KR100835710B1

KR100835710B1 - 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물 및이의 식품으로의 용도

Info

Publication number: KR100835710B1
Application number: KR1020070095740A
Authority: KR
Inventors: 조동하; 김명조; 진쳉유; 류승원; 유창연; 이범구; 이명구; 조재열
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2008-06-09
Also published as: KR100815476B1; KR20070105812A; KR20070111409A

Abstract

본 발명은 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물 및 이의 식품으로서의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물이 항균 및 항산화 활성을 나타냄을 밝히고, 이를 식품으로 적용하기 위한 새로운 용도에 관한 것이다.

케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae), 캠프페롤 화합물

Description

케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물 및 이의 식품으로의 용도{KENAF EXTRACT AND NOVEL KAEMPFEROL COMPOUND ISOLATED THEM, AND ITS USE FOR FOOD}

본 발명은 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물 및 이의 식품으로의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물이 항균 및 항산화 활성을 나타냄을 밝힘으로써 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품에 관한 것이다.

캠프페롤(kaempferol)은 항산화, 항균성, 항노화 효과를 가진 플라보노이드계 성분이다.

산마늘로부터 단리한 캠프페롤은 콜레스테롤 저하 활성을 나타내며, 아프리카에서 자생하는 부용으로부터 단리한 캠프페롤은 현저한 화장품·미백효과가 인정되었다. 쑥부쟁이에 함유한 캠프페롤은 진해·거담효과가 상당히 좋은 것으로 알 려져 있으며, 채소의 플라보노이드(flovonoid) 성분인 캠프페롤은 항암 및 항비만 효과가 있는 것으로 연구되어 있다. 그러나, 상기한 각 식물체로부터 생산되는 캠프페롤의 생산량은 아주 소량으로 알려져 있다.

또한 식물체 유래의 캠프페롤 화합물은 유기합성으로 얻어진 캠프페롤 화합물보다 부작용이 낮아 인체에 직접적으로 이용할 수 있고, 친환경적인 화합물로서 개발 가능성이 높기 때문에 폭넓은 연구가 진행되고 있다.

이러한 시대적 요구에 부응하기 위하여 본 발명자들은 천연자원으로부터 항산화, 항노화, 항비만 등의 활성을 나타내는 캠프페롤 화합물을 다량으로 얻어내는 방법을 조사하는 과정에서 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae)의 추출물이 상기한 항산화, 항균성 및 항노화 등의 다양한 기능성을 발현하면서도 다량의 캠프페롤을 함유하고 있음을 발견하여 선별하였다.

케나프는 아욱과에 속하는 섬유작물로서 줄기는 종이와 펄프로 이용되고 있으나, 이 식물체의 잎에 대한 생물학적 활성은 아직 밝혀진 바가 없다.

본 발명자들은 케나프 추출물 및 그 유래 화합물의 항균 및 항산화 활성을 실험실 수준에서 조사하였을 뿐만 아니라 제약, 화장품산업 및 기능성식품 등에 대한 케나프의 이용 가능성을 검증하고자 연구한 결과, 상기 항균 및 항산화 효과가 탁월함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 항산화, 항균성, 항노화 효과가 있는 케나프 잎 추출물 및 이로부터 분리한 신규화합물로서 캠프페리트린(kaempferol-3,7-O-a-dirhamnoside; kaempferitrin) 및 이의 용도를 제공하는 발명으로서, 케나프에는 상기한 신규 캠프페롤 화합물이 5 ~ 8 중량% 정도로 다량으로 함유되어 있어 의약품, 의약부외품, 화장품첨가물, 식품첨가물, 음료첨가물 및 기능성 건강보조식품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 항균 및 항산화 활성을 나타내는 케나프 추출물 및 그 유래의 신규 켐프페롤 화합물 및 이의 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 과제를 해결하기 위한 일례로서, 본 발명의 항균활성능을 가지는 기능성 식품은, 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 로부터 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것임을 특징으로 한다.

[화학식 1]

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물이 항균 및 항산화 활성을 나타냄을 밝힘으로써 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품에 관한 것이다.

본 발명에서는 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 추출물과 이로부터 분리된 신규 켐프페롤 화합물의 항균 및 항산화 활성을 조사하기 위하여, 이 화합물을 이용하여 항균활성을 고바야시 등의 항미생물 시험(antimicrobial test;Kobayashi, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58:133-134, 1994) 방법으로 조사한 결과 항균 및 항산화 활성을 나타내어 이러한 특성이 발현되는 기능성 식품, 식품 보존료 등으로 제공 되어질 수 있다.

본 발명에서 케나프 추출물을 제조하기 위해서는 여러 가지 방법들이 제안될 수 있으나, 본 발명에서는 단순한 추출 방법에서부터 지용성 성분까지 추출할 수 있는 모든 방법이 적용될 수 있으며, 이러한 추출 방법은 항균 및 항산화 활성을 나타내는 케나프 추출물을 제조하는 방법이라면 어느 방법이나 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 케나프 추출물의 추출방법의 일례로서는 증류수 중탕 추출법, 유기용매 추출법이 적용될 수 있으며, 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올을 포함하는 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산, 에틸아세테이트 등이 사용될 수 있다.

또한, 케나프 추출물로부터 상기 화학식 1로 표시되는 신규 캠프페롤 화합물의 분리 정제 방법은 다음과 같으나, 이에 한정하지 않는다.

1) 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 잎 부위를 메탄올로 추출하여 메탄올 조추출물을 수득하는 단계;

2) 상기 메탄올 조추출물을 물, 지방족 알콜, 알콜 수용액, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 벤젠 및 부탄올 중에서 선택된 용매로 추출하여 물층 및 유기층을 수득하는 단계;

3) 상기 물층 및 유기층을 순상 실리카 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 톨루엔, 아세톤 및 메탄올 혼합물의 비율을 톨루엔과 아세톤 및 아세톤과 메탄올의 비율을 변화시키면서 용출시켜, 항균 및 항산화 활성이 확인된 분획들(톨루엔 : 아세톤, 아세톤과 메탄올)을 수득하는 단계;

4) 상기 분획을 2차 순상 실리카 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 물과 메탄올(10 : 0 ~ 5 : 5)의 비율로 변화시키면서 용출시켜 활성 분획을 수득하는 단계;

5) 상기 분획을 40 % 메탄올을 용매를 사용하여 겔 필터 크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 정제하는 단계; 및,

6) 상기 정제된 분획을 최종적으로 재결정 방법 및 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 단일 활성 화합물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 로부터 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법을 포함한다.

우선, 건조된 케나프를 추출한 후 여과하여 액상의 추출액을 얻는다. 이때 추출용매로는 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 선택 된 유기용매가 사용될 수 있으며, 지방족 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올을 포함하며, 바람직하게는 메탄올을 사용하는 것이다. 이 추출액을 감압 농축한 다음 증류수로 용해하여 헥산 용매로 분획한 후 점차적으로 에칠아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하며 최종적으로 수층을 분리한다. 항균 및 항산화 활성이 확인된 에칠아세테이트 분획은 여러 단계의 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 및 Sephadex LH-20)를 단계별로 실시하여 분리하였고, 최종단계에서 항산화활성이 높은 화합물을 재결정 방법 및 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 단일 활성 화합물을 정제한다.

이렇게 얻은 화합물은 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, FAB-MS 등의 분석기기를 이용하여 구조 분석한 결과, 최종적으로 노란색 오일상의 화합물로서 분자식이 C₂₇H₃₁O₁₅이고, 분자량이 579[M-H]⁺이며, 상기 화학식 1로 표시되는 신규 캠프페롤 화합물로서 항균 및 항산화에 대하여 우수한 활성을 나타내었다.

본 발명에서 제공하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품은 유효성분으로 케나프 추출물 또는 캐나프 유래 캠프페롤 화합물을 포함하며, 이때 유효성분은 각각의 단일 성분일 수 있으나, 사용목적 및 방법에 따라 2종 이상의 혼합물일 수도 있다. 혼합물의 혼합비는 적용하고자 하는 용도에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하며, 예컨대 각 혼합물의 구성성분은 동일 중량비율일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품은 유효성분만을 단독으로 포함할 수 있으며, 유효성분을 0.1 ~ 20 중량%, 바람직하기로는 1 ~ 5 중량%로 포함하고 잔량의 부형제를 더욱 포함할 수 있다.

상기와 같은 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물은 식품산업 뿐만 아니라 의약학 분야에도 다양한 적용 가능성을 가지고 있음을 확인할 수 있으며, 특히 항균제, 항산화제, 기능성식품 및 제약으로서의 응용 가능성이 높음을 알 수 있다. 본 발명의 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주 사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 아미노화 β-글루칸을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 ~ 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 ~ 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ~ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ~ 3 회 분할 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물을 유효성분으로 하는 기능성 식품 및 건강보조제를 포함한다. 상기 건강보조제는 케나프 추출물 및 신규한 캠프페롤 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하므로 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 케나프 추출물 및 이로부터 분리된 화학식 1의 캠프페롤 화합물은 항균활성능을 가지는 기능성 식품의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다 음 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고사항

본 발명의 실시예에서 사용된 기기는 다음과 같다. ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 Varian Gemini 200(200MHz)을 사용하여 측정하였다. MS는 질량분석기(Micromass)를 이용하여 FAB positive mode 및 EI mode로 측정하였다. TLC 플레이트(plate)는 Merck 사 제품(Precoated Kieselgel 60 F_254s: art. NO. 5715)와 RP-8 F_254s: Art. NO. 15424)을 사용하였으며, 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)의 담체는 Kieselgel 60(70-230 mesh ASTM, Merck, Art. NO. 7734), Kieselgel(230-400 mesh ASTM, Merck, Art. NO. 9385), YMC gel ODS-A(70-230 mesh, Art. NO. AA12SA5) 및 Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech AB)를 사용하였다. TLC 전개용매 및 기타 시약은 일급 및 특급시약을 사용하였고, 추출용매 및 컬럼 크로마토그래피용 용매는 공업용 시약을 재증류하여 사용하였다.

실시예 1 : 케나프 추출물의 제조

본 발명에서 사용한 케나프(kenaf)는 부안 간척지농지에서 재배한 후 2005년 9월에 채집하여 시료로 사용하였으며, 생명공학부 식물생명공학전공 표본실에 보관중이다.

실온 음지에서 건조시킨 케나프 잎(133g)을 호모게나이저(Homogenizer, PH- 91, AMT)로 마쇄한 다음 메탄올로 1 주일씩 3회 반복 냉침 추출하여 추출액을 한데 모아 감압 농축하여 메탄올 추출물(MeOH ext.) 24.6g을 얻었다.

실시예 2 : 케나프 추출물로부터 물 및 유기용매 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 얻어진 메탄올 추출물 24.6g은 증류수로 현탁하여 헥산(hexane)으로 분획하고 (5.2g), 남은 수층을 다시 에틸아세테이트(EtOAc)로 분획하여 에틸아세테이트 분획물(4.4g)을 얻었고, 남은 수층을 다시 부탄올(BuOH)로 분획하여 부탄올 분획물(4.6g)을 얻었으며 최종적으로 물분획 9.3g을 얻었다.

상기 각각의 분획층을 이용하여 항균 및 항산화 활성을 조사하였으며, 상기분획층의 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 항균 및 항산화 활성을 확인하였다.

실시예 3 : 케나프로부터 신규 캠프페롤 ( kaempferol ) 화합물의 분리

상기 실시예 2의 메탄올 추출물로부터 얻은 용매분획 중 지표물질을 분리ㆍ정제하였다. 지표물질이 함유된(도 1의 HPLC 크로마토그램 참조) EtOAc 분획 4.4 g을 메탄올로 용해시킨 다음 실리카 겔을 충진시킨 유리 칼럼(Ø 5 x 70cm, 7734, Merck사)을 이용한 순상 실리카 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 톨루엔, 아세톤 및 메탄올 혼합물의 비율을 톨루엔과 아세톤 및 아세톤과 메탄의 비율을 변화시키면서 용출시켜, 항산화 활성이 확인된 10개의 소분획들(톨루엔 : 아세톤, 아세톤과 메탄올)을 얻었다.

이 중 지표물질이 함유된 소분획 7(톨루엔 : 아세톤, 1.153g)을 대상으로 2 차 오픈 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. ODS(YMC gel ODS-A(70-230 mesh, Art. NO. AA12SA5)를 유리 칼럼(Ø 1.6 x 100 cm)에 충진하고 HPLC용 펌프를 이용하여 물과 메탄올의 비율로 변화시키면서 용출시켜 400개의 활성 소분획을 얻었고, 이중 지표물질이 보인 소분획 259-316(물 : 메탄올, 605.8mg)을 얻었다.

상기 얻어진 지표물질 함유 소분획을 다시 40 % 메탄올을 용매를 사용하여 겔 필터 크로마토그래피[Sephadex LH-20, Pharmacia Biotech사, 유리칼럼(Ø 1.0 x 50cm)]를 실시하여 단일 활성 화합물을 정제하여 최종적으로 지표화합물(25mg)을 얻었다. 정제하고, 상기 정제된 분획을 최종적으로 재결정 방법 및 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 단일 활성 화합물을 정제하여 최종적으로 지표화합물(25mg)을 얻었다.

실시예 4 : 신규 캠프페롤 화합물의 구조분석

본 실험을 통해 분리된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정하기 위해, 핵자기 공명(¹H-NMR 및 ¹³C-NMR은 Varian Gemini 200(200MHz)을 이용하여 ¹H, ¹³C 스펙트럼을 얻었다. 또한, 질량분석은 질량분석기(Micromass, Hewlett packard 5989A)를 이용하여 FAB 포지티브 모드 및 EI 모드로 측정하여 분자량 및 분자식을 결정하였으며, 그 결과를 도 1 내지 2 나타내었다.

IR υ_max: KBr cm^-1 3470-3353(OH), 2927, 1727(>C=O), 1601(aromatic), 1458(cycloalkane), 1189(phenol);

¹H-NMR(200MHz, MeOH-d4) ppm: δ 7.78(2H, d, J=8.8, H-2'& H-6'), 6.91(2H, d, J=8.8, H-3'& H-5'), 6.77(1H, d, J=1.6, H-8), 6.44(1H, d, J=1.4, H-6), 5.42(1H, brs, H-1"), 1.18(1H, H-6'), 0.79(3H, d, J=4.4 Hz, H-6");

¹³C-NMR(50MHz, MeOH-d4) ppm: 178.7(s, C-4), 162.5(s, C-7), 161.7(s, C-5), 160.9(s, C-4'), 158.6(s, C-2), 156.9(s, C-9), 135.3(s, C-3), 131.5(d, C-2', C-6'), 121.1(s, C-1'), 116.2(d, C-3', C-5'), 106.5(s, C-10), 102.6(s, C-1"), 100.2(s, C-6), 99.1(s, C-1"'), 95.3(s, C-8), 72.3(d, C-4",4"'), 71.8(s, C-3"'), 71.4(s, C-3"), 70.9(d, C-2", 2"'), 70.8(s, C-5"'), 70.5(s, C-5"), 18.5(s, C-6"'), 18.1(s, C-6"). FAB-MS: m/z 579[M+H]⁺

상기 분리된 캠프페롤 화합물은 IR 스펙트럼(spectrum)의 경우 3471㎝^-1에서 OH에 의한 흡수 1720㎝^-1 부근에서 C=O, 1601㎝^-1에서 방향족(aromatic) C=C결합을 나타내는 흡수대가 나타났고, UV 스펙트럼의 216, 242, 300(sh), 326nm에서 흡수 극대가 나타나는 것으로 보아 이 화합물은 후라보노이드(flavonoid) 배당체 화합물로 추정되었다(Sakushima et al., 1985).

¹H-NMR 스펙트럼에서 meta coupling 하는 두 아로마틱 프로톤(aromatic proton)의 시그널(signal) δ 6.77(1H, d, J=1.6, H-8), 6.44(1H, d, J=1.4, H-6) 과 오르토 커플링(ortho coupling)하고 있는 두 아로마틱 프로톤 유래의 δ 7.78(2H, d, J=8.8, H-2'& H-6'), 6.91(2H, d, J=8.8, H-3'& H-5') 시그널l이 관측되었다(Pakulski et al., 1996).

또한, ¹³C-NMR 스펙트럼의 δ 178.7과 162.5에서 4번과 7번 탄소의 시그널이 나타나고, δ 161.7과 158.6에서 5번과 2번 탄소의 시그널을 확인할 수 있었으며, δ 70.5과 18.5는 람노실(rhamnosyl)에 기인하는 5˝번과 6˝번 탄소 시그널을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하여 각종 스펙트럼 데이타(spectral data)를 문헌치(Inigo P. A. R., De Iglesisa I. A. D. and Catalan A. N. C. (1988) Kaempferol 3-a-D-glucopyranoside-7-a-rhamnopyronoside from Erythroxylon cuneifolium. Phytochemistry 27(4):1230-1231. 1988)와 비교하여 이 화합물을 캠프페리트린(kaempferol-3,7-O-a-dirhamnoside ; kaempferitrin)으로 동정하였다.

상기 분리 정제된 신규 캠프페롤 화합물은 황색 오일(Yellow oil)을 형성하고 있는 화합물로서, 분자식이 C₂₇H₃₁O₁₅이고, 분자량이 579[M-H]⁺로 결정되었으며, 그 구조식은 다음 화학식 1에 나타내었다.

[화학식 1]

실시예 5 : 케나프 추출물 및 신규 캠프페롤 화합물의 항산화 활성 검정

항산화활성 조사

항산화활성은 자유 라디칼(Free radical)인 1, 1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)을 사용한 항산화활성 측정방법(Blois, Nature, 188: 1199, 1958; Choi, et al., Kor. J. Phamacogn, 24: 299-303, 1993)으로 조사하였다. 시료 화합물용액 1ml를 농도 별 (100-2000ppm)으로 첨가한 다음 상기 DPPH(0.15 mM)용액을 4ml첨가하여 실온에서 30분간 반응시키고 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 RC₅₀ (㎍/ml)은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도를 나타낸다.

케나프로부터 분리된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 캠프페롤 화합물의 항산화에 대한 활성을 조사하기 위하여 자유 라디칼(Free radical)인 1, 1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)을 사용한 항산화활성 측정방법(Blois, Nature, 188: 1199, 1958; Choi, et al., Kor. J. Phamacogn, 24: 299-303, 1993)으로 실험을 수행하였으며 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.

추출물과 분획	RC₅₀ ² ⁾(㎍/㎖)
MeOH 추출물	599
헥산 분획	755
EtOAc 분획	294
BuOH 분획	441
수층 분획	1992
1) 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 2) Amount required for 50% reduction of DPPH after 30 min.

실시예 6 : 케나프 추출물 및 신규 캠프페롤 화합물의 항미생물 활성 검정

항미생물 활성 조사

항미생물 활성은 고바야시(Kobayashi, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58: 133-134, 1994) 등의 방법에 따라 조사하였다. 곰팡이 균주로는 아스페리길루스 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococus aureus), 살모넬라 티치무리움클라도스포리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 페우모니에(Kelbsiella pneumoniae)을 사용하고, 이들 곰팡이 배양용 PDB 슬란트(Slant)에 곰팡이 포자발아저해시험용 배지 2 ml를 첨가하여 유리봉으로 상기 곰팡이 포자를 분리시키고 이를 다시 가제로 여과하였다. 그 여과액을 얻어 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 현미경으로 관찰하면서 시야에 50개의 포자가 관찰될때까지 희석하였다. 상기의 시료를 4 에서 1000ppm 농도까지 제조하여 상기 웰에 가하고 27℃에서 24시간 동안 암배양 후 현미경으로 포자발아가 저해되는 활성을 측정한다.

또한, 세균균주로는 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 에스체리시아 콜라이(Escherichia coli)를 사용하고, 이들 세균주들을 NB배지 10 ml에 이식하여 27℃에서 12시간 동안 진탕배양한 후 바실루스 섭틸리스는 10⁶/ml, 에스체리시아 콜라이는 10⁷/ml이 되도록 NB배지로 희석한다. 그 다음 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 상기의 시료를 4 에서 1000 ppm 농도까지 제조하여 상기 웰에 가하고 27℃에서 24시간 동안 암배양 후 현탁도를 기준으로 세균 성장저해 활성을 측정한다.

케나프로부터 분리된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 캠프페롤 화합물의 항미생물에 대한 활성을 조사하기 위하여 고바야시(Kobayashi, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58: 133-134, 1994)의 방법으로 실험을 수행하였으며 그 결과를 다음 표 2에 나타내었다.

균주 용매	케나프 잎 추출물(㎍/㎕)
균주 용매	Staphylococus aureus	E. coli	Salmonella tyhimurium	Klebsiella pneumoniae	Bacillus subtilis
MeOH 추출물	> 1000	500	125	500	1000
Hexane 분획	250	125	125	250	500
EtOAC 분획	500	125	125	250	500
BuOH 분획	> 1000	1000	500	500	500
Water 분획	> 1000	500	125	500	500

실시예 7: 케나프 추출물 및 캠프페롤 화합물의 급성 독성시험

① 실험용 쥐에 대한 비경구 투여 독성실험

케나프 추출물 및 화학식 1의 캠프페롤 화합물에 대해서 급성독성 시험을 수행하기 위하여 체중 25 g 정도의 6 주령 ICR 마우스(♂, 대한 바이오)를 군당 2 마리씩 4군으로 나누어 온도 22 ± 3 ℃, 습도 55 ± 10%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일사료, 마우스 및 랫트용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.

케나프 추출물 및 화학식 1의 캠프페롤 화합물을 소량의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 후 1% 카르복실메틸셀룰로오스 용액으로 희석하여 각 군당 100 mg/kg, 50 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg의 용량으로 조제하여 단회 경구 투여하였으며, 대조군은 1% 카르복실메틸셀룰로오스 용액을 사용하였다. 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다.

또한, 투여 7일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 케나프 추출물 및 화학식 1의 캠프페롤 화합물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 특기할만한 임상 증상은 없었으며, 100 mg/kg 투여군에서도 동물이 사망하지 않아 경구 투여 최소 치사량(LD50)은 100 mg/kg 이상일 것으로 추정되었으며, 부검소견의 경우 사망동물 및 생존 동물에서 시험 관련 물질과 관련된 특이 소견은 관찰되지 않았다.

② 실험용 쥐에 대한 비경구 투여 독성실험

상기 경구 투여 독성실험과 동일한 실험용 쥐를 사용하여, 본 발명의 실시예 3에 따라 분리된 화학식 1의 캠프페롤 화합물 2 mg 씩 근육주사 방법으로 투여하였다. 실험용 쥐 한 마리에는 2주 간격으로 2번, 다른 한 마리의 실험쥐에는 2 주 간격으로 2회 투여 후, 1 개월의 간격을 둔 다음 다시 2 주 간격으로 3회 투여를 실시하였다.

처음 주사 후 6 개월간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관(physical examination), 혈액세포의 이상(haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타내었다.

실시예 8 : 제제화 예

상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1의 캠프페롤 화합물은 우수한 항균 및 항산화 활성을 나타내어, 식품과 의학품의 약제 조성물로 제제화할 수 있으며, 또한 건강보조식품으로 제조할 수 있다.

① 시럽제의 제조

본 발명의 화학식 1의 캠프페롤 화합물을 유효성분으로 2 중량% 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 캠프페롤 화합물 2 g, 당 25.4g 을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0 g, 사카린 0.8 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르빈산 0.4 g 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

② 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 캠프페롤 화합물 2 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

③ 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

화학식 1의 캠프페롤 화합물 0.2g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

④ 건강보조 음료의 제조

화학식 1의 캠프페롤 화합물 2 g을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

도 1은 화학식 1의 화합물에 대한 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 2는 화학식 1의 화합물에 대한 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

Claims

케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 로부터 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것임을 특징으로 하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품.

[화학식 1]
청구항 1에 있어서,

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은,

1) 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 잎 부위를 메탄올로 추출하여 메탄올 조추출물을 수득하는 단계;

2) 상기 메탄올 조추출물을 물, 지방족 알콜, 알콜 수용액, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 벤젠 및 부탄올 중에서 선택된 용매로 추출하여 물층 및 유기층을 수득하는 단계;

3) 상기 물층 및 유기층을 순상 실리카 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 톨루엔, 아세톤 및 메탄올 혼합물의 비율을 톨루엔과 아세톤 및 아세톤과 메탄올의 비율을 변화시키면서 용출시켜, 항균 및 항산화 활성이 확인된 분획들(톨루엔 : 아세톤 아세톤과 메탄올)을 수득하는 단계;

4) 상기 분획을 2차 순상 실리카 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 물과 메탄올(10 : 0 ~ 5 : 5)의 비율로 변화시키면서 용출시켜 활성 분획을 수득하는 단계;

5) 상기 분획을 40 % 메탄올을 용매를 사용하여 겔 필터 크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 정제하는 단계; 및,

6) 상기 정제된 분획을 최종적으로 재결정 방법 및 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 단일 활성 화합물을 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법으로 분리된 것임을 특징으로 하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품.
다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 케나프(Hibiscus cannabbinus L., Malvaceae) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것임을 특징으로 하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품.

[화학식 1]
청구항 3 있어서,

상기 추출물의 추출용매가 물, 지방족 알콜 또는 알콜 수용액, 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 항균활성능을 가지는 기능성 식품.