KR101650773B1 - 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 발명의 추출물들을 대상으로 한, 실험동물의 비장세포에서 T 세포, B세포의 증식능 반응성 측정실험을 통하여 T 세포와 B 세포 모두 유의적으로 증식능이 감소시킴을 확인하였으며 (실험예 1); 사이토카인(cytokine) 생성수준에 미치는 영향측정 실험에서 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 생성량을 모두 증가시켰으며 (실험예 2); 면역결핍 동물모델에서 간의 산화적 손상에 미치는 영향 측정실험에서 LP-BM5 MuLV의 감염 시 활성산소에 의한 산화적 스트레스를 감소시킴을 확인하였는 바 (실험예 3), 본 발명의 시료들이 강력한 면역증강 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

Description

황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물 {A composition comprising an extract of Dendropanax morbifera for immunomodulating and immunopotentiating activity}

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

[문헌 1] Immunology. 49, 1992; Dig dis Sci. 52, pp 1890-1896, 2007; J Life Sci. 19, pp 479-485, 2009; Biol Pharm Bull. 27, pp 617-620, 2004

[문헌 2] J. Allergy clin immunol. 9, pp 616, 1993; Immunology. 47, pp 75, 1982

[문헌 3] J Korean Soc Food Sci Nutr. 35 pp 1329-1335, 2006;

[문헌 4] J Korean Soc Food Sci Nutr 38, pp 423-429 2009;

[문헌 5] Korean J Plant Res 24, pp 105-112, 2011;

[문헌 6] J Korean Soc Food Sci Nutr 40, pp 379-384, 2011

[문헌 7] Kim H.R., et al.. Chemical characteristics of the leaves and the seeds of Korean Dendropanax (Dendropanax morvifera Lev.). J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 43: 63-66(2000),

[문헌 8] Park S.N., et al.. Cellular antioxidant activity and whitening effects of dendropanax morbifera leaf extracts, 한국미생물생명공학회지, 41(4):407-415,2013

[문헌 9] Ho JN et al., Inhibition of premature death by isothiocyanates through immune restoration in LP-BM5 leukemia retrovirus-infected C57BL/6 mice. Biosci Biotechnol Biochem 75:1234-1239, 2011

[문헌 10] Mosier DE, Animal models for retrovirus-induced immunodeficiency disease. Immunol Invest 15:233-261, 1986

[문헌 11] Powrie F et al., Cytokine regulation of T-cell function: potential for therapeutic intervention. Immunol Today 14:270-274, 1993

[문헌 12] Odeleye OE et al., Changes in hepatic lipid composition after infection by LP-BM5 murine leukemia virus causing murine AIDS. Life Sci 51: 129-134, 1992

[문헌 13] Erdelmeier I. et al., Reactions of N-methyl-2-phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Mechanistic aspects of the colorimetric assay of lipid peroxidation. Chemical Research in Toxicology 11, 11841194, 1998

인체는 항상성을 유지하려고 하는 특징을 가지고 있으며 이는 면역 시스템에서도 작용을 하게 된다. 면역이란 생체가 자기 성분 이외의 물질 등이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체 방어 반응을 의미하며 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 유해물질로부터 신체를 보호하는 방어체계로 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통한 항상성 유지 활동이라고 할 수 있다. 체내 병원균의 유입으로 인해 활성화 되었던 염증 반응을 포함한 모든 면역작용은 병원균의 제거가 이루어지고 나면 정상의 상태로 돌아오게 되지만 면역 조절에 어려움이 있는 경우, 면역 반응이 정상인 사람에 비해 현저히 높거나 낮게 발생한다. 면역기능이 결핍되거나 저하된 상태를 면역부전이라고 하며 이 상태에서는 면역반응이 제대로 활성화되지 못하여 체내의 이물질에 대한 반응을 제대로 못하여 감염을 일으키게 된다. 반대로 면역과민반응은 일부의 면역반응이 과하게 반응하여 면역체계가 불균형을 이루어 결과적으로 알레르기 반응을 일으키는 것이다 (Immunology. 49, 1992; Dig dis Sci. 52, pp 1890-1896, 2007; J Life Sci. 19, pp 479-485, 2009; Biol Pharm Bull. 27, pp 617-620, 2004).

면역 체계가 정상적으로 조절되지 못하고 불균형을 이루게 되면 체내 사이토카인의 불균형, T/B 세포의 증식 불균형, 항산화 영양소 고갈 등의 원인으로 면역 조절에 장애가 발생하여 염증성 물질 분비가 증가하여 세포와 조직에 손상을 입히게 되며 병원체 유입에 대처하지 못하여 염증의 심화가 이루어질 수 있다. 따라서 인체의 면역반응은 균형을 이루어 조절이 정상적으로 되어야 건강을 유지할 수 있으므로 면역 조절 능력은 질병 예방과 치료에 중요시 된다 (J. Allergy clin immunol. 9, pp 616, 1993; Immunology. 47, pp 75, 1982).

LP-BM5 leukemia retrovirus(LP-BM5 MuLV)에 감염된 쥐 AIDS 모델은 사람 AIDS 모델과 유사하게 면역 반응을 유발하는 것으로 알려져 동물모델에서 면역 평가를 위하여 많이 사용된다. AIDS에 감염될 경우 Th1 type cytokines과 Th2 type cytokines의 균형이 파괴되면서 정상적인 면역 반응이 일어나지 않고 면역 시스템이 파괴되어 질병에 대한 면역력을 저하시키게 된다. 또한 활성산소가 과잉 생성되어 산화적 스트레스를 유발하게 되며 DNA 및 세포막, 단백질 등을 손상시켜 암 뿐만 아니라 성인병, 노화를 유발시켜 심하게는 조기사망을 일으킨다는 보고가 있다 (J Korean Soc Food Sci Nutr. 35 pp 1329-1335, 2006; J Korean Soc Food Sci Nutr 38, pp 423-429 2009; Korean J Plant Res 24, pp 105-112, 2011; J Korean Soc Food Sci Nutr 40, pp 379-384, 2011).

우리나라의 남부해안 지역과 제주도 등에서 자생하는 쌍떡잎 식물이며 두릅나무과의 상록교목인 황칠나무(Dendropanax morbifera)는 겨울에도 낙엽이지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠이라고 한다. 황칠나무 추출물의 항암 활성 및 항산화 활성 등의 생리활성은 일부 제한적으로 보고되어 있고, 식품 첨가제 및 건강기능성 보조 식품 등 식품에 이용되고 있다(Kim H.R., et al.. Chemical characteristics of the leaves and the seeds of Korean Dendropanax (Dendropanax morvifera Lev.). J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 43: 63-66(2000), Park S.N., et al.. Cellular antioxidant activity and whitening effects of dendropanax morbifera leaf extracts, 한국미생물생명공학회지, 41(4):407-415,2013).

현재 상기문헌의 어디에도 황칠나무 추출물, 특히 분획물을 통한 면역조절 또는 면역증강 효과에 관한 개시되거나 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자는 면역질환 치료제를 찾고자 천연물에 대한 활성을 조사하던 중 황칠나무 유래 분획물의 뛰어난 면역조절 또는 면역증강 활성을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 황칠나무 추출물은 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 5~100%(v/v) 에탄올, 보다 더 바람직하게는 10~50%(v/v) 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출 분획물을 포함한다.

본원에서 정의되는 황칠나무는 가지, 잎, 뿌리, 등의 전체 부위, 바람직하게는, 가지 또는 뿌리 부위를 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 황칠나무을 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 10~100% 에탄올을 수회 섞은 다음에 30 내지 150℃, 바람직하게는 40 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 10 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 50배, 바람직하게는 0.05 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 에틸아세테이트 용매를 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 에틸아세테이트 용매 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 상기 비극성 용매 가용 추출 분획물을 제거하여 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 각각 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 시료들을 대상으로 한, 실험동물의 비장세포에서 T 세포, B세포의 증식능 반응성 측정실험을 통하여 T 세포와 B 세포 모두 유의적으로 증식능이 감소시킴을 확인하였으며 (실험예 1); 사이토카인(cytokine) 생성수준에 미치는 영향측정 실험에서 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 생성량을 모두 증가시켰으며 (실험예 2); 면역결핍 동물모델에서 간의 산화적 손상에 미치는 영향 측정실험에서 LP-BM5 MuLV의 감염 시 활성산소에 의한 산화적 스트레스를 감소시킴을 확인하였는 바 (실험예 3), 본 발명의 시료들이 강력한 면역증강 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

또한, 황칠나무는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 황칠나무 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능 식품을 제공한다.

본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 목적 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100㎖ 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 추출물은 추출물들을 대상으로 한 실험동물의 비장세포에서 T 세포, B세포의 증식능 반응성 측정실험을 통하여 T 세포와 B 세포 모두 유의적으로 증식능이 감소시킴을 확인하였으며 (실험예 1); 사이토카인(cytokine) 생성수준에 미치는 영향측정 실험에서 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 생성량을 모두 증가시켰으며 (실험예 2); 면역결핍 동물모델에서 간의 산화적 손상에 미치는 영향 측정실험에서 LP-BM5 MuLV의 감염 시 활성산소에 의한 산화적 스트레스를 감소시킴을 확인하였는 바 (실험예 3), 본 발명의 시료들이 강력한 면역증강 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 면역질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

도 1는 황칠나무 추출물을 분리하는 제조공정도이며;
도 2는 황칠나무 추출물 또는 분획물의 비장세포에서 T 세포, B세포의 증식능 반응성에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 3는 황칠나무 추출물 또는 분획물의 IL-2와 IFN-γ 사이토카인(cytokine)의 생성수준에 미치는 영향에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 4는 황칠나무 추출물 또는 분획물의 IL-4, IL-10, TNF- 사이토카인(cytokine)의 생성수준에 미치는 영향에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 5는 황칠나무 추출물 또는 분획물의 면역결핍 동물모델에서 간의 산화적 손상에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 황칠나무 조추출물의 제조

1-1. 에탄올 조추출물의 제조

건조된 황칠나무(함박재) 줄기 (2Kg)을 0.5cm 의 크기로 절단, 분쇄하여 추출용기(Ilshin Lab Co., Ltd, FD8512)에 넣고 에탄올 20 L 및 물 20 L를 각각 가하여 증류순환 장치에서 가열추출 (추출온도는 45~55℃)을 하였고, 여과지(3M paper)로 여과하여 추출물 액상을 얻었다. 기능성분보다 지나친 당 성분이 추출되어 나오는 것을 방지하기 위해 추출은 6시간 1회 수행하였고, 이후 얻어진 추출액 용매를 감압농축기(Sunil EYELA, Rotatory evaporator, N-1N)로 감압 농축하여 96g의 에탄올 추출물을 수득하였다 (이하, "DME"라 함).

1-2. 물 조추출물의 제조

건조된 황칠나무(함박재) 줄기 (2Kg)을 0.5cm 의 크기로 절단, 분쇄하여 추출용기(Ilshin Lab Co., Ltd, FD8512)에 넣고 증류수 20L를 가하여 증류순환 장치에서 가열추출(추출온도는 95~100℃)을 하였고, 여과지(3M paper)로 여과하여 추출물 액상을 얻었다. 기능성분보다 지나친 당 성분이 추출되어 나오는 것을 방지하기 위해 추출은 6시간 1회 수행하였고, 이후 얻어진 추출액 용매를 감압농축기(Sunil EYELA, Rotatory evaporator, N-1N)로 감압 농축하여 138g의 물 추출물을 수득하였다 (이하, "DME"라 함).

실시예 2. 황칠나무 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물의 제조 (도 1 참조)

2-1. 황칠나무 추출물로부터 n- 헥산 분획물의 제조

실시예 1에서 얻은 황칠나무 에탄올 추출물(80g)에 증류수 총 1.6L를 가하여 현탁시킨 후 분획깔때기에 넣고 n-헥산 1.6L를 가하여 분획추출을 수행하였다. 약 1시간 후에 n-헥산 분획 추출된 상등액을 취하여 n-헥산 분획물을 얻었다. 분획 과정은 3회 반복하였고, 이후 상등액을 감압 농축하여 6.8g의 n-헥산 분획물을 수득하였다. (이하, "DMHE"라 함).

2-2. 황칠나무 추출물로부터 에틸아세테이트 분획물의 제조

황칠나무 n-헥산 분획물 수득과정에서 얻은 증류수 분획을 감압 농축한 후에 증류수 총 1.5L를 가하여 현탁시킨 후 분획깔때기에 넣고 에틸아세테이트 1.5L를 가하여 분획추출을 하였다. 약 1시간 후에 에틸아세테이트 분획추출된 상등액을 취하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다. 분획 과정은 3회 반복하였고, 이후 상등액을 감압 농축하여 17.3g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다.(이하, "DMEA"라 함).

2-3. 황칠나무 추출물로부터 n- 부탄올 분획물의 제조

황칠나무 에틸아세테이트 분획물 수득과정에서 얻은 증류수 분획을 감압 농축한 후에 증류수 총 1.2L를 가하여 현탁시킨 후 분획깔때기에 넣고 수포화 n-부탄올 1.2L를 가하여 분획추출을 하였다. 약 1시간 후에 n-부탄올 분획추출된 상등액을 취하여 n-부탄올 분획물을 얻었다. 분획 과정은 3회 반복하였고, 이후 상등액을 감압 농축하여 41.2g의 n-부탄올 분획물을 수득하였다.(이하, "DMBU"라 함).

2-4. 황칠나무 추출물로부터 물 분획물의 제조

황칠나무 n-부탄올 분획물 수득과정에서 얻은 증류수 분획을 감압 농축하여 14.7g의 물 분획물을 수득하였다.(이하, "DMWA"라 함).

실험예 1. 실험동물의 비장세포에서 T 세포, B세포의 증식능 반응성 측정

상기 실시예 시료들의 실험동물의 면역조절에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 용용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Ho JN et al., Inhibition of premature death by isothiocyanates through immune restoration in LP-BM5 leukemia retrovirus-infected C57BL/6 mice. Biosci Biotechnol Biochem 75:1234-1239, 2011).

대한바이오링크 실험동물 사육장으로부터 공급받은 20 g 내외의 4주령 암컷 C57BL/6 마우스를 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23 ± 3℃ 습도 50 ± 5%에서 Light cycle이 12 시간으로 유지하였다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하였다.

면역파괴 유발 동물 모델을 만들기 위하여 마우스에서 면역체계를 무너뜨리는 바이러스인 LP-BM5 MuLV를 SC-1 세포의 배양액으로부터 얻은 뒤, 병원균에 민감한 종류인 C57BL/6 마우스에 복강 내 주사로 2회 주입, 바이러스에 감염시켜 면역을 파괴시켰다 (Ho JN et al., Inhibition of premature death by isothiocyanates through immune restoration in LP-BM5 leukemia retrovirus-infected C57BL/6 mice. Biosci Biotechnol Biochem 75:1234-1239, 2011).

본 실험은 정상대조군, 면역결핍군, 황칠나무 물 추출물 50 mg/kg 투여군 , 황칠나무 에탄올 추출물 50 mg/kg 투여군, 황칠나무 n-헥산 분획물 50 mg/kg 투여군, 황칠나무 에틸아세테이트 분획물 50 mg/kg 투여군, 황칠나무 n-부탄올 분획물 50 mg/kg 투여군, 황칠나무 물 분획물 50 mg/kg 투여군 등 총 8군으로 군당 10 마리씩 구성하여 실험을 진행하였다. 모든 식이는 AIN93G를 기본으로 제작하였으며, 식이와 음수는 자유공급 하였다. 복합물이 함유된 식이를 총 12주 동안 제공한 후 12주 후에 희생시켰다. 모든 시험 동물은 부검 전 24시간 절식시켰다.

동물에서의 비장세포 배양 및 T세포 및 B세포 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 동물에서 분리한 비장은 PBS로 세척한 후 0.45 μm cell strainer(BD Falcon 352340, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 단일 세포 부유액을 만들었다. 단일 세포 부유액을 10% fetal bovine serum(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 2 mmol./L-glutamine(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 100 mg/L penicillin-stereptomycin (Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)를 첨가한 RPMI-1640(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)으로 세척 후 red bllod cell lysing buffer(R7757, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 적혈구를 용혈시켜 비장세포 부유액을 만들어 96 well plate에 각 well 당 1x10⁶ cells/well을 200 μL 씩 분주하였다. T 세포 증식능 측정을 위하여 concanavalin A(ConA)(C0412, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 μg/mL를 처리하였고, B세포 증식능 측정을 위하여 lipopolysaccharide(LPS)(L2880, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 μg/mL를 처리한 후 48시간 동안 37에서 배양하였다. 48시간 후, EZ-Cytox(DLS1212, Deilab INC, Korea)를 20 μL씩 분주하고 4시간 동안 37℃에서 배양시킨 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험 결과, 면역 결핍쥐(T 세포: 2.4 ± 0.4 10*3 cpm, B 세포: 3.1±0.4 10*3 cpm)는 정상쥐(T 세포: 7.8±0.5 10*3 cpm, B 세포: 6.3±0.7 10*3 cpm)와 비교하여 유의적으로 T 세포와 B 세포 모두 유의적으로 증식능이 감소되었음을 확인하였다(P<0.05). 반면 에탄올 추출물(T 세포: 3.9±0.4 10*3 cpm, B 세포: 3.710*3 cpm)과 에틸아세테이트 분획물(T 세포: 5.610*3 cpm, B 세포: 5.210*3 cpm) 투여군에서는 면역결핍쥐군과 비교하여 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(P<0.05). n-부탄올 분획물 투여군에서는(T 세포: 3.5±0.3 10*3 cpm, B 세포: 3.910*3 cpm) T 세포 증식능만 유의적으로 증가되었다(P<0.05)(도 2).

따라서 황칠나무의 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 LP-BM5 MuLV 감염으로 감소된 T 세포와 B 세포의 증식능을 억제하여 면역조절에 긍정적인 효능을 미쳤음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 사이토카인 생성 측정실험

상기 실시예 시료들의 사이토카인(cytokine) 생성수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 용용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Mosier DE, Animal models for retrovirus-induced immunodeficiency disease. Immunol Invest 15:233-261, 1986).

실험예 1의 실험동물을 부검 후 사이토카인(cytokine) 생성수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 비장세포를 96 well plate에 각 well당 1×10⁶ cells/well을 200 μL 씩 분주 후, ConA(C0412, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 μg/mL를 처리하여 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γγ의 생성을 자극시켰고, LPS(L2880, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 μg/mL를 처리하여 TNF-a의 생성을 자극시켰다. IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a는 24시간 배양 후에, IFN-γγ은 72시간 배양 후에 상층액을 수집하였다. 상층액의 사이토카인(cytokine)의 양은 DuoSet sandwich ELISA mouse kit(R&D System, McKinley Place NE, MN, USA)를 이용하여 측정하였다. ELISA용 96-well plate에 각 cytokine 측정에 특성화 된 1차 항체를 PBS에 희석 후 100 μL씩 분주해 하루 동안 처리한 후, 그 다음날, washing buffer (R&D System, McKinley Place NE, MN, USA), PBST, 0.05% Tween 20 in PBS)로 1차 항체를 씻어낸 뒤, 항체가 붙지 않은 plate의 다른 공간을 메워주기 위해 assay buffer (R&D System, McKinley Place NE, MN, USA) 1% BSA in PBS (IL-4, -10, TNF-a) 또는 0.1% BSA in TBST (IL-2, IFN-γγ)를 넣어 2시간 동안 처리한 뒤 washing buffer로 씻어낸다. Standard curve를 위한 용액과 위에서 seeding한 비장세포의 배양액을 100 μL씩 각 well에 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 반응이 끝난 뒤 washing buffer로 씻어내고 assay buffer에 2차 항체를 희석시켜 준비한 뒤 각 well에 100 μL씩 분주하고 2시간 동안 처리한다. 이 과정이 끝나면 washing buffer를 이용해 plate를 씻어내고 발색을 도와주는 substrate시약(R&D System, McKinley Place NE, MN, USA) 을 100 μL씩 넣어 반응 시킨 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하고 Standard curve를 이용해 세포에서 생성된 cytokine의 양을 계산했다.

CD4+ Th 세포에는 Th1 type cytokines을 생성하는 Th1 세포와 Th2 type cytokines을 생성하는 Th2 세포가 있다. Th1 type cytokines은 주로 대식세포의 활성을 증가시켜 탐식작용을 자극하며, Th2 type cytokines은 B 세포의 활성을 자극시켜 항체생산을 증가시키는 역할을 한다. 이러한 Th1/Th2 type cytokines의 상호보완적인 조절에 의하여 면역 균형을 유지시키는데 LP-BM5 MuLV감염에서는 Th1 type cytokines을 감소되어있고 Th2 type cytokines을 증가되어 있다고 보고되고 있다 (Powrie F et al., Cytokine regulation of T-cell function: potential for therapeutic intervention. Immunol Today 14:270-274, 1993).

상기 실험 결과, Th1 type cytokines인 IL-2와 IFN-γγ의 생성을 비교하였을 때 정상군(IL-2: 148 ± 18 pg/mL, IFN-γγ: 186 ± 12 pg/mL)에 비하여 면역결핍쥐(IL-2: 42 ± 10 pg/mL, IFN-γγ: 68 ± 11 pg/mL)에서 유의적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05). 반면 면역결핍쥐군과 비교하였을 때, 에탄올추출물군(IL-2: 84 ± 8 pg/mL, IFN-γ: 98 ± 8pg/mL)와 에틸아세테이트 분획물군(IL-2: 108 ± 11 pg/mL, IFN-γ: 143 ± 13 pg/mL)에서 유의적으로 IL-2와 IFN-γ의 생성량이 모두 유의적으로 증가하였다(P<0.05). n-부탄올 분획물군(IL-2: 64 ± 7 pg/mL, IFN-γ: 77 ± 9 pg/mL)에서는 IL-2의 생성량만 유의적으로 증가하였다(P<0.05)(도 3).

또한 정상대조군(IL-4: 64 ± 11 pg/mL, IL-10: 89 ± 9 pg/mL, TNF-α: 49 ± 7pg/mL)과 비교하여 면역결핍쥐(IL-4: 187 ± 18 pg/mL, IL-10: 224 ± 13 pg/mL, TNF-α: 348 ± 29 pg/mL)에서 Th2 type cytokines인 IL-4, IL-10, TNF-α 모두 생성량이 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(P<0.05). 이러한 결과는 Th1 type cytokines의 감소와 연관시켜 보았을 때 LP-BM5 MuLV감염이 Th1/Th2 type cytokines불균형을 일으킨 것을 확인할 수 있는 것이다. 면역결핍에 의하여 증가된 사이토카인은 에탄올추출물(IL-4: 141 ± 13 pg/mL, IL-10: 189 ± 22 pg/mL, TNF-α: 240 ± 15 pg/mL), 에틸아세테이트 분획물(IL-4: 108 ± 17 pg/mL, IL-10: 147 ± 21 pg/mL, TNF-α: 189 ± 14 pg/mL), n-부탄올 분획물(IL-4: 144 ± 12 pg/mL, IL-10: 183 ± 17 pg/mL, TNF-α: 269 ± 9 pg/mL)을 투여한 군에서 유의적으로 생성량이 감소되었다(P<0.05).

이러한 Th2 type cytokines 감소 결과는 Th1 type cytokines 감소를 억제시킴으로서, Th1/Th2의 불균형을 감소시켜 면역 항상성 유지에 도움을 주는 것으로 해석된다.

실험예 3. 간의 산화적 손상 측정

상기 실시예 시료들이 면역결핍 동물모델에서 간의 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 용용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Odeleye OE et al., Changes in hepatic lipid composition after infection by LP-BM5 murine leukemia virus causing murine AIDS. Life Sci 51: 129-134, 1992).

산화적 스트레스에 의한 지질과산화 생성을 측정하기 위하여 Erdelmeier법(Erdelmeier I. et al., Reactions of N-methyl-2-phenylindole with malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals. Mechanistic aspects of the colorimetric assay of lipid peroxidation. Chemical Research in Toxicology 11, 11841194, 1998)을 사용하여 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)를 측정함으로써 산화적 손상을 관찰하였다. 간 조직을 절취하여 tris-HCl buffer(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 균질화시켜 12,000 rpm에서 20분간 원심분리기(micro 17R, Hanil, Korea)에서 원심분리(centrifuge) 시킨 후 그 상등액을 300 μL 취하였다. 그 상등액에 동량의 TCA(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 처리하여 원심분리 후 상등액을 취하여 2-thiobarbituric acid(TBA)(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 500 μL를 넣어 반응하도록 95℃에서 20분간 가열시켰다. TBA 반응산물을 532 nm에서 흡광도를 측정하여 그 값을 정상군을 100%로 잡아 표기하였다.

LP-BM5 MuLV의 감염 시 활성산소에 의한 산화적 스트레스가 급격히 증가하는 것으로 알려져 있으며 이로 인하여 간세포의 염증이 유발되고 지방간 등의 간질환이 일어나는 것으로 알려져 있다(Odeleye OE et al., Changes in hepatic lipid composition after infection by LP-BM5 murine leukemia virus causing murine AIDS. Life Sci 51: 129-134, 1992). 정상대조군에서 100 ± 9.8 %를 나타낸 산화적 손상이 면역결핍쥐군에서는 284 ± 24.7 %으로 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(P<0.05). 하지만 에탄올추출물군에서 223 ± 17.9 %, 에틸아세테이트 분획물에서 164 ± 19.7 U/mL, n-부탄올 분획물은 208 ± 11.2%으로 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(P<0.05)(도 5).

따라서 본 연구의 결과에 의하여 면역결핍 동물모델에서 황칠나무의 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물이 림프구 증식능을 증가시키고, 사이토카인 불균형 및 간의 산화적 손상을 감소시켰음을 관찰하였다. 따라서 황칠나무는 국내 면역조절제 소재로서의 활용을 기대 할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

DME ------------------------------------------------ 300 mg

유당수화물 ----------------------------------------- 100 mg

탤크 ------------------------------------------------ 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

DMW ----------------------------------------------- 300 mg

옥수수전분 ---------------------------------------- 100 mg

유당수화물 ---------------------------------------- 100 mg

스테아르산 마그네슘 --------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

DMHE ---------------------------------------------- 300 mg

미결정셀룰로오스 ------------------------------------ 3 mg

유당수화물 --------------------------------------- 14.8 mg

스테아르산 마그네슘 ------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

DMEA ---------------------------------------------- 300 mg

디-만니톨 ----------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O ---------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

DMBU ---------------------------------------------- 300 mg

이성화당 -------------------------------------------- 10 g

디-만니톨 -------------------------------------------- 5 g

정제수 ---------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

DMWA --------------------------------------------- 1000 mg

비타민 혼합물 --------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 -------------------------------- 70 ug

비타민 E ------------------------------------------ 1.0 mg

비타민 B₁ ---------------------------------------- 0.13 mg

비타민B₂ ------------------------------------------ 0.15 mg

비타민B₆ ------------------------------------------- 0.5 mg

비타민B₁₂ ------------------------------------------ 0.2 mg

비타민 C ------------------------------------------- 10 mg

비오틴 --------------------------------------------- 10 ug

니코틴산아미드 ------------------------------------ 1.7 mg

엽산 ----------------------------------------------- 50 ug

판토텐산 칼슘 ------------------------------------- 0.5 mg

무기질 혼합물 --------------------------------------- 적량

황산제1철 ---------------------------------------- 1.75 mg

산화아연 ----------------------------------------- 0.82 mg

탄산마그네슘 ------------------------------------- 25.3 mg

제1인산칼륨 ---------------------------------------- 15 mg

제2인산칼슘 ---------------------------------------- 55 mg

구연산칼륨 ----------------------------------------- 90 mg

탄산칼슘 ------------------------------------------ 100 mg

염화마그네슘 ------------------------------------- 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

DMEA ---------------------------------------------- 300 mg

비타민 C -------------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) ------------------------------------- 100 g

젖산철 ------------------------------------------- 19.75 g

산화아연 ------------------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 ------------------------------------- 3.5 g

비타민 A ------------------------------------------- 0.2 g

비타민 B₁ ----------------------------------------- 0.25 g

비타민 B₂ ------------------------------------------ 0.3 g

물 -------------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (8)

1. 황칠나무 줄기의 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제하여 수득한 에틸아세테이트에 가용한 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 황칠나무 줄기의 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물로부터 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물만을 정제하여 수득한 에틸아세테이트에 가용한 추출 분획물을 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능식품.
8. 제 7항에 있어서
   상기 건강기능식품은 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강기능성 식품류 형태인 건강기능식품.

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