KR101049041B1

KR101049041B1 - 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물

Info

Publication number: KR101049041B1
Application number: KR1020110032470A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 강은진; 김혜진; 이현선
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2011-07-13

Abstract

본 발명은 NO의 생성을 억제하고, PGE₂, AP-1 및 TNF-α의 발현 및 생성을 억제하도록 하여 항염증 및 면역억제에 효과가 있으며, 염증질환 및 염증반응과 관련된 질환에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다. 이를 위해, 특히 메탄올을 추출용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물이 개시된다.

Description

항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물{Methanol extract of Polygonum hydropiper having anti-inflammatory and immuno-suppresive effects}

본 발명은 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 대식세포에서 면역반응을 조절하며 염증반응과 관련된 NO 생성 및 PGE₂, AP-1, TNF-α 등의 활성을 억제하여 염증 질환을 치료하는데 효과적인 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물에 관한 것이다.

염증(炎蒸, inflammation)이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(渗出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다.

또한, 여러 가지 형태의 감염(infection)이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 대한 생체 내 방어기전의 발현이라 할 수 있고, 다양한 화학적 매개체가 염증의 발현 기전에 관여하고 있으며, 그 병인도 매우 복잡하다.

이는 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴, 약화시키거나 차폐하는 작용을 한다. 이러한 염증의 특징은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되며, 백혈구가 염증 조직으로 이동한다는 것으로, 통상적으로 홍반, 부종, 통각과민 및 통증 등의 임상적 증상들을 동반한다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide : NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase : NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려진 바 있다.

이에 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 작용을 하고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등이 있으며, 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있고, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 향상성 유지에 중요한 역할을 한다.

이에 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다.

TNF-α와 같은 다기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부 질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다.

또한, 여러 염증질환과 알러지(allergy) 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다.

따라서, 발암촉진단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE₂의 생성 억제를 통해 초기 염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.

즉, 세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)를 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우에 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨-1, 인터류킨-2), 세포 사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인(chemokines), 염증성 분자(산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE₂)를 방출하고, 또한 당단백질(공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절한다.

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 셉틱 쇼크나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병과 같은 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

한편, 현재까지의 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflannatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다.

즉, 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하여 치료하고 있으나 일반적인 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 이용되기 때문에 치료 작용 및 부작용을 공유하게 된다. 이 중 부작용에는 호흡촉진현상, 순환계 붕괴, 상복부 통증, 구토, 위장출혈, 간 손상 및 혈소판 저해 등의 증상이 알려진 바 있다.

이러한 부작용 때문에 기존의 항염증성 약제는 장기적으로 사용하기가 곤란하고, 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이며, 부작용에 대한 우려가 없는 인체에 안전한 항염제의 필요성이 대두되고 있다.

아울러, 면역조절에 관여하는 대식세포에서 산화질소의 생성을 억제하고, 염증반응을 억제하는 천연 추출물을 이용하여 관련 염증 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품을 제공할 필요성이 대두된다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 면역 관련 염증 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품에 사용할 수 있도록 면역조절에 관여하는 대식세포에서 NO의 생성을 억제하여 염증반응을 억제하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 메탄올을 추출용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

또한, 메탄올은 99.9%인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 여뀌 메탄올 추출물은 퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-L-람노사이드(rhamnoside), 캠퍼롤(kaempferol)-3-글루코시드(glucoside), 6-하이드록시아피게닌(hydroxyapigenin), 갈로일 캠퍼롤(galloyl kaempferol) 3-글루코시드(glucoside), 스쿠텔라레인(scutellarein), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin)-7-Ο-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), 퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-D-글루쿠로니드(glucuronide), 갈로일(galloyl) 퀘르세틴(quercetin) 및 퀘르세틴(quercetin)의 플라보노이드를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

그리고, 여뀌 메탄올 추출물은 대식세포에서 면역반응을 조절하며, 염증반응과 관련하여 NO 생성, PGE₂, AP-1 및 TNF-α의 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물은 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 프로스타글란딘(PGE₂), 액티베이터 단백질(AP-1) 및 TNF-α(cyclic AMP response element binding) 단백질의 발현 및 생성을 억제하도록 하여 항염증 및 면역조절 활성에 효과가 있으며, 염증질환 및 염증반응과 관련된 질환에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 RAW264.7 세포에서 여뀌 메탄올 추출물의 산화질소 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 2는 RAW264.7 세포에서 여뀌 메탄올 추출물의 PGE₂ 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 3은 RAW264.7 세포에서 여뀌 메탄올 추출물의 TNF-α 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 4는 Peritoneal macrophages에서 여뀌 메탄올 추출물의 산화질소 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 5는 Peritoneal macrophages에서 여뀌 메탄올 추출물의 PGE₂ 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 6은 여뀌 메탄올 추출물의 농도에 따른 각 세포의 활성을 나타낸 그래프,
도 7은 여뀌 메탄올 추출물의 농도에 따른 iNOS, TNF-α 및 COX₂의 생성 억제 효과를 나타낸 그래프,
도 8a는 여뀌 메탄올 추출물의 농도에 따른 NF-κB의 활성 억제 기전을 살펴보기 위해 Luciferase assay를 이용한 NF-κB의 전사 활성 평가에 대한 그래프,
도 8b는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 p65 및 p50의 발현 변화에 대한 것을 도시한 그래프,
도 9a는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 AP-1의 매개성 luciferase 활성 억제 기전을 살펴보기 위해 Luciferase assay를 이용한 AP-1의 매개성 luciferase 활성에 대하여 도시한 그래프,
도 9b는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 c-June, p-c-Jun, c-fos, Histone3, p-ATF2 및 ATF2 단백질의 발현 변화에 대한 것을 도시한 그래프,
도 10a는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 p-Src, Src, p-Syk, Syk, p-p85, p85 및 β-actin 단백질의 발현 변화에 대한 것을 도시한 그래프,
도 10b는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 Kinase activity을 나타낸 그래프,
도 11a 및 도 11b는 DSS 유발 대장염 실험 동물 모델에서 여뀌 메탄올 추출물에 대한 length of colon를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지되어진 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

여뀌는 갈매나무과(Rhamnaceae)에 속하는 식물이며, 학명이 Polygonum hydropiper이다. 여뀌는 수료, 택료, 천료라고도 하며, 주요 산지는 베트남이다. 여뀌는 습지 또는 냇가에서 자라고 높이 40∼80cm, 털이 없으며, 가지가 많이 갈라진다. 여뀌의 잎은 매운맛이 있으며, 일본에서는 싹이 튼 여뀌를 생선요리에 쓴다. 여뀌는 지혈작용이 있어서 자궁출혈, 치질출혈 및 그 밖의 내출혈에 사용된다. 잎과 줄기는 항균작용이 뛰어나며, 혈압을 내려주고 소장과 자궁의 긴장도를 강화시킨다. 민간에서는 이것을 짓찧어 물고기를 잡을 때에 이용하기도 한다. 본 발명에 의한 조성물에 있어서 여뀌 추출물은 건초를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 여뀌 추출물에 대해서는 항산화, 항균, 진통 및 미백 효과에 대한 논문이 보고되어 있으며, 국내에는 여뀌의 피부 미백에 관한 특허가 출원된 바 있다. 그러나, 현재 여뀌 추출물의 항염증 및 면역억제 효과에 대한 논문 및 특허에 대해서는 전무한 상태이다.

본 발명에 있어서, 추출물이란 원료 식물에 대하여 추출 용매를 사용하여 추출 조작을 행하는 공정을 거쳐 얻어지는 물질 그 자체의 것을 말한다. 여뀌 메탄올 추출물의 추출은 이하와 같이 행할 수 있다.

예를 들어 여뀌를 분쇄 또는 미세 절단 후, 용매를 사용하여 뱃치식 또는 연속식으로 행할 수 있다. 여뀌 추출물을 얻을 때의 추출 용매로서는 특별히 한정되지 않고, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알코올 등의 알코올류를 사용할 수 있으나, 본 발명에서의 여뀌 추출물은 메탄올을 용매로 하여 추출하는 것이 바람직하며, 특히 99.9% 메탄올을 용매로 사용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 이는 99.9% 메탄올을 추출용매로 하여 추출함으로써 여뀌 추출물의 수율을 극대화할 수 있기 때문이다.

추출 용매의 양은 적절히 결정하면 되지만, 통상, 원료 식물에 대하여, 사용시의 원료 식물의 형태 그대로 (예를 들어 원료 식물이 생식물이면 생식물)의 중량의, 바람직하게는 0.1∼100배량의 추출 용매를 사용할 수 있다. 또한, 여뀌 메탄올추출물을 추출할 때의 온도는 4∼60℃ 의 범위가 바람직하다. 추출 시간이나, 추출 효율을 고려하여 결정하면 되지만, 통상, 바람직하게는 수초∼수일간, 보다 바람직하게는 5분∼24시간의 범위가 되도록, 원료, 추출 용매, 추출 온도를 설정할 수 있다. 추출 조작은 예를 들어, 교반하면서 또는 정치하여 행하면 되고, 또한 필요에 따라 수회 반복해도 된다. 추출물은 필요에 따라, 여과, 원심 분리, 농축, 한외 여과, 분자 체 등의 처리를 행하여 원하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물을 조제할 수도 있다.

한편, 상기 방법에 의해 추출된 여뀌 메탄올 추출물은 퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-L-람노사이드(rhamnoside), 캠퍼롤(kaempferol)-3-글루코시드(glucoside), 6-하이드록시아피게닌(hydroxyapigenin), 갈로일 캠퍼롤(galloyl kaempferol) 3-글루코시드(glucoside), 스쿠텔라레인(scutellarein), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin)-7-Ο-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), 퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-D-글루쿠로니드(glucuronide), 갈로일(galloyl) 퀘르세틴(quercetin) 및 퀘르세틴(quercetin)의 플라보노이드 성분을 함유하고 있다.

이러한, 여뀌 메탄올 추출물의 성분들은 대식세포에서 면역반응을 조절하며, 염증반응과 관련하여 NO 생성, PGE₂, AP-1, TNF-α 및 NF-κB의 활성을 억제하여 항염증 및 면역억제 효과에 탁월한 효능이 있는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물에 대한 항염증의 효능을 알아보기 위해 RAW 264.7 대식 세포주 및 페리터니얼 매크로파지(Peritoneal macrophages)를 선택하여 산화적 스트레스를 유발시키고, 여뀌 메탄올 추출물을 처리하여 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘(PGE₂), 활성 단백질(AP-1), TNF-α 및 NF-κB 등의 활성을 억제하는 반응에 대한 실험을 하였다.

<1. 여뀌 메탄올 추출물의 준비>

추출용매로는 메탄올(99.9%)을 사용하였으며, 추출물 시료는 감압하에서 건조된 상태로 50℃에서 추출하였으며, 이때 추출된 시료의 중량은 튜브(tube)당 20.59±0.12mg이었다. 이 시료를 DMSO로 스톡(stock)시켜 사용하였다. 본 발명에서는 준비된 여뀌 메탄올 추출물을 Ph-ME로 표기하였다.

<2. NO 의 생성 측정(1)>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여, 활성화를 유도한 다음, Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, 산화질소의 생성을 측정하였다.

산화질소는 정상적인 방어 작용뿐만 아니라 만성 및 악성염증질환에서 독성을 가지며 전염증성 매개자로서 잘 알려져 있다. 본 실험에서는 Ph-ME에 의해 LPS로 활성화된 대식세포로부터 산화질소의 생성이 억제됨을 관찰하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, Ph-ME의 양에 따라 산화질소의 생성되는 정도가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 즉, Ph-ME의 양이 25㎍/㎖에서 200㎍/㎖로 증가함에 따라 산화질소의 생성이 점점 감소하는 것을 알 수 있었으며, Ph-ME의 양이 200㎍/㎖인 구간에서는 산화질소 생성이 20% 이하로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

<3. PGE ₂ 의 생성 측정(1)>

대식세포 RAW264.7에 Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성을 측정하였다.

프로스타글란딘은 많은 다른 악성 및 만성 염증 질병에서 잘 알려진 전염증성 중재자로, 그 생성에 있어 Ph-ME의 저해 효과에 대하여 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Ph-ME의 양이 증가할수록 PGE₂의 생성이 점점 감소하는 것을 알 수 있었다.

<4. 종양괴사인자( TNF -α)의 생성 또는 발현 측정>

RAW264.7 세포에서 TNF-α의 생성 또는 발현에 있어 Ph-ME의 억제효과를 알아보기 위하여 ELISA 방법으로 분석하였다.

사이토카인 및 케모카인(TNF-α, IL-6, 1L-1β, MCP-1)은 정상적인 방어응답과 셉틱 쇼크, 류머티즘성 관절염, 자동면역질병과 같은 악성 염증성 질환의 면역질환과 연결된 다양한 생물학적 활성을 가지는 전염증성 사이토카인으로 알려져 있다.

실험에 따른 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, Ph-ME의 양이 증가할수록 TNF-α의 생성 또는 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다.

<5. NO 의 생성 측정(2)>

Peritoneal macrophages에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여, 활성화를 유도한 다음, Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, 산화질소의 생성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, Ph-ME의 양이 증가함에 따라 산화질소의 생성되는 정도가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 즉, Ph-ME의 양이 25㎍/㎖에서 200㎍/㎖로 증가함에 따라 산화질소의 생성이 점점 감소하는 것을 알 수 있었으며, Ph-ME의 양이 200㎍/㎖인 구간에서는 산화질소 생성이 10% 이하로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

<6. PGE ₂ 의 생성 측정(2)>

Peritoneal macrophages에 Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, 프로스타글란딘(PGE₂)의 생성을 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Ph-ME의 양이 증가할수록 PGE₂의 생성이 점점 감소하는 것을 알 수 있었다. 즉, Ph-ME의 양이 25㎍/㎖에서 200㎍/㎖로 증가함에 따라 PGE₂의 생성이 점점 감소하는 것을 알 수 있었으며, Ph-ME의 양이 200㎍/㎖인 구간에서는 산화질소 생성이 0%로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

<7. 세포의 활성 측정>

RAW264.7, Peritoneal macrophages 및 HEK293에 Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, 각 세포의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, Ph-ME의 양이 0㎍/㎖인 경우에는 각 세포의 활성율이 100%로 동일하였지만, Ph-ME의 양이 50㎍/㎖인 경우에는 Peritoneal macrophages의 활성이 120% 이상으로 증가하는 반면, RAW264.7 및 HEK293의 활성은 각각 100% 미만으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 그래프 상에서는 Peritoneal macrophages의 활성이 Ph-ME의 양이 50㎍/㎖에서 200㎍/㎖로 점점 증가함에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<8. iNOS , TNF -α 및 COX ₂ 의 억제 측정>

대식세포 RAW264.7에 Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 50, 100, 200㎍/㎖)하여 24시간 동안 배양 후, RT(Real-Time)-PCR에 의한 mRNA levels을 측정하여, iNOS, TNF-α 및 COX₂의 억제 효과를 측정하였다. iNOS(inducible NOS)는 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되고, 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 산화질소를 급격히 과량으로 발생시키는 것으로 알려져 있다. 아울러, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다. COX₂는 프로스타글란딘과 밀접한 관계가 있으며, COX₂ 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE₂의 생성 억제를 통해 초기 염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.

측정 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, Ph-ME의 농도가 증가함에 따라 iNOS, TNF-α 및 COX₂의 억제율이 감소함을 나타내고 있다.

<9. Luciferase assay 를 이용한 NF -κB의 전사 활성 평가>

HEK293 세포(1×10⁶cells/ml)는 제조방법에 따라 12well plate에 calcium phosphate방법을 사용하여 NF-κB-Luc, CERB-luc, AP-1-Lcu 뿐만 아니라 β-galactosidase를 포함하는 plasmid 1㎍을 트랜스펙션(transfection)하였다. 이 세포는 트랜스펙션 이후 48시간 동안 실험이 진행되었다.

Luciferase 분석은 이전에 보고된 바와 같이, Luciferase 분석실험체계(promega)를 사용하여 실행되었다.

그 결과 도 8a와 같은 결과를 얻을 수 있었으며, NF-κB-Luc 1㎍ 및 PMA 100nM 처리한 상태에서, Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 50, 100, 200㎍/㎖)한 경우에 NF-κB 매개성 luciferase 활성이 저하된 것을 볼 수 있다. Ph-ME 100㎍/㎖과의 대조군으로 BAY11-7082를 20um 처리한 결과와 비교했을 때 NF-κB 매개성 luciferase 활성이 저하된 정도가 유사함을 보였다.

여기서, NF-κB는 면역기능, 염증반응, 혈관 내피세포의 활성화, 세포성장 등에 관여하는 전사인자로서 거의 모든 세포에 존재한다.

또한, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)는 인체 정상세포와 암세포에서 염증 매개물질인 COX₂, iNOS 및 PGE₂의 발현에 관여한다는 연구결과가 밝혀지고 있다.

한편, BAY11-7082는 NF-κB 억제제로 알려져 있는 합성 화합물로, LPS 혹은 사이토카인 등과 같은 자극원에 의해 생성된 여러 가지 염증 유발 물질(nitric oxide, reactive oxygen species 및 프로스타글란딘 등) 및 adhesion molecule 등의 in vitro 생성 및 신합성을 억제하고 in vivo 항관절염 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.

<10. p65 및 p50 의 발현 변화 관찰>

NF-kB는 p50 (NF-B1), p52 (NF-B2), p65 (Rel-A), c-Rel 등이 결합한 형태로 존재하는데, 주로 p65-p50 이중결합의 NF-kB가 관찰된다.

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 것과, Ph-ME(200㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 후, 시간에 따른 p65 및 p50의 발현 변화를 도 8b와 같이 확인할 수 있었다.

<11. Luciferase assay 를 이용한 AP -1 매개성 luciferase 활성 평가>

HEK293 세포(1×10⁶cells/ml)는 제조방법에 따라 12well plate에 calcium phosphate방법을 사용하여 NF-κB-Luc, CERB-luc, AP-1-Luc 뿐만 아니라 β-galactosidase를 포함하는 plasmid 1㎍을 트랜스펙션(transfection)하였다. 이 세포는 트랜스펙션 이후 48시간 동안 실험이 진행되었다.

그 결과 도 9a와 같은 결과를 얻을 수 있었으며, AP-1-Luc을 1㎍ 및 PMA를 100nM 처리한 상태에서 Ph-ME의 양을 각각 다르게 처리(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)한 경우에, AP-1 매개성 luciferase 활성이 저하된 것을 볼 수 있다. Ph-ME 100㎍/㎖과의 대조군으로 U1026을 20um 처리한 결과와 비교했을 때 AP-1 매개성 luciferase 활성이 저하된 정도가 유사함을 보였다.

<12. 유전자 전사 조절 인자들 c- June , p-c- Jun , c- fos , Histone3 , p-ATF2 및 ATF2 의 발현 변화 관찰>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 것과, Ph-ME(200㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 후, 시간에 따른 c-June, p-c-Jun, c-fos, Histone3, p-ATF2 및 ATF2의 발현 변화를 도 9b와 같이 확인할 수 있었다.

<13. 항체 p- Src , Src , p- Syk , Syk , p- p85 , p85 및 β- actin 의 발현 변화 관찰>

대식세포 RAW264.7에 LPS(1㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 것과, Ph-ME(200㎍/㎖)를 무처리하거나 처리한 후, 시간에 따른 p-Src, Src, p-Syk, Syk, p-p85, p85 및 β-actin의 발현 변화를 도 10a와 같이 확인할 수 있었다.

<14. 효소 활성 평가>

대식세포 RAW264.7에 Ph-ME 200㎍/㎖를 처리한 후, 효소활성 효과를 측정하였다. 도 10b에 도시된 바와 같이, Src에서는 효소 활성에 대한 증가율이 0인 반면, Syk에서는 2%로 활성도가 현저히 감소하는 것을 보여주고 있다.

<15. DSS 유발 대장염 실험 동물 모델에서 colon 의 길이 측정>

실험동물은 (주)중앙실험동물에서 ICR mouse 4주령의 수컷 쥐를 사용하였다. 3일간 순화시킨 후 2주간 Ph-ME를 각 실험동물에 마우스 무게(kg)당 0.5g/kg을 경구투여 하였으며, 경구투여 시작 후 7일째부터 DSS(MP Bio)를 5%로 물에 현탁하여 실험동물에게 물 대신 공급하였다. DSS(dextran sulphate sodium)를 투여한 후 7일째 되는 날 해부를 시행하였다. 실험동물을 에테르 마취하여 맹장 아래 1cm되는 지점부터 대장 끝까지를 적출하고 길이를 측정하였다. 그리고 적출한 대장 조직의 염증 발생 정도를 병리조직학적 방법으로 분석하였다. 일정한 세척 및 통상적인 방법에 따라 알코올 탈수과정을 거쳐 파라핀으로 포매하고 포매된 콜론(colon) 조직은 박절편기를 이용하여 5㎛ 두께의 연속절편을 작성하여 hematoxylin-eosin(HE) 염색을 시행한 다음 permount로 봉입하여 영구표본을 작성한 후 병리조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다.

도 11a의 가로축 및 도 11b에는 DSS를 처리 하지 않은 실험 동물군을 'Normal', DSS만 처리된 실험 동물군을 'DSS', DSS가 처리된 실험동물에게 Ph-ME (100 mg/kg)를 투여한 실험 동물군은 'Ph-ME'로 표시하였다. 도 11a 및 도 11b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 'Normal'한 실험 동물군에 비해 콜론의 길이가 약간 축소되었으나, 'DSS'만 처리한 실험 동물군에 비해서는 콜론의 길이가 훨씬 증가하는 상태를 보이고 있다. 따라서, 'DSS'에 의해 유발된 대장염이 Ph-ㅡME의 투여로 현저하게 회복될 수 있음을 확인할 수 있었다..

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이기 때문에, 본 발명이 상기의 실시예에만 국한되는 것으로 이해되어져서는 아니 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어져야 할 것이다.

Claims

메탄올을 추출용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물.
제1항에 있어서,
상기 메탄올은 99.9%인 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 여뀌 메탄올 추출물은,
퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-L-람노사이드(rhamnoside), 캠퍼롤(kaempferol)-3-글루코시드(glucoside), 6-하이드록시아피게닌(hydroxyapigenin), 갈로일 캠퍼롤(galloyl kaempferol) 3-글루코시드(glucoside), 스쿠텔라레인(scutellarein), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin), 6-하이드록시루테올린(hydroxyluteolin)-7-Ο-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside), 퀘르세틴(quercetin) 3-Ο-β-D-글루쿠로니드(glucuronide), 갈로일(galloyl) 퀘르세틴(quercetin) 및 퀘르세틴(quercetin)의 플라보노이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물.
제1항에 있어서,
상기 여뀌 메탄올 추출물은,
대식세포에서 면역반응을 조절하며,
염증반응과 관련하여 NO 생성, PGE₂, AP-1 및 TNF-α의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증 및 면역억제 효과를 갖는 여뀌 메탄올 추출물.