KR101450726B1

KR101450726B1 - 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소(ｉＮＯＳ) 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법

Info

Publication number: KR101450726B1
Application number: KR1020110131526A
Authority: KR
Inventors: 이종수; 류재하
Original assignee: 이종수
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2014-10-16
Also published as: KR20130064908A

Abstract

본 발명은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화질소 생성효소(iNOS, inducible Nitric oxide synthase) 단백질의 발현 저해 효과가 우수한 황칠나무 잎의 추출물 또는 황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어진 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소(ｉＮＯＳ) 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법{EXPRESSION INHIBITORS OF iNOS PROTEIN USING Dendropanax morbifera Lev. LEAF AND THE EXTRACTING METHOD THEREOF}

본 발명은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염증질환 유발인자인 산화질소 생성효소 단백질의 발현 저해 효과가 우수한 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법에 관한 것이다.

본 발명은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염증질환 유발인자인 산화질소 생성효소 단백질의 발현 저해 효과가 우수한 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적증상이 나타난다. 정상인경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

실제로 생체내에 존재하는 염증반응인자에 대하여는 산화질소(Nitric oxide, NO)를 포함하여 종양괴사인자 (TNF)-α 생성 억제, 인터류킨(IL)-3 및 인터류킨-12의 mRNA 발현 억제, 프로스타글란딘 (PGE2), 활성산소종 (ROS)의 생성을 억제함으로써 면역조절에 관여하는 대식세포(Macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있으며, 면역반응에 의한 질환의 예방 및 치료에 유용한 천연물 생약추출물은 지속적으로 주목되어 오고 있다.

상기에 언급한 염증반응인자 가운데 산화질소(Nitric Oxide, NO)는 무기질 저분자라디칼로서 산화질소 생성효소(Nitric oxide synthase, NOS)에 의해 생성된다 (Feldman P. L. and Griffith O. W.; Chem. Eng. News ., 12 , pp26-38, 1993). 이 효소는 신경전달기능, 혈액응고 및 혈압조절기능 등의 정상적인 생리기능을 위한 산화질소를 생성을 담당하는 일반형 산화질소 생성효소(constitutive NOS, cNOS)와 특별한 상황에서 유도되는 유도형 산화질소 생성효소로 구분된다. 일반형 산화질소 생성효소(cNOS)는 다시 신경적 산화질소 생성효소(neuronal NOS, nNOS)와 내막 산화질소 생성효소(endothelial NOS, eNOS) 로 구분된다. 이들은 칼슘(Ca2+)과 칼모듈린(Calmodulin, CaM)에 의존적이고, 자극에 의해 단시간동안 소량의 산화질소를 생성하는 반면에, 유도형 산화질소 생성효소(iNOS)는 칼슘에 비의존적이며 평소에는 활성화되지 않으나 지질다당체(Liposaccharide, LPS), 인터페론-γ (Interferon-γ, INF-γ), 암세포사멸인자-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α) 등의 자극에 의해 그 발현이 유도되면, 장시간 동안 다량의 산화질소를 생성한다(Mayer B. and John M.; FEBS Lett , 288 , pp187-191, 1991).

산화질소 생성효소(iNOS)에 의해 생성된 과도한 산화질소는 패혈증 환자에게 혈관확장으로 인한 과도한 혈압강하, COX-2의 활성화를 통한 프로스타글란딘 (Prostaglandins)과 같은 염증매개체의 생합성 촉진으로 인해 염증의 심화 및 신경세포사멸로 인한 뇌질환의 발생 및 심화 등에 관여하게 된다. 즉, 산화질소 생성효소 (Nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(Prostaglandins, PGs)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있으며, 이와같은 이유에서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다. 요약하면, 염증 발병의 원인으로서 NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(Sclerosis), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 결장암(Colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

또한, 최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(Cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 산화질소 생성효소에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성염증은 산화질소 생성효소 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35 , pp27-28, 1996).

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용(Kinne et al., 2000)을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF)-α, 인터루킨-1, -2), 세포사이의 신호전달을 담당하는 케모카인(Chemokines), 염증성 분자(산화질소 (NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE2)를 방출하고, 또한 당단백질 (공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절한다 (Bresnihan, 1999; Burmester et al., 1997; Gracie et al., 1999).

그런데, 이러한 대식세포들의 특성들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 셉틱 쇽이나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병(Gracie etal., 1999; Michaelsson et al., 1995; Stuhlmuller et al., 2000)과 관련된 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

아울러 산화질소(NO)와 같은 염증 생성 인자를 유발하는 외부물질 관점에서 볼 때, 세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇽(Endotoxin shock)을 일으키며, 이 과정에서 심하게 파괴될 경우에는 과도하게 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다 (Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am.,74, 1994 : Giroir, B. P., Crit. Care Med.,21, 1993 : Yamaguchi, Y. et al., J. Reticuloendothel. Soc.,409 , 1982). 그러므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 항염증 효과를 볼 수 있게 되는데, 이는 결과적으로 LPS로 인하여 생성되는 산화질소(NO) 생성 저해 작용으로 나타나게 된다.

현재까지의 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflammatory drug, NSAID)은 염증 질환에 있어서 가장 널리 사용되어 왔고, 약물 자체의 효과면에서도 커다란 공헌을 해온 약제임은 부인할 수 없을 것이다. 또 , 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다는 것을 부인할 수 없다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

따라서, 염증을 심화시키고 뇌질환까지도 유발하는 iNOS의 발현을 효과적으로 억제하고 부작용없이 안전한 염증질환 치료제의 개발이 요구되고 있으며, 실제로 광범위하게 염증 치료 및 예방, 나아가서 전반적인 면역활성 강화 관련 의약품의 필요성이 대두되고 있는 실정으로 천연물 생약 유래의 물질은 그와 같은 요구를 충족시켜줄 수 있는 중요한 소재가 될 수 있을 것이다..

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과에 속하는 우리나라의 전라남도 서남부 해안 지역과 제주도에서만 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다.

황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며, 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있고, 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다.

그러나, 황칠나무 진액 뿐 아니라 황칠나무는 번열 제거, 술 해독, 안질 및 황달치료, 화상치료, 나병에 효과가 있으며 인체에 무해하다는 기록도 전해지고 있는 한편(이시진, 본초강목, 중국문광도서, 1590), 진정작용과 강장작용을 나타낸다고 알려져 왔다(고유농수산품목 세계화 대상품목의 연구조사(황칠편), 전라남도, 1996). 또한 잎 추출물 분획에서 항암작용과 α-토코페롤보다 다소 약한 항산화작용이 있음이 밝혀져 있다고 알려져 있으나(특허 공개 제 2000-0004499호, 박호근 등, 1998), 수천년 전부터 사용되어 왔다는 고문헌 기록 등 황칠나무에 대한 가치를 고려한다면 약리활성 결과는 매우 부족한 상태이다.

본 발명의 목적은 염증질환 유발인자인 산화질소 생성효소 단백질의 발현 저해 효과가 우수한 황칠나무 잎 추출물 또는 황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어진 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 황칠나무 잎 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 제공함에 의해 달성된다.

또한, 본 발명의 목적은 황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제에는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체가 더 포함되는 것으로 한다.

본 발명의 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 불활성 담체는 락토스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.

본 발명의 더욱 바람직한 특징에 따르면, 상기 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 질소산화물 생성효소 단백질 발현 저해제에는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 및 붕해제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제가 더 포함되는 것으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 정제를 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 캡슐제를 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 시럽제를 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 황칠나무 잎을 함수알코올로 추출하여 농축액을 제조하는 농축단계 및 상기 농축단계에서 얻어진 농축액을 비극성 용매로 분획하는 분획물 제조단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 산화질소생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법을 제공함에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 농축단계는 황칠나무 잎을 함수알코올에 투입하고 40 내지 100℃의 온도에서 5 내지 24시간 동안 온탕 또는 환류추출하여 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 추출물을 10 내지 40℃로 냉각한 후에 여과하여 얻어진 여과액의 상층액을 분리한 후에, 분리된 상층액을 증발농축시켜 이루어지는 것으로 한다.

본 발명의 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 농축단계는 황칠나무 잎을 추출용매에 넣고, 4 내지 20℃의 온도에서 5 내지 7일 동안 냉침시켜 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 잎 추출물을 여과한 후에, 여과된 여과액을 증발농축시켜 이루어지는 것으로 한다.

본 발명의 더욱 바람직한 특징에 따르면, 상기 비극성 용매는 탄소수가 4 내지 10인 알칸류 비극성 용매인 것으로 한다.

본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 비극성 용매는 노르말 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.

본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 및 그 추출방법은 염증질환 유발인자인 산화질소 생성효소 단백질의 발현 저해 효과가 우수한 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 제공하는 탁월한 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 산화질소 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.

이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.

본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제는 황칠나무 잎 추출물로 이루어지거나, 황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어진다.

또한, 상기 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제에는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체가 더 포함될 수도 있다.

상기 불활성 담체는 상기 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 경구투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시키는 역할을 하며, 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체는 고체나 액체일 수 있으며, 락토스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 황칠나무 잎을 이용한 산화질소생성효소 단백질 발현 저해제에는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 및 붕해제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제가 더 포함될 수도 있다.

또한, 상기와 같이 황칠나무 잎 추출물 또는 황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어진 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제는 정제, 캡슐제 및 시럽제에 첨가되어 사용될 수 있다.

상기 정제는 상기의 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후에, 정제수를 첨가하여 분말로 과립화하고, 과립을 건조시킨 후에 스테아르산 마그네슘과 혼합하고 압착하여 제조되며, 이때, 정제의 바람직한 성분 및 함량은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 5.0㎎, 락토오스 BP 150.0㎎, 전분 BP 30.0 ㎎, 전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0㎎ 및 스테아르산 마그네슘 1.0㎎이다.

또한, 캡슐제는 상기의 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 체질한 다음 부형제와 혼합한 후에 젤라틴 캡슐에 충전하여 제조되는데, 이때, 캡슐제의 바람직한 성분 및 함량은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 5.0㎎, 전분(1500) 100.0㎎ 및 스테아르산마그네슘 BP 1.0㎎이다.

또한, 시럽제는 정제수 500㎖에 백당을 용해시키고, 별도의 용기에 카르복시메틸셀룰로오스나트륨을 정제수 400㎖에 용해시킨 후에, 상기 백당이 용해된 정제수와 메틸셀룰로오스나트륨이 용해된 정제수를 혼합하고, 메틸파라벤과 프로필파라벤을 첨가하여 용해시키고, 에탄올을 첨가한 후에 정제수를 전체 용액의 용량이 1000㎖가 되도록 첨가하고, 여기에 상기 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제를 현탁시켜 제조되는데, 이때, 상기 시럽제의 바람직한 성분 및 함량은 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제 5.0g, 백당 637.5g, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 2.0g, 메틸파라벤 0.28g, 프로필파라벤 0.12g, 에탄올 20㎖, 정제수 잔량이다.

또한, 본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법은 황칠나무 잎을 함수알코올로 추출하여 농축액을 제조하는 농축단계(S101) 및 상기 농축단계(S101)에서 얻어진 농축액을 비극성 용매로 분획하는 분획물제조단계(S103)로 이루어진다.

상기 농축단계(S101)는 상기 농축단계는 황칠나무 잎을 함수알코올에 투입하고 40 내지 100℃의 온도에서 5 내지 24시간 동안 온탕 또는 환류추출하여 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 추출물을 10 내지 40℃로 냉각한 후에 여과하여 얻어진 여과액의 상층액을 분리한 후에, 분리된 상층액을 증발농축시켜 이루어지거나, 황칠나무 잎을 추출용매에 넣고, 4 내지 20℃의 온도에서 5 내지 7일 동안 냉침시켜 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 잎 추출물을 여과한 후에, 여과된 여과액을 증발농축시켜 이루어지는데, 농축액에 함유된 유효성분의 수율을 높이기 위해서 상기의 농축단계(S101)를 3회 반복하여 각각의 농축단계에서 얻어진 상층액을 합하여 최종적인 농축액으로 모으는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 두 가지 농축단계(S101)에서는 추출용매로 함수알코올이 사용되는데, 상기 함수알코올 이외에도 물을 이용하여 추출할 수 있으며, 상기 함수알코올에 사용되는 알코올은 농도가 10 내지 100%인 메탄올 또는 에탄올이 사용될 수 있다.

상기 농축단계(S101)를 통해 얻어진 농축액은 유동성이 있는 액체 상태로 얻어질 수 있으나 동결건조법 등을 이용하여 -80℃에서 동결건조된 분말상태로 얻을 수 있다.

상기 분획물제조단계(S103)는 상기 농축단계(S101)에서 얻어진 농축액을 비극성 용매로 분획하는 단계로, 상기 농축단계(S101)에서 얻어진 농축액을 분액여두에 넣고 비극성 용매로 분획하여 이루어지는데, 분획물의 수율을 높이기 위해 상기 액상 또는 건조된 분말상태의 농축액을 비극성 용매로 추출 및 여과하는 조작을 3회 반복하여 실시하고, 3회 반복하여 각각의 추출 및 여과단계에서 얻어진 여과액을 합하여 최종적인 분획물로 모으는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 비극성 용매는 상기 농축단계(S101)에서 얻어진 농축액을 분획할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 탄소수가 4 내지 10인 알칸류 비극성 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 노르말 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 분획물제조단계(S103)에서 두 개 이상의 비극성 용매를 사용할 경우에는 노르말 헥산을 이용하여 분획을 진행하고 남은 여액에 상기 분획물제조단계(S103)와 동일한 분획과정을 적용하되 클로로포름을 적용하여 분획을 진행하고, 클로로포름을 이용하여 분획을 진행하고 남은 여액에 상기 분획물제조단계(S103)와 동일한 분획과정을 적용하되, 에틸아세테이트를 이용하여 분획을 진행하게 된다.

이하에서는, 본 발명에 따른 황칠나무 잎을 이용한 질소산화물 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법 및 추출된 추출물의 질소산화물 생성효소 단백질 발현 저해효과를 실시예를 들어 설명하기로 한다.

<실시예 1>

황칠나무 잎 100 g을 적당한 크기로 세절하여 농도가 70%인 메탄올수용액(메탄올:물=7:3) 500ml에 넣고 환류 냉각 장치가 구비된 수욕조에서 95 내지 100℃의 온도로 12시간 동안 온탕 또는 환류추출하고, 추출된 추출액을 30℃의 온도로 냉각시킨 후에 여과지로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3회 반복한 후에, 3회의 반복과정을 통해 각각 얻어진 상등액을 합하고, 합해진 상등액을 회전증발장치(rotary evaporator)로 감압하여 물과 메탄올을 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출액을 추출하였다.

<실시예 2>

황칠나무 잎 100 g을 적당한 크기로 세절하여 농도가 20%인 메탄올수용액 (메탄올:물=1:4) 500ml에 넣고 실온에서 3일간 냉침한 후에 여러 겹의 거즈로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3번 반복한 후에, 3번의 반복과정을 통해 각각 얻어진 상등액을 합하고, 합해진 상등액을 회전증발장치(rotary evaporator)로 감압하여 물과 메탄올을 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출물을 추출하고, 추출된 황칠나무 잎 추출물을 증류수에 용해하여 황칠나무 잎 추출물 수용액을 제조하였다.

<실시예 3>

상기 실시예 2에서 얻어진 황칠나무 잎 추출물 수용액을 분액여두에 넣고 헥산으로 실온에서 1일간 추출한 후 여러 겹의 여과지로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3번 반복한 후에, 3번의 반복과정을 통해 각각 얻어진 여과액을 합하고 회전증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 감압하에서 용매를 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출물을 분획하였다.

<실시예 4>

상기 실시예 3의 과정을 통해 분획과정이 완료되고 남은 여액을 분액여두에 넣고 클로로포름으로 실온에서 1일간 추출한 후 여러 겹의 여과지로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3번 반복한 후에, 3번의 반복과정을 통해 각각 얻어진 여과액을 합하고 회전증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 감압하에서 용매를 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출물을 분획하였다.

<실시예 5>

상기 실시예 4의 과정을 통해 분획과정이 완료되고 남은 여액을 분액여두에 넣고 에틸아세테이트로 실온에서 1일간 추출한 후 여러 겹의 여과지로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3번 반복한 후에, 3번의 반복과정을 통해 각각 얻어진 여과액을 합하고 회전증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 감압하에서 용매를 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출물을 분획하였다.

<비교예 1>

상기 실시예 5의 과정을 통해 분획과정이 완료되고 남은 여액을 분액여두에 넣고 부탄올을 사용하여 실온에서 1일간 추출한 후 여러 겹의 여과지로 여과하여 상등액을 취하는 과정을 3번 반복한 후에, 3번의 반복과정을 통해 각각 얻어진 여과액을 합하고 회전증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 감압하에서 용매를 완전히 증발시켜 황칠나무 잎 추출물을 분획하였다.

<비교예 2>

상기 비교예 6의 과정을 통해 분획과정이 완료되고 남은 여액(물층)을 농축하였다.

<실험예 1>

상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2를 통해 얻어진 황칠나무 잎 추출물, 황칠나무 잎 추출물의 분획물 및 여액의 산화질소 생성 저해 효과를 측정하여 아래 도 2에 나타내었다.

아래 도 2에서 veh는 vehicle (대조군)이며, LPS(Lipopolysaccharide)는 지질다당체이고, DPL 001(실시예 1), 002(실시예 2)은 황칠나무 잎의 함수에탄올 추출물이고, 상기 DPL_H는 실시예 3의 분획물, DPL_C는 실시예 4의 분획물, DPL_EA는 실시예 5의 분획물, DPL_Bu는 비교예 1의 분획물, DPL_H2O는 비교예 2의 여액이다.

상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2를 통해 제조된 시료의 생리활성은 리포폴리사카라이드(LPS)로 활성화된 대식세포에서 산화질소(NO, Nitric Oxide) 생성의 억제 효과로서 평가하였다.　쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 시료의 존재 하에서 1㎍/㎖의 LPS로 처리하여 20시간 동안 배양하였다.

배양계에 방출된 산화질소의 농도는 니트라이트(Nitrite)의 형태로 그리스(Griess)방법(1% 설파닐아미드 + 5% 인산에 녹인 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드) (Green, L. C.; Wagner, D. A.; Glogowski, J.; Skipper, P. L.; Wishnok, J. S.; Tannenbaum, S. R. Anal. Biochem. 1982, 126, 131-138)으로 분석하였다. 배양액 100uL와 Griess시약 100uL를 섞고 10분 동안 상온에서 방치한 후에 540nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 표준검량선은 sodium nitrite를 이용하여 작성하였다.

아래 표 2에 나타낸 것처럼 본 발명에 의해 추출된 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제는 산화질소 생성 저해 효과에 대한 우수한 물성을 나타내며, 특히 상기 실시예 4를 통해 분획된 분획물의 산화질소 생성 저해 효과가 가장 우수한 것을 알 수 있다.

S101 : 농축단계
S103 : 분획물제조단계

Claims

황칠나무 잎 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제.
황칠나무 잎 추출물의 분획물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제.
청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제에는 약제학적으로 허용되는 불활성 담체가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제.
청구항 3에 있어서,
상기 불활성 담체는 락토스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제.
청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 황칠나무 잎을 이용한 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제에는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제 및 붕해제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 정제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 캡슐제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제가 함유되는 것을 특징으로 하는 시럽제.
황칠나무 잎을 함수알코올로 추출하여 농축액을 제조하는 농축단계; 및
상기 농축단계에서 얻어진 농축액을 탄소수가 4 내지 10인 알칸류 비극성 용매로 분획하는 분획물제조단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법.
청구항 9에 있어서,
상기 농축단계는 황칠나무 잎을 함수알코올에 투입하고 40 내지 100℃의 온도에서 5 내지 24시간 동안 온탕 또는 환류추출하여 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 추출물을 10 내지 40℃로 냉각한 후에 여과하여 얻어진 여과액의 상층액을 분리한 후에, 분리된 상층액을 증발농축시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법.
청구항 9에 있어서,
상기 농축단계는 황칠나무 잎을 추출용매에 넣고, 4 내지 20℃의 온도에서 5 내지 7일 동안 냉침시켜 황칠나무 잎 추출물을 제조하고, 상기 황칠나무 잎 추출물을 여과한 후에, 여과된 여과액을 증발농축시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법.
삭제
청구항 9에 있어서,
상기 비극성 용매는 노르말 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 잎을 이용한 염증질환 치료용 산화질소 생성효소 단백질 발현 저해제의 추출방법.