胞は大日本製薬から購入した、ＨＬ６０（ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＭＣＦ７（ｂｒｅａｓｔ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＨＣＴ１１６（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、ＮＣ
Ｉ−Ｈ２２６（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ａ５４９（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を用いた。各腫瘍細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）並びにペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ アルドリッチ ジャパン社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養後、細胞数を調整し実験に用いた。

９６ｗｅｌｌプレートに、培地２００μＬ、５×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞懸
濁液を９０μＬ、化合物１を０．０１ｇ／ｍＬ（１ｗ／ｖ％）のＤＭＳＯ溶液に調整したものを１０μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間静置培養した。その後、ＭＴＴ試薬を入れ、４時間後に酸性イソプロパノールを添加し、ホルマザンの結晶を溶かして５７０ｎｍの波長で吸光度を測定して、生細胞数の指標とした。（Ｂｅｎｃ
ｈｍａｒｋ Ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製）。なお、化合物１は、１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬの計６ｄｏｓｅで実施した。また、下記式（７）で示すように、細胞生存率はコントロールの値を１００％とし、コントロールに対する割合で求めた。各サンプルは３回実験を行いに再現性を求めた。
細胞生存率（％）＝（Ｓａｍｐｌｅ／コントロール）×１００・・・（７）
なお、上記式（７）中、
Ｓａｍｐｌｅ：化合物添加での吸光度、
コントロール：化合物無添加での吸光度を示す。

そして、上記細胞生存率から、化合物１について、各腫瘍細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ_５０値）を求めた。その結果を下記表３に示す。

以上の結果から、化合物１は、各腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した。特に、化合物１は、ＮＣＩ−Ｈ２２６（非小細胞肺癌）に対して感受性が高いことを示した。このことから、化合物１は抗癌剤として有効であることが分かる。

＜試験例４：抗炎症作用＞
上記実施例により得られた化合物１、４及び５について、抗炎症作用を評価する試験を行った。

体内では、マクロファージは、炎症性刺激に応答してｉＮＯＳ（一酸化窒素合成酵素）の合成を高め、ＮＯやＯ^２−を産生しながら細菌や癌細胞を攻撃する。しかしながら、過剰に生成されたＮＯはＯ^２−と合体して障害性の強いラジカル（ＯＮＯＯ−：ベルオキシニトライト）となり、周辺の血管や組織を破壊して炎症や発熱を生じてしまう。そこで、本試験では、ＬＰＳ（リポ多糖）によってマクロファージによるｉＮＯＳ発現を誘導させた状態において、化合物１、４及び５による一酸化窒素産生抑制作用をみることにより、抗炎症作用を評価した。

マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１細胞は理研ＢＲＣより提供された。細胞は１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）並びにペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ アルドリッチ ジャパン社製）で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養後、細胞数を調整し実験に用いた。

９６ｗｅｌｌプレートに１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞懸濁液を１００μＬ播
種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１２時間静置培養した。次に培養細胞をリン酸バッファーで洗浄後、化合物１、２及び５をそれぞれ加えて各濃度に調整したＬＰＳ５μｇ／ｍＬを含む培地で、細胞を２４時間静置培養した。なお、化合物１については、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬの計５ｄｏｓｅで実施した。また、化合物４及び５については、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬの計４ｄｏｓｅで実施した。

一酸化窒素産生能は、Ｇｒｉｅｓｓ ａｓｓａｙ法により測定した。２４時間培養した各上清１００μＬを９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ移し変え、そこにＧｒｉｅｓｓ試薬（１％ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ、０．１％ Ｎ−１−ｎａｐｈｔｙｌｅｔｈｅｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎ ２．５％ Ｈ_３ＰＯ_４）を１００μＬ加えた。室温で１５分インキュベーション後、５４０ｎｍと６２０ｎｍの試
験波長で吸光度を測定した（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒ、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）。

一酸化窒素産生阻害率は、下記の計算式（８）により求めた。なお、各サンプルは３回実験を行いに再現性を求めた。ポジティブコントロールとして、Ｎ^Ｇ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｅｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ（ＬＮＭＭＡ、シグマ アル
ドリッチ ジャパン社製）を用いた。このＬＮＭＭＡのＩＣ_５０は８８．４μＭであった。
阻害率（％）＝（（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ））×１００・・・（８）
なお、上記式（８）中、
Ａ：ＬＰＳ（＋）、化合物（−）の場合の吸光度
Ｂ：ＬＰＳ（＋）、化合物（＋）の場合の吸光度
Ｃ：ＬＰＳ（−）、化合物（−）の場合の吸光度
（Ａ−Ｃ：ＮＯ_２ ⁻濃度（μＭ）に対応）を示す。

さらに、マイクロプレートに付着した細胞をＭＴＴアッセイ法により、細胞障害及び誘導がないことを確認し、細胞生存度（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）として図３〜図５
のグラフ中に表した。

各化合物の一酸化窒素産生阻害率及び細胞生存度を図３〜５に示す。化合物１、４及び５はいずれも正常細胞に対して毒性もなく、濃度依存的にＮＯの生成を抑制することが分かる。

また、炎症時の過剰な一酸化窒素の産生は炎症その他の様々な障害をもたらすことから、一酸化窒素の生成を抑制できる化合物１、４及び５は、ヒトへの応用が期待できる植物成分である。例えば、機能性食品への応用や、種々の要因により過剰なＮＯの発現を抑制することにより、一酸化窒素産生抑制を必要とする疾病の治療および予防に有効である。したがって、化合物１、４及び５、特に化合物１は、一酸化窒素産生抑制剤や抗炎症剤の有効成分としての使用が期待できる。

本発明の式（１）で示される新規物質は、天然由来の成分で安全性が高く、抗酸化作用、抗菌作用、抗癌作用、抗炎症作用を有しているため、この新規物質を有効成分として配合した医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物又は食品添加物として利用することができる。

Claims (9)

1. 下記式（１）で示される新規物質。
   

   
2. 請求項１記載の式（１）で示される新規物質を含有することを特徴とする抗酸化剤。
3. 請求項１記載の式（１）で示される新規物質を含有することを特徴とする抗菌剤。
4. 請求項１記載の式（１）で示される新規物質を含有することを特徴とする抗癌剤。
5. 請求項１記載の式（１）で示される新規物質を含有することを特徴とする抗炎症剤。
6. 前記新規物質がラン科植物から抽出されることを特徴とする請求項２記載の抗酸化剤。
7. 前記新規物質がラン科植物から抽出されることを特徴とする請求項３記載の抗菌剤。
8. 前記新規物質がラン科植物から抽出されることを特徴とする請求項４記載の抗癌剤。
9. 前記新規物質がラン科植物から抽出されることを特徴とする請求項５記載の抗炎症剤。

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