KR101025160B1

KR101025160B1 - 항염증 및 면역증강을 위한 조성물

Info

Publication number: KR101025160B1
Application number: KR1020100037797A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 이사빈; 이강준; 안효민; 유대성; 변세은
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2011-03-31

Abstract

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 위한 조성물에 관한 것으로, 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 산화질소(nitric oxide, NO)와 종양괴사인자(TNF-α) 및 프로스타글란딘(PGE₂)의 발현 및 생성을 억제하도록 하여 항염증 및 면역조절 활성에 효과가 있으며, 염증질환 및 염증반응과 관련된 질환에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

항염증 및 면역증강을 위한 조성물{COMPOSITION FOR ANTIINFLAMMATORY AND IMMUNITY INCREASE}

본 발명은 항염증 및 면역증강을 가지는 유효성분을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

염증(炎蒸, inflammation)이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(渗出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다.

또한, 여러 가지 형태의 감염(infection)이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 대한 생체 내 방어기전의 발현이라 할 수 있고, 다양한 화학적 매개체가 염증의 발현 기전에 관여하고 있으며, 그 병인도 매우 복잡하다.

이는 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴, 약화시키거나 차폐하는 작용을 한다. 이러한 염증의 특징은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되며, 백혈구가 염증 조직으로 이동한다는 것으로, 통상적으로 홍반, 부종, 통각과민 및 통증 등의 임상적 증상들을 동반한다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide : NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase : NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련된 효소들의 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려진 바 있다.

이에 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 작용을 하고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등이 있으며, 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있고, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 향상성 유지에 중요한 역할을 한다.

이에 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다.

TNF-α와 같은 다기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부 질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다.

또한, 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다.

따라서, 발암촉진단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE₂의 생성 억제를 통해 초기 염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.

즉, 세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)를 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우에 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨-1, 인터류킨-2), 세포 사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자(산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE₂)를 방출하고, 또한 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절한다.

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 셉틱 쇼크나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병과 같은 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

한편, 현재까지의 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflannatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다.

즉, 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하여 치료하고 있으나 일반적인 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 이용되기 때문에 치료 작용 및 부작용을 공유하게 된다. 이 중 부작용에는 호흡촉진현상, 순환계 붕괴, 상복부 통증, 구토, 위장출혈, 간 손상 및 혈소판 저해 등의 증상이 알려진 바 있다.

이러한 부작용 때문에 기존의 항염증성 약제는 장기적으로 사용하기가 곤란하고, 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이며, 부작용에 대한 우려가 없는 인체에 안전한 항염제의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 항염증 및 면역조절의 활성에 대한 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.

이러한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 태양으로 항염증 및 면역조절 활성을 위한 조성물은 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 산화질소(NO)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 종양괴사인자인 TNF-α의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

그리고 상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은, 드라이오크라신(Dryocrassin), 드라이오크라솔(Dryocrassol), 드라이오크라실 아세테이트(Dryocrassyl acetate), 페르닌(Fernene) 및 플라바스피딕 에이시드(Flavaspidic acid) 중 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol)을 유효성분으로 함유하는 조성물로, 산화질소(nitric oxide, NO)와 종양괴사인자(TNF-α) 및 프로스타글란딘(PGE₂)의 발현 및 생성을 억제하도록 하여 항염증 및 면역조절 활성에 효과가 있으며, 염증질환 및 염증반응과 관련된 질환에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도1의 (a)는 조성물의 산화질소 억제 효과에 대하여 도시하고, (b)는 같은 조건 하에서의 세포생존율에 대하여 도시한다.
도2는 조성물을 이용한 종양괴사인자(TNF-α)의 생성 억제 효과에 대하여 도시한다.
도3의 조성물을 이용한 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성 억제 효과에 대하여 도시한다.
도4는 조성물에 대한 NF-κB의 활성 억제 기전을 살펴보기 위해 Luciferase assay를 이용한 NF-κB의 전사 활성 평가에 대하여 도시한다.
도5는 조성물에 대한 β-actin, p-lκBα의 단백질 발현 변화에 대한 것을 도시한다.
도6은 조성물에 대한 쥐 귀 부종 실험의 데이터를 도시한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지되어진 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

본 발명의 항염증 및 면역증강을 위한 조성물은 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

트리스노르호파논(Trisnorhopanone)은 17-alpha(H)-Trisnorhopanone, 17-beta(H)-Trisnorhopanone으로 구성된다.

캄페스테롤(campesterol)은, 콩 및 대두식물 종자 및 해바라기씨에 존재하며 샐러드 드레싱과 마가린 형태의 기능성 식품에 이용한다. Total-콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 수치를 낮추어 관상심장질환의 위험을 줄이는 역할을 하며, 고콜레스테롤혈증을 가진 사람들에게는 치료제로도 이용된다.

캄페스테롤의 화학식은 C28H48O 이고, 분자량이 400.68 이다. 식물계에서 많이 발견되어 식물스테롤이라고 하며, 화학적으로 콜레스테롤과 유사하다. 피토스테롤(phytosterol)중에 2번째로 풍부한 물질이다. 캄페스테롤은 side chain의 24th carbon 자리에 메틸그룹이 존재하는 것이 콜레스테롤과 다르며, cholestane 계열의 4-desmethylsterols로서 분류되어진다. 대두식물 종자 및 해바라기씨에 존재하며, 샐러드 드레싱과 마가린 형태의 기능성 식품에 이용한다.

캄페스테롤은 Total-콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 수치를 낮추어 관상심장질환의 위험을 줄이는 역할을 한다. 캄페스테롤은 식이 콜레스테롤 흡수와 위장관의 내생적인 콜레스테롤 재흡수를 억제하고, 콜레스테롤을 변으로 배설하여 세럼 콜레스테롤 수치를 줄이게 된다. 또한 담즙산염으로 콜레스테롤을 치환하거나 장점막에서 콜레스테롤 에스테르화 억제를 통하여 콜레스테롤 수치를 낮추는 것으로 나타났다. 고콜레스테롤혈증을 가진 사람들이 치료제로 이용하며, 임신부나 모유로 아이를 키우는 어머니는 섭취를 피해야 한다.

이 밖에도 항염증 및 면역조절 활성을 위한 조성물은 디플로프테롤(Diplopterol), 드라이오크라신(Dryocrassin), 드라이오크라솔(Dryocrassol), 드라이오크라실 아세테이트(Dryocrassyl acetate), 페르닌(Fernene) 및 플라바스피딕 에이시드(Flavaspidic acid) 등을 더 포함하여 구성되는 것도 가능하다.

한편, 본 발명의 항염증 및 면역조절 활성을 위한 조성물은 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol) 등의 성분을 가지는 관중에서 추출하여 이용하는 것도 가능하다.

본 발명에서는 트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol) 등을 유효성분으로 함유하는 조성물에 대한 항염증의 효능을 알아보기 위해 RAW 264.7 대식 세포주를 선택하여 리포폴리사카라이드(이하, LPS)로 산화적 스트레스를 유발시키고, 조성물을 처리하여 산화질소(nitric oxide, NO) 및 종양괴사인자(TNF-α)의 발현 및 생성을 억제하는 반응에 대한 실험을 하였다.

이때, 실험에 이용되는 항염증 및 면역조절 활성을 위한 조성물은 관중(貫衆)으로부터 추출하여 실험하도록 하였다.

<1. 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 측정>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여, 활성화를 유도한 다음, 조성물의 양(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100㎍/㎖)을 각각 다르게 처리하여 24시간 동안 배양하여, 산화질소의 생성을 측정하였다.

산화질소(NO)는 정상적인 방어 작용뿐만 아니라 만성 및 악성염증질환에서 독성을 가지며 전염증성 매개자로서 잘 알려져 있다. 본 발명에서는 조성물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 대식세포로부터 생성되어지는 산화질소가 억제됨을 관찰하였다.

그 결과, 도1에 도시된 바와 같이, 조성물의 양에 따라 산화질소의 생성되는 정도가 줄어드는 것을 알 수 있었다.

도1의 (a)에서는 조성물의 양이 100㎍/㎖로 많아질수록 산화질소의 생성이 감소하는 것을 알 수 있으며, 100㎍/㎖에서는 산화질소 생성이 20% 이하인 것을 알 수 있다.

그리고 도1의 (b)에서는 조성물의 양에 따른 세포생존율을 도시하고 있다.

<2. 종양괴사인자(TNF-α)의 생성 또는 발현 측정>

LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성에 있어 조성물의 억제효과를 알아보기 위하여 ELISA 방법으로 분석하였다.

사이토카인 및 케모카인(TNF-α, IL-6, 1L-1β, MCP-1)은 정상적인 방어응답과 셉틱 쇼크, 류머티즘성 관절염, 자동면역질병과 같은 악성 염증성 질환의 면역질환과 연결된 다양한 생물학적 활성을 가지는 전염증성 사이토카인으로 알려져 있다.

실험에 따른 결과, 도2에 도시된 바와 같이, 조성물의 양이 증가할수록 TNF-α의 생성에 대한 증가율(fold increase)이 감소하는 것을 알 수 있었다. 조성물이 12.5㎍/㎖ 이상에서부터 TNF-α의 생성 억제 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

<3. 프로스타글란딘( PGE ₂ )의 생성 측정>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여, 활성화를 유도한 다음, 조성물의 양(0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100㎍/㎖)을 각각 다르게 처리하여 12시간 동안 배양하여, 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성 억제 효과에 대해 실험하였다.

그 결과, 도3에 도시된 바와 같이, 조성물의 양에 따라 산화질소의 생성되는 정도가 줄어드는 것을 알 수 있었다.

도3의 (a)에서는 조성물의 양이 12.5㎍/㎖인 구간부터 산화질소의 생성이 현저히 감소하는 것을 알 수 있으며, 100㎍/㎖에서는 산화질소 생성이 20%~30% 이하인 것을 알 수 있다.

<4. Luciferase assay를 이용한 NF-κB의 전사 활성 평가>

HEK293 세포(1×10⁶cells/ml)는 제조방법에 따라 12well plate에 calcium phosphate방법을 사용하여 NF-κB-Luc, CERB-luc, AP-1-Lcu 뿐만 아니라 β-galactosidase를 포함하는 plasmid 1㎍을 트랜스펙션(transfection)하였다. 이 세포는 트랜스펙션 이후 48시간 동안 실험이 진행되었다.

Luciferase 분석은 이전에 보고된 바와 같이, Luciferase 분석실험체계(promega)를 사용하여 실행되었다.

그 결과 도4와 같은 결과를 얻을 수 있었으며, NF-κB-Luc을 1㎍ 및 PMA를 100nM 처리한 상태에서 조성물 100㎍/㎖를 처리한 경우에 NF-κB 매개성 luciferase 활성이 저하된 것을 볼 수 있다. 조성물 100㎍/㎖과의 대조군으로 BAY11-7082를 20um 처리한 결과와 비교했을 때 NF-κB 매개성 luciferase 활성이 저하된 정도가 유사함을 보였다.

여기서, NF-κB는 면역기능, 염증반응, 혈관 내피세포의 활성화, 세포성장 등에 관여하는 전사인자로서 거의 모든 세포에 존재한다.

또한, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)는 인체정상세포와 암세포에서 염증매개물질인 COX-2, iNOS와 PGE2의 발현에 관여한다는 연구결과가 밝혀지고 있다.

한편, BAY11-7082는 NF-κB 억제제로 알려져 있는 합성 화합물로, LPS 혹은 사이토카인 등과 같은 자극원에 의해 생성된 여러 가지 염증 유발 물질(nitric oxide, reactive oxygen species 및 프로스타글란딘 등) 및 adhesion molecule 등의 in vitro 생성 및 신합성을 억제하고 in vivo 항관절염 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.

<5. β-actin, p-lκBα의 단백질 발현 정도 측정>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 것과, 조성물 100㎍/㎖를 무처리하거나 처리한 것으로, β-actin, p-lκBα의 단백질 발현 변화를 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다.

그 결과, β-actin, p-lκBα 각각의 시간에 따른 단백질 발현 변화를 도5에 도시된 바와 같이 확인할 수 있었다.

<6. 쥐 귀 부종실험>

ICRmice(n=7)을 구강으로 조성물(100㎍/㎖)과 인도메타신(indomethacin) 1㎍/㎖ 또는 덱사메사손(dexamethasone) 1㎍/㎖을 7일 동안 약물처리를 한다. 마지막 약물처리 후 아라키돈산(arachidonic acid)[2%(w/v)]를 쥐의 귀에 적용시킨다.(25㎕/ear), 부종의 두께는 아라키돈산을 1시간 처리한 constant-pressure 두께치수를 측정한다. 치유효능을 평가하기 위해서 약물에 의한 귀부종의 저해 효과는 다음과 같이 계산될 수 있다.

% of control(oedema inducer alone)=

×100

여기서,

는 약물군 그룹에 대한 귀의 두께이고,

는 약물처리되지 않은 그룹에 대한 귀의 두께,

는 대조군그룹이다.

한편, 인도메타신은 비스테로이드성 항염증약으로서 진통 해열 항염증작용을 가지며 동종의 약제로서 아스피린(Aspirin) 등이 있다.

그 결과, 도6에 도시된 바와 같이, 귀 부종에 대하여 측정한 결과 조성물을 100㎍/㎖을 처리한 군과 인도메타신 1㎍/㎖을 처리한 군이 유사한 결과를 보이는 것을 확인할 수 있다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이기 때문에, 본 발명이 상기의 실시예에만 국한되는 것으로 이해되어져서는 아니 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어져야 할 것이다.

Claims

트리스노르호파논(Trisnorhopanone), 캄페스테롤(campesterol) 및 디플로프테롤(Diplopterol)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는
항염증 및 면역증강을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 산화질소(NO)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는
항염증 및 면역증강을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 종양괴사인자인 TNF-α의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는
항염증 및 면역증강을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는
항염증 및 면역증강을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 트리스노르호파논, 캄페스테롤 및 디플로프테롤을 함유하는 유효성분은,
드라이오크라신(Dryocrassin), 드라이오크라솔(Dryocrassol), 드라이오크라실 아세테이트(Dryocrassyl acetate), 페르닌(Fernene) 및 플라바스피딕 에이시드(Flavaspidic acid) 중 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
항염증 및 면역증강을 위한 조성물.